Name: 大動脈リング共培養アッセイ:体外間葉系間質細胞の血管新生の可能性を評価するために便利なツール (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 学ぶ大動脈リング共培養アッセイによる間葉系間質細胞の血管新生能評価法。ラット大動脈由来内皮ネットワークとの相互作用を可視化し、再生医療における細胞治療候補の効率と作用機序を定量的に解析する有用なツールです。

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著者らは次のスタッフ メンバーに感謝し、研究の人員: Andrée ゴーティエ ・ フィッシャー、マシュー Librach、ターニャ · バレット、Tharsan Velauthapillai、サラ Laronde。

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</ol>

博士クリフォード ・ l ・ Librach は、特許の共同保有者:最初の学期臍帯組織由来細胞の分離とファージのメソッド。カナダとオーストラリアで与えられます。

成功した大動脈リング アッセイ MSC の培養実験を設定するのにはいくつかの重要な段階があります。まず、最も重要なステップを分離し、大動脈を切断するときは、: 1) 大動脈; の胸部のセグメントのみを取得2) 慎重に分岐血管、結合および脂肪組織を削除して。3) 切削各測定間変動を制限する大動脈 (~ 1 mm) のセクションでさえ。第二に、大動脈リングの BME へ埋め込み成功は、この試金のため重要です。BME が完全に重合または均等に重合した場合、BME に埋め込まれた大動脈リングは内皮の発芽を開始することはできませんまたは不連続な内皮細胞ネットワークを開発可能性があります。BME 重合が十分ではない場合、アッセイは、定量化の信頼性がありません。第三に、完全な内皮因子濃縮のメディアが発芽を開始する大動脈のリングのための栄養を提供するために必要です。大動脈リング リングは、容器が発芽を開始した後、次の重要な今後のステップはテストするセルの種類を含みます。このため、MSCs は正常に事前に染色されたおよび発芽の大動脈リングを管理すること必要があります。このセクションの 2 つの重要な手順があります。1) 播種のための適切な日付を選択する:...

血管新生の複雑なプロセスを向上させるし、既存の血管1から新しい血容器開発を促進することによって組織の灌流を維持します。それプロ血管新生と血管新生因子によって厳しく規制された、バランスの取れたプロセスです。このシステムの不備不足容器メンテナンスや成長、心筋疾患、脳卒中、神経変性疾患など重篤な虚血性疾患を引き起こす可能性があります。しかし、誇張された血管の開発は、がんや炎症性疾患2などの条件のための特徴です。
有利な組織の再生を達成するために血管新生を制御することを目指す治療法の開発は、重要です。広汎な前臨床および臨床調査にもかかわらずプロ血管新生因子とマイクロ Rna を用いた血管新生を刺激する試みは、望ましい結果3,4,5を達成するために失敗しました。一時的な効果のある可能性があります: 血管新生タンパク質と核酸、有限数の限られた寿命は成長因子6,7を対象とします。可溶性血管新生因子が血管新生を開始するために不可欠であるメンテナンスや血管の機能サポートするペリサイトおよび平滑筋細胞8を含むセルの種類に依存します。プロ血管新生療法の分野は、血管、さらに差別化の自己更新または物理的に新しくサポート開発中血管新生因子、ローカルを提供可能性があります潜在的な幹細胞と前駆細胞源を模索しています。血管内皮細胞 -9,10。これらの機能の要件を満たすために機能を備えた携帯型最適な血管新生を見つける虚血組織再生のための大きい約束を保持します。
潜在的な細胞ベースの治療法を臨床試験に正常に訳し、前臨床試験の有効性を実証し、血管新生機構の解明を強調表示する必要があります。確立された血管新生アッセイの数が多いにもかかわらず、フィールドは確実に潜在的な候補のセル型11,12,の有効性を評価できる「ゴールド スタンダード」の in vitroアッセイを欠いている13. ほとんどの in vitro血管新生アッセイ (内皮細胞の増殖, 移行および管の形成アッセイを含む) 通常内皮細胞表現型変化や分化細胞や化合物の効果の評価鋼管およびネットワーク構造14,15。これらの機能は血管新生に重要な「翻訳」アッセイも評価: 1) 豊胸術や血管や平滑筋細胞、2) ECM や基底膜の処理を含むサポートのセル型の交換と 3)。機能的な血管の形成を促進する効率。角膜アッセイ、マトリゲル プラグ アッセイを含む血管新生モデル生体内でユニークな生体内の微小環境を再現が追跡管理セルの難易度物理的な相互作用の観察に挑戦しています。さらに、生体内でモデル、潜在的な同種細胞療法の候補者16のテスト中 xeno 免疫拒絶反応が行われます。特に大動脈リング分析を提供できる血管新生モデル前のヴィヴォ: 1) 簡単に観察、3) ECM ホストや人工の電源で 4) 炎症性の排除 2) アクセサリー支持細胞管状構造の定量化コンポーネント、および 5) 迅速かつ安価なセットアップ17,18。通常、大動脈リング アッセイは、小さな分泌蛋白質、薬理学的エージェント、およびトランスジェニック齧歯類モデル19,20,21の血管新生可能性をテストできます。
MSCs は、その傍分泌を介する効果22,23,24を通じて主に血管再生医療の有望な候補です。MSCs は、血管内皮増殖因子 (VEGF)、肝細胞増殖因子 (HGF) を含む主要血管新生因子を分泌する示されているインスリン様成長因子 1 (IGF-1)、基本的な線維芽細胞成長因子 (bFGF) と angiopoeitin-1 (Ang-1)25 ,26。また、MSCs を検出することができ、虚血性または炎症に家組織、ただし、厳密なメカニズムはまだ調査中では。ますます、文献はほとんど MSCs 血管周囲細胞から生じるし、共同周皮細胞マーカーを表現し、ペリサイト27のように振る舞うことができる仮説をサポートします。HUCPVCs は、若いひと臍帯の血管領域から派生した MSCs の源です。彼らは、周皮細胞のような性質を持つ MSCs の人口を表し、FTM と用語のへその緒から特徴づけられています。FTM の HUCPVCs は CD146 と NG2、高い増殖能とポテンシャルの免疫特権プロパティを含む周皮細胞マーカーの高発現を示す、堅牢なパラクリン プロファイル28を表示します。FTM の HUCPVCs は、新しい血管周皮細胞のようなプロパティを介しての推進により負傷した組織の再生を促進するための理想的な候補者セル型です。
血管新生の可能性と人間の MSCs の周皮細胞のような性質をテストするのには血管新生アッセイの非常に限られた数が肯定的な利用可能な angiotropic 移行 (以下「ホーミング」という)、ECM 処理、および物理的な開発細胞のタイプ間の相互作用は、血管の開発に関する定量的データを取得しながら調べることができます。
ここ大動脈リング試金の新規アプリケーションを記述するプロトコルを提案する.人間の MSCs は発展途上ラット由来大動脈内皮細胞ネットワークとチューブの形成、成熟および恒常性への貢献を評価するために共培養.このバージョン大動脈リング アッセイの評価能力とホーム新生のサイトに実行し ECM 処理を仲介し、周皮細胞のような物理の確立を通じて内皮の管状の発展に貢献する細胞療法候補者の効能相互作用。培養内皮細胞ネットワーク形成の MSCs の純効果の定量化、細胞間の相互作用を観察することに加え、我々 はまた MSCs を共培養から分離するためのプロトコルを最適化されています。フローサイトメトリーと qPCR を実行、次の共培養 MSC の表現型と遺伝子発現の変化を特徴づけることが可能です。モデル セル型として発生初期と比較した (胎児期) と人間の MSCs の後半 (大人) ソース: FTM HUCPVCs とひと骨髄由来 MSCs (ボーマン)、大動脈リング アッセイで、それぞれ。とき血管再生への応用の検討の下で任意の物理的にサポートのセル型の血管新生の可能性を研究する大動脈リング試金を使用することができることを提案します。

<table><tbody><tr><td>Alpha-MEM</td><td>Gibco</td><td>12571071</td><td>FTM HUCPVC および BMSC 培養培地用。</td></tr><tr><td>APC共役反ヒトTRA-1-85</td><td>R&Dシステム</td><td>FAB3195A</td><td>フローサイトメトリーおよび細胞選別用のヒト特異的細胞マーカー</td></tr><tr><td>基底膜抽出物(BME)(マトリゲル)</td><td>コーニング</td><td>354234</td><td>大動脈埋め込み用</td></tr><tr><td>弾丸キット</td><td>ロンザ</td><td>CC-3162</td><td>含まれるもの: ゲンタマイシン/アムホテリシン-B (GA)ヒト表皮 成長因子 (hEGF);血管 内皮成長因子(VEGF);R3- インスリン様成長因子-1(R3-IGF-1); アスコルビン酸;ヒドロコルチゾン; ヒト線維芽細胞成長因子-ベータ (hFGF-&β;);ヘパリン;ウシ胎児血清 (FBS)。EGM</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA Dye</td><td>Thermo-fisher</td><td>C2925</td><td>MSCsの染色には、MSCによって緑色が最適にピックアップされます</td></tr><tr><td>CKX53 培養顕微鏡</td><td>Olympus</td><td></td><td>内皮ネットワーク開発の明視野イメージングに</td></tr><tr><td>Countess automated cell counter</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td>MSC培養、フローサイトメトリー、qPCR</td></tr><tr><td>ディスパーゼ</td><td>のための細胞計数StemCell技術</td><td>7923</td><td>解離性大動脈環-MSC共培養用(37°C;C)</td></tr><tr><td>使い捨て滅菌メス</td><td>VWR</td><td>21909-654</td> 大<td>動脈</td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>PBS. 1X, 塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムなし</td></tr><tr><td>内皮基礎培地(EBM)</td><td>ロンザ</td><td>CC-3156</td><td>大動脈リングアッセイ-MSC共培養の培養に必要な基礎培地(37°C;C使用前)。EGMおよびEBM-FBSに必要</td></tr><tr><td>エタノール、70%、バイオテクノロジーグレード</td><td>VWR</td><td>97064-768</td><td>表面を滅菌するには</td></tr><tr><td>EVOS</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>MSCの移動と統合を追跡するための社内蛍光顕微鏡</td></tr> ウ<tr><td>シ胎児血清(FBS)(ハイクロン)</td><td>GEヘルスケア</td><td>SH3039603</td><td>細胞培養培地の血清成分</td></tr><tr><td>FITC標識抗CD31抗体</td><td>BD</td><td>558068</td><td>フローサイトメトリー用ヒト内皮マーカー</td></tr><tr><td>FITC-conjugated anti-CD146antibody</td><td>BD</td><td>560846</td><td>フローサイトメトリー用ヒト周皮マーカー</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>Almedic</td><td>7727-A10-704</td><td>ラット組織をハンドリング用。任意の同様の鉗子を使用することができます</td></tr><tr><td>ハンクの平衡塩溶液 (HBSS)</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 14175-094</td><td>1X 塩化カルシウムと塩化マグネシウムなし</td></tr><tr><td>HERAcell 150i CO2インキュベーター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>51026410</td><td>細胞のインキュベーション用</td></tr><tr><td>ヒト血管新生RT2プロファイラー PCRアレイ</td><td>Qiagen</td><td>PAHS-024Z</td><td>ヒト特異的で、血管新生に関与する84の遺伝子のプライマーが含まれています。各ウェルは1プライマー反応</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>オープンソースの画像処理ソフトウェアです。血管新生アナライザープラグイン</td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD</td><td></td><td>UHN SickKids FC Facilityが必要です。フローサイトメトリー用。</td></tr><tr><td>MoFlo Astrios</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>UHN SickKids FC施設。細胞の選別用。</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>バッファーおよび細胞培養培地への抗生物質成分</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>RNA精製用。細胞溶解バッファーを含む</td></tr><tr><td>RT2Easy First Strand Kit</td><td>Qiagen</td><td>330421</td><td>qPCR用cDNAの調製用</td></tr><tr><td>RT2PreAMP cDNA合成キット</td><td>Qiagen</td><td>330451</td><td>低収量RNAの場合のcDNAの事前増幅</td></tr><tr><td>外科用ハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14059-11</td><td>皮膚、筋肉、大動脈の切断用</td></tr><tr><td>滅菌ガーゼ</td><td>VWR</td><td>3084</td>胸<td>部の毛皮を湿らせて滅菌するには</td></tr>、<tr><td>TrypleE</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12605036</td><td>MSC解離酵素を37°Cで予温します。C</td></tr><tr><td>0.2 &mu;m 細孔濾過ユニット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>566-0020</td><td>組織培養培地を滅菌するには</td></tr><tr><td>0.25% トリプシン/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>細胞解離のために、37°Cで予温;C</td></tr><tr><td>10 cm 組織培養皿</td><td>Corning</td><td>25382-428</td><td>大動脈およびMSC細胞培養の洗浄および切片化用</td></tr><tr><td>12ウェル細胞培養プレート</td><td>Corning-Sigma Aldrich</td><td>CLS3513</td><td>大動脈リングアッセイ-MSC共培養のセットアップ用</td></tr><tr><td>15mLチューブ</td><td>BDファルコン</td><td>352096</td><td>一般的な組織培養手順用</td></tr><tr><td>70 &mu;m細胞ストレーナー</td><td>フィッシャーブランド</td><td>22363548</td><td>フローサイトメトリーまたはソーティングの前に単一細胞懸濁液を確保するため</td></tr></tbody></table>

大動脈リング共培養アッセイ:体外間葉系間質細胞の血管新生の可能性を評価するために便利なツール

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

血管新生は複雑で規制の厳しいプロセスを提供し、適切な組織灌流を維持する役割を担います。十分な血管のメンテナンスおよび病理学的奇形は、過度に豊富な血管新生は癌や炎症性疾患に関連付けられている重篤な虚血性疾患の起因できます。プロ血管新生療法の有望なフォームは、血管を新しく開発するため規制の要因だけでなく、物理的なサポートを提供することができます血管新生細胞源の使用です。
間葉系間質細胞 (MSCs) は、虚血や炎症を起こしている組織に家を検出してそのパラクライン効果と自分の能力のための血管再生のため広範囲調査候補です。特に、最初の学期はひと臍帯血管周囲細胞 (FTM HUCPVCs) の周皮細胞のような性質、高い増殖能とポテンシャル、免疫特権プロパティ、および堅牢なパラクリンのための非常に有望な候補者プロファイル。潜在的血管新生細胞を効果的に評価、信頼性の高いにそれらと「翻訳」の前臨床アッセイをテストする前提条件です。大動脈リング アッセイは管状の内皮構造の簡単な定量化を可能、ホストからアクセサリー支持細胞と細胞外マトリックス (ECM) を提供します、炎症性成分を除外、 ex vivo血管新生モデル高速かつ安価で設定します。これは生体内でモデル (例えば、角膜の試金、マトリゲル プラグ法) と比較されたとき有利です。大動脈リング アッセイは、投与細胞を追跡し、異種免疫拒絶反応を回避しながら細胞間の相互作用を観察できます。
応用発展途上ラット大動脈内皮細胞ネットワークとの共培養でヒト MSCs を含む大動脈リングの試金のためのプロトコルを提案します。この試金は、チューブの形成と物理的周皮細胞のような相互作用を開発する MSC の貢献とその効力積極的に血管新生のサイトに移行するため、実行して仲介する能力を評価するための分析ECM の処理。このプロトコルは、次の共培養 MSC の表現型と遺伝子発現の変化に関するさらに詳しい情報を提供します。

大動脈リング/MSC 共培養法を確立するための作業フローの図は、図 1に示されています。主な手順を含める: ラット大動脈隔離区分し大動脈リングの埋め込み、監視内皮発芽およびネットワークの開発と最後にラベリング、MSCs を管理します。内皮細胞ネットワーク解析のタイムライン共培養期間ごとに実行可能な解析のウィンドウの概要: 日 1、5 &#38; 7。追記は、点線のボックスで強調表示されます。
大動脈リング培養内皮細胞の構造的に異なる領域の同定は、明るいフィールド顕微鏡検査、大動脈リングは ECM (図 2) に埋め込まれた後の 3-5 d によって実行されます。非構造化領域 (図 2 a) は、高い細胞増殖が大動脈組織の直接の近傍で低構造組織の地域として特徴付けられます。開発...

ここでは、prelabelled の間葉系細胞がラット大動脈由来血管内皮ネットワークとの共培養して大動脈リング測定の新たな応用を提示します。この手法では、間葉系間質細胞 (MSCs) ホーミングと内皮細胞ネットワークとの統合の可視化、ネットワークのプロパティの定量化と MSC immunophenotypes と遺伝子発現の評価をことができます。

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

この前臨床機能アッセイの全体的な目的は、再生医療に用いられる間葉系幹細胞の血管新生能を観察し、定量的に評価することです。この手法は、作用機序や細胞治療候補の効率など、血管標的再生医療分野における重要な疑問への回答に役立ちます。本手法の主な利点は、in vitroアッセイのような制御しやすさと評価の容易さを維持しつつ、in vivo環境の重要な要素を提供できる点にあります。この新規技術の意義は、虚血性疾患の細胞療法へと広がります。なぜなら、この分野では信頼性が高く使いやすい機能解析アッセイが切実に求められているためです。本手順の実演は、私の研究室の博士課程学生であるFarwah Iqbalと、研究員であるPeter Szarazが行います。ラットの大動脈を単離し、テキストプロトコルに従って培地を調製した後、まずプレートをアイスパックなどの冷たい面に置いて、12ウェル組織培養プレートをコーティングします。冷却ピペットを使用し、プレートの各ウェルに、解凍直後の基底膜抽出物（BME）を200 µLずつ加えます。次に、BMEの不均一な重合を防ぐため、BMEを素早く回転させ、均一にコーティングします。コーティングしたプレートを加湿インキュベーターに入れ、30分間静置します。1,000 µLピペットチップを-20 °Cのフリーザーに戻します。残留組織によるリングユニット間のばらつきを抑えるため、大動脈を10 mLの新鮮なHBSSを入れた10 cmディッシュに入れ、2組のピンセットを使用して過剰な結合組織および脂肪組織を注意深く取り除きます。外科用ハサミを用いて、大動脈に接続している肋間動脈の残りの分枝を切り離し、大動脈内部の残留凝血を除去します。10 centimeterのディッシュの下に定規またはグリッドを配置し、滅菌済みのメスとピンセットを使用して、大動脈を1～2 millimeter幅のセクションに精密に切断します。インキュベーターからBMEコート済みプレートを取り出した後、大動脈リングをBMEに埋め込むために、ピンセットで個々の大動脈リングを慎重に拾い上げ、BMEコートされたウェルの中心に配置します。冷却した1, 000 microliterピペットチップを使用して、各大動脈リングの上に300 microlitersのBMEを加え、ウェル内のBMEを均一に分散させます。すべての主動脈リングの埋没が完了したら、加湿インキュベーターに戻して30分間静置します。次に、インキュベーション後、あらかじめ調製した血管内皮細胞増殖培地（EGM）1,000 µLを、ピペットチップを培養ウェルの壁面に沿わせながらゆっくりと注入します。その後、組織を24時間インキュベートします。48時間ごとにFBS含有EGMで培地を交換しながら、明視野顕微鏡を用いて大動脈リング内皮ネットワークの発達

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学ぶ大動脈リング共培養アッセイによる間葉系間質細胞の血管新生能評価法。ラット大動脈由来内皮ネットワークとの相互作用を可視化し、再生医療における細胞治療候補の効率と作用機序を定量的に解析する有用なツールです。

大動脈リング共培養アッセイ:体外間葉系間質細胞の血管新生の可能性を評価するために便利なツール

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