巨大リポソームの膜カーボンナノ チューブを引っ張ってください。
2017年12月7日
多くのタンパク質の細胞感覚し、膜の曲率を誘発します。湾曲した膜体外タンパク質または任意曲率活性分子の相互作用を研究する脂質小胞から膜ナノチューブをプルする方法について述べる。
このナノチューブ引き抜き法の全体的な目標は、目的の特定のタンパク質と高度に湾曲した膜との間の相互作用を定量的に研究することです。この方法は、エンドサイトーシスや細胞内輸送など、細胞膜の生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術により、タンパク質がどのように湾曲した膜に結合し、それらを相互に変形させるかを直接定量化することができます。
当初、この方法は脂質膜の基本的な機械的特性を測定するために使用されていました。最近では、タンパク質膜相互作用、特にタンパク質形成膜の重要なメカニズムを解明するために応用されています。まず、電気形成チャンバーの白金線から直接巨大な単層小胞を採取します。
実験チャンバーを構築するには、金属製のベースに1mm間隔で2つの長方形のガラスカバーを置き、ガラスマイクロピペットの先端が少なくともチャンバーの中心に到達するのに十分な大きさの開口部を長辺に沿って残します。実験チャンバーとガラスマイクロピペットの両方に、気泡を避けながら、高純度のβ-カゼイン溶液を1ミリリットルあたり5ミリグラムで満たします。チャンバーが不動態化されている間に、対物レンズの中央にある光学顕微鏡に取り付け、吸引マイクロピペットの先端を長辺に沿った開口部を通して、先端が対物レンズより上に来るまで挿入します。
吸引圧力がゼロに近づくように水タンクのレベルを調整し、適切な実験濃度で実験バッファーに溶解した目的分子を注入マイクロピペットに充填します。インジェクションマイクロピペットをマイクロマニピュレーター内に取り付け、実験チャンバーの反対側からマイクロピペットを挿入します。インキュベーションの終了時に、ベータカゼイン溶液をチャンバーから取り出し、実験バッファーでチャンバーを数回すすぎます。
次に、数マイクロリットルの小胞溶液をチャンバーに加え、続いて数マイクロリットルのストレプトアビジン被覆ビーズを、最終濃度が10の0.1倍になり、体積あたりのビーズ率がマイナス3%以下になるようにします。小胞とビーズがチャンバーの底に落ち着いたら、実験用緩衝液を約15分間蒸発させ、その時点で小胞が光学顕微鏡下で目に見えて波打つはずです。小胞が適切にフロッピーになったら、ピペット内の膜の長さがピペットの半径以上になるまで、個々の小胞をマイクロピペットに吸引します。
適切なサイズの吸引舌が特定されたら、チャンバーの開放端を鉱物油で密封します。吸引圧力のゼロ位置を設定するには、吸引ピペットの端をビーズの近くに置き、ビードがピペットに吸い込まれたり吹き飛ばされたりしないように水タンクの高さを調整します。水の高さを調整することは、マイクロピペットで吸引される小胞の膜張力を制御するために重要です。
小胞を吸引し、マイクロピペットを壊さずにマイクロピペットを上に移動して焦点を合わせないようにします。光ピンセットを使用して、チャンバーの底から約20マイクロメートル離れた場所にビーズをトラップします。小胞をビーズから離れて焦点を合わせ、光学トラップと位置合わせし、ビーズの動きを1〜2分間記録して平衡位置を測定します。
マイクロピペット内の圧力をできるだけ下げて小胞を失わずに膜の張力を下げ、小胞をビーズに約1秒間慎重に接触させてストレプトアビジン-ビオチン結合を確立します。次に、ピエゾアクチュエータを使用して、小胞をゆっくりと引き戻してナノチューブを作成します。吸引圧力を上げて吸引舌を再現し、チューブを吸引ピペットの軸内に位置合わせします。
チューブと小胞に完全に焦点を合わせ、30ヘルツの取得速度でのビーズの動きとゼロ位置に対する水タンクの高さを明視野顕微鏡で数分間記録します。すべての画像を取得したら、異なる吸引圧力と膜張力でのビーズの動きを再度記録します。目的のタンパク質または分子を注入するには、光学トラップ内のビーズが乱されないように注意しながら、注入マイクロピペットをナノチューブの近くに持ってきて、1〜2パスカルの圧力でタンパク質を穏やかに注入します。
タンパク質の結合が平衡化した後、裸の膜で示されたように、添加したタンパク質の存在下で段階的な測定を繰り返します。100%DOPC小胞から引き出されたナノチューブの力と半径の測定は、光トラップ内のビーズの変位と蛍光強度からの半径から測定されるため、膜の曲げ剛性を計算する2つの方法を提供します。BARまたはカリウムチャネルタンパク質が、その下にある小胞上の膜チューブ上で相対的に濃縮されていることは、タンパク質が湾曲した膜に結合する可能性が高いことを示しています。
実際、N-BARタンパク質のエンドフィリンA2がメンブレンに結合すると、チューブの力が徐々にゼロになり、チューブを安定に保つ3次元の足場が形成されることを示しています。この手順に続いて、例えば、膜チューブ上のタンパク質組織を検出するための高解像度顕微鏡法や、タンパク質移動度を測定するための単一粒子追跡など、他の技術を組み合わせて追加の質問に答えることができます。
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概要
本研究では、in vitroでタンパク質と曲率を持つ膜との相互作用を調査するため、脂質小胞から膜ナノチューブを引き出す手法を紹介します。このアプローチにより、これらの膜へのタンパク質の結合量や機械的特性の定量化が可能となり、エンドサイトーシスや細胞内輸送といった基本的なプロセスの解明に寄与します。
研究の主要構成要素
研究分野
- 細胞生物学
- 膜ダイナミクス
- タンパク質-膜相互作用
背景
- タンパク質が膜曲率にどのように影響するかを理解することは、細胞プロセスにおいて極めて重要です。
- 曲がった膜を調査することで、エンドサイトーシスに関与するメカニズムを明らかにすることができます。
- 膜力学は、細胞内輸送において不可欠な役割を果たしています。
使用方法
- 曲面膜とタンパク質の相互作用を研究するためのナノチューブ牽引法。
- モデルシステムとしての巨大単層小胞。
- 膜特性を測定するための光ピンセットおよび顕微鏡法。
主な結果
- endophilin A2などのタンパク質がどのように膜ナノチューブと相互作用し、それを安定化させるかを定量化した。
- 観察されたさまざまな挙動を通じて、脂質膜の機械的特性を実証した。
- タンパク質が曲率を持つ膜に優先的に結合することへの知見を提供した。
結論
- 本研究は、タンパク質相互作用における膜曲率の重要性を強調しています。
- 提示された手法は、細胞プロセスおよび膜生物学におけるさらなる研究を促進することが可能です。
よくある質問
業界における実用的意義
本手法では、タンパク質と膜曲率の相互作用を定量的に解析することができ、エンドサイトーシスや細胞内輸送経路に関するメカニズム的な知見を得ることが可能です。高曲率膜へのタンパク質の結合とその機械的影響を測定することで、ターゲットのバリデーションを支援し、膜結合性治療薬の早期探索におけるリスクを低減します。このアプローチは、分子相互作用を膜リモデリングの表現型に結びつけることで、タンパク質機能に対する予測的な信頼性を提供します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 湾曲した膜へのタンパク質結合とその相反する変形を定量化することで、治療仮説を検証します。
- 運用の価値： endophilin A2による力のゼロへの低減など、タンパク質誘起の膜安定化を直接測定することで、機能的な標的バリデーションを可能にします。
- 予測的価値： 高曲率膜に優先的に結合するタンパク質を特定することで、小胞形成へのメカニズム的な関連性を示し、ポートフォリオの優先順位付けを支援します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備：膜の曲率、張力、およびタンパク質の表面密度を同時に測定することで、ダウンストリームのスクリーニングに適したバリデート済みのタンパク質-膜システムを調製します。
- 定量的出力：光学トラップの変位と蛍光強度から力と半径の測定値を算出し、曲げ剛性の計算に必要な2つのリードアウトを提供します。
- 再現性：マイクロピペット吸引による膜張力の制御とゼロ点校正を標準化し、実験間での一貫したナノチューブ形成を保証します。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 疾患への関連性：エンドサイトーシスのネックのような湾曲した細胞構造をモデル化し、タンパク質と膜の相互作用を、神経変性疾患や代謝疾患に関与する輸送経路へと結びつけます。
- トランスレーショナルな連続性：ナノチューブ上のタンパク質の組織化と可動性を評価するための、高解像度顕微鏡観察や単一粒子追跡によるフォローアップを可能にすることで、in vitroでの知見を細胞レベルのコンテキストへと橋渡しします。
- リスク調整後の進展：タンパク質が膜力学をどのように変化させるかを定量化することで、メカニズムのリスク低減における不確実性を排除し、go/no-go判断の根拠を提供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法はディスカバリーバイオロジーの段階に位置し、リード化合物の同定および前臨床検証に進む前段階としての、仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- 探索生物学：特定のタンパク質がどのように膜曲率を感知または誘導するかを検証し、エンドサイトーシスや細胞内輸送における役割を明らかにします。
- スクリーニング：標準化された曲率と張さを備えたアッセイ準備済みのシステムを提供し、化合物の信頼性の高い評価やタンパク質の評価を可能にします。
- 分析：膜の曲げ剛性やナノチューブ上のタンパク質濃縮度を定量化する、力、半径、および蛍光強度の読み取り値を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：in vitroでのタンパク質-膜結合と、細胞内での局在およびダイナミクスとの相関を可能にすることで、前臨床研究へと繋げます。
- エンタープライズ再利用：複数のプロジェクトにわたり、関心のある多様なタンパク質を研究するための再利用可能なプラットフォームを構築し、冗長な手法開発を削減します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：タンパク質-膜相互作用におけるメカニズム的な曖昧さを低減することで、ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を向上させます。
- 運用上の価値：標準化されたベシクル調製、張力制御、およびナノチューブ特性のデュアルモード測定により、再現性を確保します。
- 戦略的価値：タンパク質の曲率依存的な結合に関する定量データに基づいた早期のgo/no-go判断を可能にし、資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響：結合挙動を機能的な膜リモデリングに結びつけることで、膜関連ターゲットのリスク調整済み優先順位付けを支援します。
実施上の考慮事項
- ナノチューブの牽引およびタンパク質注入のためには、マイクロマニピュレーション、光ピンセット、および蛍光顕微鏡の専門知識が必要です。
- 張力、曲率、およびタンパク質密度の同時測定には、マイクロピペット吸引装置、ピエゾアクチュエータ、および共焦点システムなどの特殊な装置に依存します。
- データの比較可能性を確保するため、バッファー条件、小胞調製プロトコル、およびタンパク質標識戦略について、チーム間での標準化が必要です。
- 本手法を異なる脂質組成やタンパク質システムに拡張する場合、特にビオチン-ストレプトアビジン結合効率に関する適応上の検討事項が含まれます。
- 測定の完全性を維持するために、チャンバーのパッシベーション用として高純度のbeta-caseinが必要であることや、マイクロピペットの充填時に気泡の混入を慎重に避ける必要があることなどの実用的な制限があります。
