共焦点イメージングの神経ペプチド Y-pHluorin: そのままのマウスと人間のランゲルハンス島におけるインスリン開口分泌の可視化技術

PHluorin、pH に敏感な緑色蛍光タンパク質を用いたそのまま膵ランゲルハンス島のインスリン分泌の可視化のためのプロトコルについて述べる。膵島は、小胞貨物ニューロペプチド Y に結合された pHluorin をエンコード アデノ ウイルスに感染しています。これにより、共焦点顕微鏡によるインスリン顆粒の融合イベントを検出するため。

このアッセイの全体的な目標は、共焦点顕微鏡法により、無傷の膵島におけるインスリン顆粒エキソサイトーシスをリアルタイムで視覚化することです。この方法は、糖尿病分野の重要な質問に答えます。たとえば、インスリンエキソサイトーシスを調節するものは何ですか?

顆粒融合は、より優れた細胞の寿命において最も重要なイベントであるため、これは非常に重要です。この技術の主な利点は、無傷の島を使用できること、および本来の環境内の細胞内の融合イベントを確認できることです。私たちの研究室の博士課程の学生であるMadina Mahkmutovaがこの技術を実演します。

膵島の到着時に、膵島を50ミリリットルのファルコンチューブに移し、5分間毎分1, 000回転で膵島の懸濁液を遠心分離します。膵島はチューブの底に集まり、2ミリリットルのCMRL培地に膵島を35ミリメートルの非組織培養処理シャーレに移し、ウイルス感染前に摂氏37度と二酸化炭素5%で24時間インキュベートします。単離後、約マウスの膵島当量を2ミリリットルのCMRL培養培地に再懸濁し、それらを35ミリメートルの非組織培養ペトリ皿に移します。

ウイルス感染の24時間前に、組織を摂氏37度および5%二酸化炭素でインキュベートします。ウイルス感染を行うには、2ミリリットルのCMRL培地にヒトまたはマウスの膵島が入った35ミリメートルのシャーレごとに、5〜10マイクロリットルのストックウイルスを追加します。膵島を24時間培養した後、培地を吸引し、ウイルスを含まない2ミリリットルのCMRL培地と交換します。

小島を4〜6日間培養し、3日ごとに培地を交換します。ここに記載されている試薬を組み合わせて細胞外溶液を調製し、バッファーをろ過滅菌します。50ミリリットルの細胞外溶液に75マイクロリットルの2モルグルコースストックを添加することにより、基礎グルコース培地を3ミリモルの最終グルコース濃度にします。

次に、高血糖培地を16ミリモルの最終グルコース濃度まで調製するために、400マイクロリットルの2モルグルコースストックを50ミリリットルの細胞外溶液に加えます。.追加の刺激と3ミリモルグルコースを含む細胞外溶液を希釈します。.実験を開始する前に、1ミリグラムあたり1ミリグラムの30マイクロリットルのポリ-d-リジン溶液でカバースリップを前処理し、1時間インキュベートします。

次に、水を使用してカバースリップを十分にすすぎます。実験の少なくとも1時間前に、膵島のグループを、3ミリモルグルコースを含む細胞外溶液を含む35ミリメートルのシャーレに移します。残りの島を摂氏37度と二酸化炭素5%に保ちます。

実験開始の30分前に、シリコングリースでカバースリップをイメージングチャンバーに貼り付けてシールします。次に、イメージングチャンバーをイメージングプラットフォームに固定します。次に、ピペットを使用して、20〜30個の膵島をカバースリップのポリ-d-リジン処理領域に移し、膵島を表面に20分間接着させます。

このステップは実験の成功にとって重要であり、10マイクロリットル未満のバッファーに約20〜30の小島を収集し、20分間待ちます。膵島の損傷を避けるために、カバーを完全に滑り込ませて乾かさないようにすることが重要です。膵島がカバースリップに付着している間に、水を使用して灌流システムを準備し、十分にすすいでください。

次に、次の表に従って、各ソリューションを異なるチャネルに追加します。システムからすべての気泡を取り除くには、各チャネルを個別に開き、溶液を数分間流します。流れが一貫しており、チューブが漏れていないことを確認します。

次に、シングルインラインソリューションヒーターを灌流出口チューブに接続し、流出バッファーの温度を摂氏37度に調整します。次に、吸引ポンプを準備します。チューブを接続し、ポンプをオンにして、液体が吸引されていることを確認します。

膵島のあるイメージングプラットフォームを顕微鏡ステージに置き、灌流システムと吸引ポンプに接続します。次に、イメージングチャンバーに3ミリモルグルコースを含む細胞外溶液を静かに充填します。共焦点イメージングを行うには、顕微鏡フィールド内の島を低倍率で特定します。

小島に焦点を合わせたら、高倍率の対物レンズに切り替えます。取得ソフトウェアを開き、常駐スキャンモードをアクティブにします。xyztイメージングを選択し、取得設定を構成するには、アルゴンレーザーをオンにして30%に設定し、次に488ナノメートルレーザーラインを設定して、pHluorin励起のレーザー出力を約50%に調整します。

EGFP発光スペクトルをガイドとして使用して、505〜555ナノメートルで発光を収集します。解像度は 512 x 512 ピクセルから選択します。ライブボタンを押してイメージングを開始し、ゲインレベルを調整します。

Z スタックの始点を設定するには、小島の上部に焦点を合わせて begin を選択し、次にフォーカスできる最後の平面に移動して n を選択します。Z スタック サイズを 5 マイクロメートルに選択します。各zスタックの集録時間間隔を1.5秒から2秒近くに設定し、連続撮像のために停止するまで集録するオプションを選択します。

次に、スタートボタンを押してイメージングを初期化します。顆粒エキソサイトーシスを誘導するための刺激プロトコルについては、テキストプロトコルを参照してください。常駐スキャナーを使用して、島の共焦点画像は2秒未満でタイムラプス記録として取得されます。

さらに、この技術は、膜電位や細胞質遊離カルシウム色素などの機能イメージング用色素と組み合わせることができます。NP Y-pHluorinが本当にインスリン顆粒動態をモニタリングするのに適したツールであるかどうかを判断するために、感染した膵島を、NP Y-pHluorinおよび膵島ホルモンのインスリン、ソマトスタチンまたはグルカゴンに対するGFPに対する抗体で免疫染色した。NP Y-pHluorinを発現する細胞のほとんどは、インスリンも発現するため、ベータ細胞でした。

少数のグルカゴン陽性アルファ細胞またはソマトスタチン陽性デルタ細胞のみがGFP標識されました。重要なことに、感染細胞では、NP Y融合がインスリンと共局在していました。この図は、pHluorinが効果的なpHセンサーであることを示しています。

50ミリモルの塩化アンモニウムで細胞間pHを上昇させると、細胞間蛍光が500%以上増加しました。融合孔の開口部で原形質膜と融合すると、顆粒内部のpHが上昇すると、塩化カリウムによる膜脱分極などのインスリンエキソサイトーシスを刺激する条件下で、NP Y-pHluorinを含む顆粒が見えるようになります。NP Y-pHluorinに感染した膵島の共焦点タイムラプスイメージングを使用して、無傷の膵島内のベータ細胞の単一の分泌イベントを視覚化できます。

これらは、塩化カリウムまたは他のいくつかの生理学的刺激による直接的な膜脱分極に応答して発生します。基礎細胞外グルコース濃度では、分泌活性はほとんど観察されません。しかし、高グルコースによる刺激に反応して、原形質膜との顆粒融合が引き起こされます。

この手順に続いて、免疫組織化学などの他の方法を実行して、細胞の特定の領域で顆粒融合が起こる理由などの追加の質問に答えることができます。開発後、この技術は、ヒトの膵島におけるベータ細胞集団におけるインスリン顆粒分泌の時間的パターンを調査するために使用されてきました。