Name: 共焦点イメージングの神経ペプチド Y-pHluorin: そのままのマウスと人間のランゲルハンス島におけるインスリン開口分泌の可視化技術 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 学ぶ 共焦点顕微鏡を用いたpHluorin法によるマウスおよびヒトランゲルハンス島でのインスリン顆粒外排のリアルタイム可視化技術。この方法は糖尿病研究における分泌調節機構の解明に貢献します。

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著者は、イメージング顕微鏡の助けを中核施設 DRI からマーシャ Boulina をありがとうございます。この作品は、NIH の助成金 1K01DK111757-01 (JA)、F31668418 (MM)、R01 DK111538、R33 ES025673、R56 DK084321 (AC) によって支えられました。

マイアミ大学の動物倫理委員会は、すべての実験を承認した。
 1 です。 ウイルス感染のそのまま分離人間またはマウスの膵島 <ol><li>島文化: 膵島培養メディアを準備: コンノート医学研究所 (CMRL) 1066、10% (v/v) FBS と 2 mM L グルタミン。
	<ol><li>ヒト膵島は、統合された膵島配布プログラム (NIDDK, NIH) から取得されます。到着時に転送島 (~ 500 アイレット同等) に 35 mm 組織培養処理 2 mL CMRL 培養基で 37 ° C、5/95% CO 2/O 2 ウイルス感染前に 24 h のペトリ皿</li>。
		<li>マウス膵ランゲルハンス島を分離以前に確立されたプロトコル 16 次にすることができます。次の分離、培養 〜 200 島同等の 35 mm 組織培養処理 2 mL CMRL 培養基で 37 ° C、5/95% CO 2/O 2 ウイルス感染前に 24 h のペトリ皿 。
		注意: NPY pHluorin と蛍光の重複を避けるために島に表明した GFP や YFP の記者とトランスジェニック マウスは使用しない</li>。
	</ol></li> <li>ウイルス準備 注: NPY pHluorin 融合 pcDNA3 ベクトル 10 に複製され subcloned アデノウイルスベクター アデノ ウイルスの生産のために [アデノ ウイルス血清型 5 (コピー DE1/E3)] 組換えアデノ ウイルスによる製造会社。ウイルスが避けようと-80 ° C で保存されます。ウイルスの在庫は 10 の抗体で会社によって提供 12 10 13 ウイルス粒子 (〜 3 × 10 10 - 3 x 10 11 PFU)。
	<ol><li>体外 膵感染、使用 10 6 PFU/mL 約 2 (詳細については 議論 を参照) の感染 (MOI) の近似的多様性に終って</li></ol></li>
	<li>膵島のウイルス感染 
	注意: バイオ セーフティ レベル 2 (BSL2) プロシージャおよび証明にアデノ ウイルスでの作業が必要です。ガイダンス ・ BSL2 手続きに関する研修制度バイオ セーフティに関する役員に確認してください。
	<ol><li>上記のように人間/マウス島を準備します</li>。
		<li>(10 %fbs と 2 mM L グルタミン) と CMRL 培地 2 mL に人間/マウス島を含む各 35 mm のペトリ皿にストック ウイルスの 5-10 μ L を追加します 。
		注: ウイルス会社データシートで定めるウイルス力価によると使用量を調整する</li>。
		<li>ウイルスを含んでいる、島の文化メディア 37 °C/5% CO 2 24 時間で</li>
		<li>24 h 後吸引ウイルスを含むメディアと 2 mL CMRL 培地 (10 %fbs と 2 mM L グルタミン) で置き換えます</li>。
		<li>37 °C/5% CO 2、3 日おき、メディアの交換で 4-6 日の小島を文化します</li>。
		<li>後 4 - 養殖の 6 日間は、約、30% 膵島細胞に感染するを期待しています。小島は、ライブ イメージング実験のため使用できます</li>。
	</ol></li></ol> 2。感染している小島の共焦点イメージング 注:、共焦点レーザー顕微鏡に必要な資機材の 材料表 を参照してください。
<ol><li>試薬調製と実験装置 <ol><li>細胞外のソリューションの準備: pH 7.4、滅菌フィルターの 125 mM の NaCl、5.9 mM KCl、2.56 mM CaCl 2、1 mM MgCl 2、25 mM HEPES、0.1 %bsa を追加 。
		注: このバッファーは通常ブドウ糖を使わず、4 ° C で 1 ヶ月保存できます。グルコースは、所望の最終濃度に到達する実験の日に追加されます。
		<ol><li>準備基底グルコース (3 mM) 培地: 細胞外液 50 mL に 2 M グルコース株式 75 μ L を追加します</li>。
			<li>高血糖 (16 mM) 媒体: 細胞外液 50 mL に 2 M グルコース ストックの 400 μ L を追加</li></ol>
		</li> <li>3 mM グルコースを含む細胞外の溶液中の任意の追加刺激 (例えば、KCl またはアデノシン三リン酸 (ATP)) を希釈します</li>。
		<li>1 h の coverslip にポリ-D-リジン溶液 (1 mg/mL) の 30 μ L を追加し、徹底的に H 2 o. 洗浄ポリ-D-リジンと coverslips を前処理実験を開始する前に 
		注: ポリ リジン コーティング coverslips 格納できる常温 6 ヶ月です</li>。
		<li>1 mL ピペットを使用して、実験の前に少なくとも 1 時間は 3 mM グルコースを細胞外の溶液を含む 35 mm のペトリ皿に小島を転送します。37 ° C、5% CO 2 で小島を維持します 。
		注: 必要に応じて、細胞膜がこの手順でラベル付けできます。細胞膜にラベルを付ける、3 mM グルコースを細胞外の溶液に 2 μ M ・ ディ ・ 8 ANEPP 染料を追加します。37 °C/5% CO 2 で 1 h の色素溶液中の小島を孵化させなさい。膜色素は、488 で励起されることが nm と 620 で検出された nm</li>。
		<li>分、実験を開始する前に、真空のシリコン グリスをシール イメージング室に、coverslip を取り付けます。イメージング プラットフォームにイメージングの商工会議所を修正します。小島は 20 分を表面に付着させ coverslip のポリ D リジン扱われる領域に 20-30 の小島を配置、ピペットを使用して 
		注: coverslip 膵損傷を避けるために完全に乾燥させることが重要です</li>。
		<li>小島、coverslip に付着している間は、水ですすぐ灌流システムを準備します。別のチャンネルに各ソリューションを追加: 3 mM グルコース (1 チャンネル)、16 mM グルコース (チャネル 2)、100 μ M 3-イソブチル-1-メチルキサンチン (IBMX) と 10 μ M フォルスコリン (チャネル 3) 3 mM グルコース (チャネル 4) 3 mM グルコース (10 μ M ATP の 25 mM KCl 16 mM グルコースチャネル 5)。各チャンネルを個別に開くと、数分間ソリューション フローをさせることによって、システムからすべての泡を削除し、流れが一貫性のある (0.5 mL/分) と管が漏れていないことを確認してください</li>。
		<li>灌排水チューブに単一インライン ソリューション ヒーターを接続し、37 止水バッファーの温度を調整する ° C</li>
		<li>は、吸引ポンプを準備します。システムからすべてのバブルを削除して、流れが一貫した管が漏れていないことを確認します</li>。
		<li>島は、coverslip 表面に付着後は優しく 3 mM グルコースを含む細胞外の溶液でのイメージングの商工会議所によって埋めます。洗浄、カバーガラスの表面から島を避ける</li>。
		<li>顕微鏡ステージ上に小島とイメージング プラットフォームを配置し、灌流システムと吸引ポンプに接続します</li>。
		<li>ターン流れ、常に 3 G 細胞外の溶液で小島を灌流します。システム共焦点レーザー顕微鏡の準備が整いました</li>。
	</ol></li> <li>共焦点イメージング <ol><li>低倍率の顕微鏡分野で小島を探します。小島に焦点を当てて後は、高い倍率の目標に切り替える (例えば、63 X 水浸対物レンズ (63 X/0.9 NA)).</li>
		<li>ソフトウェア (資材表) を使用して取得を開き、共振型スキャナー モードを有効にします</li>。
		<li>XYZT 画像モードを選択し、取得設定を次のように: <ol><li>ターンではアルゴン レーザーおよび 488 nm レーザー ライン、50 %phluorin 励起レーザー パワーを調整します</li>。
			<li>505 555 nm の発光を収集します</li>。
			<li>は、512 × 512 ピクセルの解像度を選択します。プレス、&#34; ライブ &#34; イメージングを起動し、(典型的な利得は約 600 V) 利得レベルを調整します</li>。
			<li>設定の開始と z スタックの末尾: 小島の上に焦点を当てるし、選択 &#34; 開始 &#34; 最後集中することができますを選択する平面の移動と &#34; エンド &#34;。5 μ m の z ステップ サイズを使用します。共焦点平面の数が自動的に算出されます</li>。
			<li>1.5-2 秒近くそれぞれの z の取得時間間隔を設定し、オプションを選択 &#34; を停止するまでを取得 &#34; 連続イメージング</li>。
			<li>プレス、&#34; 開始 &#34; ini ボタンtialize.</li>
		</ol></li> <li>必要な刺激と小島を灌によって開口分泌を誘導するさまざまな刺激のプロトコルを使用します。刺激のプロトコルを (次に見なさい) 目的の科学的な目的に合うようにカスタマイズできます</li>。
	</ol></li> <li>刺激のプロトコル 注: すべての刺激のプロトコルでは 3 mM グルコースを含む細胞外の溶液に一定の血流中に膵島バック グラウンド アクティビティの少なくとも 2 分を記録することによって開始します。必要な期間が覚醒剤を灌流します。覚醒剤の注文、刺激の持続時間と同様、録音の期間は、必要な科学的な目的に合うようにカスタマイズできます。新しい刺激を開始する前に 3 mM グルコースを含む細胞外の溶液で小島を徹底的に洗浄することを確認します。以下のメソッドの機能を示すために使用されているサンプル刺激のプロトコルを見つけます。
	<ol>PHluorin ph 非感受性とウイルス感染効率 ( 図 3) のための肯定的な制御として塩化アンモニウム (NH 4 Cl) と <li>活性化: 3 mM グルコース (2 分) &#8594; 50 mM NH 4 3 mM グルコース Cl (2 分)&#8594; 3 mM グルコース (2 分) 注: で、NH 4 Cl ソリューションはモルごとに NaCl を取り付けます</li>。
		<li>( 図 5 および 図 6) グルコース濃度を増やすことによって刺激するインスリン開口分泌: 3 mM グルコース (2 分) &#8594; 16 mM グルコース (15-30 分) &#8594; 3 mM グルコース(2 分 
		注: 活動のいくつかのバーストを見るために少なくとも 15 分の 16 G ソリューションを継続的に島を灌流 
		注: 分泌応答 17 の一貫性を高めるために追加キャンプ調達エージェント (IBMX 100 μ M と 10 μ M フォルスコリン) 3 G と 16 G の両方のソリューションにします。顆粒の分泌の一時的なパターンは変わりません。詳細は、 15 と ディスカッション を参照してください</li>。
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があるを宣言します。

本稿では、共焦点顕微鏡による内そのままの膵島 β 細胞でインスリン顆粒の開口放出を視覚化するために使用できる手法について説明します。高いトランスフェクション効率を確保するためにアデノ ウイルス複製蛍光レポーターとして NPY pHluorin を使用します。
メソッドは私たちの手で非常に効率的なそれは主に 2 つのパラメーターに依存するいくつかの変更を必要があります: 1) 膵島の準備、および 2) 感染条件の最適化とウイルス株の価の品質。小島のウイルス感染、前に 37 ° C で一晩分離と輸送のストレスから回復する膵島準備を許可します。細胞膵島表面または低酸素細胞 (暗い) 膵島センター18の存在から突出など減少の可能性の兆候を感染/式期間とチェックで光学顕微鏡による膵島の形態を検査します。.各ウイルス株価と感染効率の異なる場合があります。ウイルス ウイルス力価や顕微鏡測定前に文化の時間に応じて使用量を調整することを確認します。最も重要なステップは、レポーターの十分な表現は、膵島の完全性と応答性が維持されるように感染条件 (...

インスリンは膵島のベータ細胞によって生成される、グルコース代謝1の重要な調節因子であります。死またはベータ細胞の機能不全はグルコース恒常性を乱すし、糖尿病2に 。Ca2 +でリリースされている芯顆粒中にインスリンがパック-に依存する方法3。インスリン開口分泌の調整方法を解明理解何がインスリン分泌を決定し、糖尿病の治療のための新規治療標的の同定のための新しい道を開くに不可欠です。
インスリン分泌は、蛍光分子との組み合わせで, 膜容量測定と顕微鏡的アプローチなどの電気生理学的アプローチを使用して幅広く研究されています。膜容量測定時間分解能が良いがあるし、単一セルの録音を許可します。ただし、静電容量の変化セルの純表面変更を反映し個々 の融合イベントをキャプチャか他の非インスリン分泌小胞3からインスリン顆粒の融合を区別します。蛍光プローブと小胞積荷タンパク質との組み合わせで 2 光子または全内部反射蛍光 (TIRF) 顕微鏡などの微視的アプローチは、追加の詳細を提供します。これらの技術は、分泌の単一イベントとも前と後に分泌の段階をキャプチャし、セル3の人口の分泌パターンを勉強するため。
蛍光レポーターを 3 種類にすることができます: 1) 細胞外、2) 細胞質、または 3) 小胞。1) 細胞外記者が極地のトレーサー (例えばdextrans、sulforhodamine B (SRB)、黄色、ルシファー ピラニン)4細胞外の環境を導入することができます。極のトレーサーの使用は細胞の人口の融合細孔の調査では、し、血管など様々 な細胞構造をキャプチャします。しかし、彼らは小胞貨物に関する報告はしません。2) 細胞質の記者は、細胞質に直面、ドッキングと開口放出に関与する膜準蛋白質に結合する蛍光プローブです。神経科学神経伝達物質のリリース5を勉強するために正常に使用されている水溶性Nエチルマレイミド感受性因子添付ファイル蛋白質受容体 (スネア) 家族のメンバーがあります。そのような蛋白質は複数の結合パートナーがあり、インスリン顆粒特定。3) 小胞の記者は、貨物固有ベシクル挙動の調査を可能にする小胞貨物蛋白質に融合した蛍光プローブです。インスリン顆粒特定貨物蛋白質は他の間でインスリン、c-ペプチド、膵島アミロイドポリペプチド NPY を含める6,7。NPY は、インスリン顆粒を含むであるのみ、共同蛍光レポーター8の優秀なパートナーとなってインスリン、解放されます。
NPY を異なる蛍光タンパク質の融合は特定シナプトタグミン アイソ フォーム9,10の要件などの神経内分泌細胞の開口放出の様々 な面を調査する以前採用されている方法リリースの時間コースには、アクチン細胞骨格とミオシン II11,12によって異なります。本研究では非蛍光性は、変更された GFP 蛍光レポーターとして pHluorin を選んだ内部コアの密度の高い酸性 pH で顆粒は、中立的な細胞外 pH13への露出に鮮やかな蛍光なります。成熟したインスリン顆粒 5.5 以下の酸性の pH があります。顆粒は細胞膜と開きますヒューズ、一度その貨物が 7.4,7,14でレポーターとして pH 感応蛋白質 1p-169 利用できるの中立的な細胞外 pH に公開されます。
1p-169 pH の敏感な性質とインスリン顆粒中の NPY の選択式、NPY pHluorin 融合コンストラクトを使用してインスリン開口分泌のさまざまなプロパティを研究できます。融合コンストラクトのウイルスの伝達は高いトランスフェクション効率を確保し、一次ベータ細胞または細胞や膵島を動作します。このメソッドは、NPY を含む小胞を持つ他の細胞型で開口放出を勉強するためのガイドラインとして使用できます。それは、特定の条件(ノックダウン、過剰発現等)の影響を検討する任意のトランスジェニック マウス モデルによる開口放出に組み合わせることもできます。この手法は、以前インスリン顆粒分泌 β 細胞膵島15の時空間パターンを特徴付けるために使用されています。

<table><tbody><tr><td>直立型レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ、ウェッツラー、ドイツ</td><td>TCS-SP5</td><td>には、LAS AF、画像取得ソフトウェア</td></tr><tr><td>イメージングチャンバーが含まれています</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>イメージングチャンバープラットフォーム</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>PH-1</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40 ガラスカバースリップ</td><td>ダイガーブランド</td><td>G15972H</td><td></td></tr><tr><td>バキュームシリコーングリース</td><td>シグマ</td><td>Z273554-1EA</td><td></td></tr><tr><td>マルチチャンネル灌流システム</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>VC-8</td><td></td></tr><tr><td>シングルインラインソリューションヒーター</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>温度コントローラー</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>TC-324C</td><td></td></tr><tr><td>蠕動吸引ポンプ</td><td>ファルマシア</td><td>P-1</td><td></td></tr><tr><td>35 mm シャーレ、非組織培養処理</td><td>VWR</td><td>10861-586</td><td></td></tr><tr><td>CMRL 培地、グルタミンなし</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11530037</td><td></td></tr><tr><td>FBS、熱不活性化</td><td>サーモフィッシャー</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン 200 mM</td><td>サーモフィッシャー</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl 溶液</td><td>シグマ</td><td>S5150</td><td></td></tr><tr><td>3 M KCl 溶液</td><td>シグマ</td><td>60135</td><td></td></tr><tr><td>1 M CaCl2 solution</td><td>Sigma</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl2 solution</td><td>Sigma</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Σ</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES 溶液</td><td>ΣH0887</td><td></td><td></td></tr><tr><td>真空フィルター</td><td>VWR</td><td>431098</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-D-リジン臭化水素酸塩</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Di-8-ANNEP</td><td>ThermoFisher</td><td>D3167</td><td></td></tr><tr><td>3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)</td><td>Σ</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td></td><td>ΣF3917</td><td></td></tr></tbody></table>

共焦点イメージングの神経ペプチド y-phluorin: そのままのマウスと人間のランゲルハンス島におけるインスリン開口分泌の可視化技術

Confocal Imaging of Neuropeptide Y-pHluorin: A Technique to Visualize Insulin Granule Exocytosis in Intact Murine and Human Islets

インスリン分泌は、病気のようにも通常生理条件下でのグルコース恒常性で中心的な役割を果たしています。インスリン開口分泌電気生理学や顕微鏡蛍光レポーターの式に結合を使用するかを検討する現在のアプローチ。しかしこれらの技術のほとんどはクローン細胞株に最適化されています。 または膵島を分離を必要とします。対照的に、ここで紹介した方法はそのまま膵ランゲルハンス島のインスリン開口分泌のリアルタイム可視化できます。このプロトコルでまずエンコード pH 敏感な緑色蛍光タンパク質 (GFP)、pHluorin、神経ペプチド Y(NPY) と結合したアデノ ウイルスの単離膵島のウイルスの感染を示します。第二に、我々 は、共焦点イメージング島 5 日間後ウイルス感染とインスリン顆粒分泌を監視する方法について説明します。簡単に言えば、感染した小島をイメージング室 coverslip のされされて継続的に様々 な刺激を含む細胞外の溶液を灌流中の直立レーザー走査型共焦点顕微鏡の下でイメージを作成します。高速共鳴スキャナーを使用して時間経過の録音として膵島の 50 μ m にまたがる共焦点画像を取得します。インスリン顆粒細胞膜との融合は、時間をかけて続けることができます。この手順は、単一の実験で刺激のバッテリのテストが可能になりますまた、マウスと人間の島の両方と互換性のある、機能イメージング (例えば膜の潜在性またはゾル性細胞質カルシウム染料) のための様々 な染料と組み合わせることができます。

技術の全体のワークフローは、図 1に示すです。簡単に言えば、マウスまたは膵島 NPY pHluorin をエンコード アデノ ウイルスに感染しているできイメージ、共焦点顕微鏡のカルチャで数日後。顆粒は細胞膜と開くヒューズ、蛍光性の増加が観察される、定量化することができます (図 1)。どう NPY pHluorin は確かにインスリン顆粒動態を監視するための適切なツール、感染した小島は GFP と異なる膵島ホルモン インシュリン、ソマトスタチンやグルカゴン抗体と immunostained.またインスリンを表した、NPY pHluorin (GFP 陽性) を表現するほとんどの細胞が β 細胞 (~ 90%;図 2 a、 2 b)。グルカゴン陽性アルファ細胞またはデルタ ソマトスタチン陽性細胞数は GFP 標識 (図 2...

PHluorin、pH に敏感な緑色蛍光タンパク質を用いたそのまま膵ランゲルハンス島のインスリン分泌の可視化のためのプロトコルについて述べる。膵島は、小胞貨物ニューロペプチド Y に結合された pHluorin をエンコード アデノ ウイルスに感染しています。これにより、共焦点顕微鏡によるインスリン顆粒の融合イベントを検出するため。

共焦点イメージングの神経ペプチド Y-pHluorin: そのままのマウスと人間のランゲルハンス島におけるインスリン開口分泌の可視化技術

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study ...

このアッセイの全体的な目的は、共焦点顕微鏡を用いて、無傷の膵島におけるインスリン顆粒のエキソサイトーシスをリアルタイムで可視化することです。この手法は、糖尿病研究分野における重要な疑問、例えば、何がインスリンのエキソサイトーシスを制御しているのか、といった問いに対する答えを導き出します。顆粒の融合はβ細胞の生存において単一で最も重要なイベントであるため、これは極めて重要です。この手法の主な利点は、無傷の膵島を使用できることであり、細胞が本来の環境にある状態で融合イベントを観察できる点にあります。当研究室の博士課程学生であるMadina Mahkmutovaが、この手法の実演を行います。膵島が到着したら、まずそれらを50 mLファルコンチューブに移し、膵島懸濁液を1,000 rpmで5分間遠心分離します。膵島がチューブの底部に集まるので、2 mLのCMRL培養液を用いて、膵島を35 mm非組織培養処理ペトリ皿に移します。ウイルス感染させる前に、37 °C、5% CO2の条件下で24時間インキュベートします。単離後、約マウス膵島等量（islet equivalents）を2 mLのCMRL培養液で再懸濁し、35 mm非組織培養ペトリ皿に移します。ウイルス感染させる前に、組織を37 degree celsius、5%carbon dioxideの条件下で24時間インキュベートします。ウイルス感染を行うには、2 mLのCMRL培養培地でヒトまたはマウスの膵島を含む各35 millimeterペトリ皿に、5～10 µLのウイルスストックを添加します。膵島を24時間培養した後、培地を吸引し、ウイルスを含まない2 mLのCMRL培養培地と交換します。アイレットを4〜6日間培養し、3日ごとに培地を交換します。ここに記載した試薬を混合して細胞外液を調製し、その後バッファーをフィルター滅菌します。2 Mのグルコースストック液 75 µLを細胞外液 50 mLに加えることで、最終グルコース濃度を3 mMとした基礎グルコース培地を作成します。次に、最終グルコース濃度が16 millimolarとなる高血糖培地を調製するため、2 molarのグルコースストック溶液400 microlitersを、50 millilitersの細胞外液に加えます。その他の刺激剤および3 millimolarのグルコースを含む細胞外液で希釈してください。実験を開始する前に、カバーガラスに1 milligram per milliliterのポリ-D-リシン溶液30 microlitersを添加して前処理し、1時間インキュベートします。次に、水を用いてカバーガラスを十分に洗浄します。実験の少なくとも1時間前に、膵島の一群を3 mM glucoseを含む細胞外液が入った35 mmペトリ皿に移します。残りの膵島は37 °C、5% CO2の条件下で保持します。実験開始の30分前に、シリコングリスを用いて封止し、カバーガラスをイメージングチャンバーに取り付けます。次に、イメージングチャンバーをイメージングプラットフォームに固定します。続いて、ピペットを用いて20〜30個の膵島をカバーガラスのpoly-d-lysine処理領域に転送し、膵島が表面に接着するまで20分間放置します。このステップは実験の成功に不可欠であり、20〜30個のアイレットを10 µL未満のバッファーで回収し、20分間待ちます。アイレットの損傷を避けるため、カバースリップを完全に乾燥させないことが重要です。アイレットがカバースリップに接着している間に、水を用いて灌流システムを十分に洗浄し、準備します。次に、この表に従って、各溶液を異なるチャンネルに加えます。各チャンネルを個別に開き、溶液を数分間流すことで、システム内からすべての気泡を取り除いてください。流量が一定であること、およびチューブに漏れがないことを確認してください。次に、インライン溶液ヒーターを灌流出口チューブに接続し、流出するバッファーの温度を37 °Cに調整します。その後、吸引ポンプを準備します。チューブを接続してポンプの電源を入れ、液体が吸引されていることを確認してください。アイレットを載せたイメージングプラットフォームを顕微鏡ステージ上に配置し、灌流システムおよび吸引ポンプに接続します。次に、3 mMのグルコースを含む細胞外液をイメージングチャンバーにゆっくりと満たします。共焦点イメージングを行うために、低倍率で顕微鏡視野内のアイレットを特定します。島にフォーカスを合わせた後、より高倍率の対物レンズに切り替えます。撮影ソフトウェアを開き、常駐スキャンモードを有効にします。xyztイメージングを選択し、撮影設定を構成するために、アルゴンレーザーをオンにして30%に設定し、次に488 nmのレーザーラインをオンにし、pHluorinの励起に合わせてレーザー出力を約50%に調整します。EGFPの放出スペクトルを指標として、505から555ナノメートルの範囲で放出光を収集します。解像度は512×512ピクセルに設定してください。ライブボタンを押してイメージングを開始し、ゲインレベルを調整します。膵島の上端に焦点を合わせて「begin」を選択し、次にフォーカス可能な最後の平面まで移動して「end」を選択することで、zスタックの開始端と終了端を設定します。zスタックのサイズは5 µmに設定してください。各zスタック取得の時間間隔を1.5〜2秒程度に設定し、連続イメージングのために「acquire until stopped」オプションを選択します。次に、スタートボタンを押してイメージングを開始します。顆粒のエキソサイトーシスを誘導するための刺激プロトコルについては、テキストプロトコルを参照してください。搭載のスキャナーを使用して、アイレットの共焦点画像を2秒未満のタイムラプス録画として取得します。さらに、この手法は、膜電位や細胞質遊離カルシウム染料などの機能イメージング用染料と組み合わせることが可能です。NP Y-pHluorinがインスリン顆粒のダイナミクスをモニタリングするための適切なツールであるかを確認するため、感染させた島を、NP Y-pHluorinに対するGFP抗体、および島ホルモンであるインスリン、ソマトスタチン、またはグルカゴンに対する抗体で免疫染色しました。NP Y-pHluorinを発現している細胞のほとんどはインスリンも発現していたため、β細胞であることがわかりました。グルカゴン陽性のアルファ細胞またはソマトスタチン陽性のデルタ細胞のごく一部のみがGFPでラベルされていました。重要な点として、感染細胞においてNP Y融合タンパク質はインスリンと共局在していました。この図は、pHluorinが効果的なpHセンサーであることを示しています。50 millimolarの塩化アンモニウムを用いて細胞内pHを上昇させると、細胞内蛍光が500%以上増加しました。融合孔の開口に伴い、プラズマメンブレンとの融合によって顆粒内部のpHが上昇するため、塩化カリウムによる膜脱分極などのインスリン放出を刺激する条件下において、NPY-pHluorin含有顆粒が可視化されます。NPY-pHluorinを導入した膵島の共焦点タイムラプスイメージングを用いることで、無傷の膵島内にあるベータ細胞における個々の分泌イベントを視覚化することが可能です。これらは、塩化カリウムによる直接的な膜脱分極や、その他のいくつかの生理学的刺激に反応して起こります。基底状態の細胞外グルコース濃度では、分泌活性はほとんど観察されません。しかし、高グルコース刺激に反応して、顆粒の細胞膜への融合が誘発されます。この手順に続き、免疫組織化学などの他の手法を行うことで、細胞の特定の領域でなぜ顆粒融合が起こるのかといった追加の疑問を解明することができます。この手法の開発後、ヒト膵島におけるベータ細胞集団のインスリン顆粒分泌の時間的パターンの探索に利用されています。

confocal-imaging-neuropeptide-y-phluorin-technique-to-visualize

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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共焦点イメージングの神経ペプチド Y-pHluorin: そのままのマウスと人間のランゲルハンス島におけるインスリン開口分泌の可視化技術

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