共焦点イメージングの神経ペプチド Y-pHluorin: そのままのマウスと人間のランゲルハンス島におけるインスリン開口分泌の可視化技術

このアッセイの全体的な目的は、共焦点顕微鏡を用いて、無傷の膵島におけるインスリン顆粒のエキソサイトーシスをリアルタイムで可視化することです。この手法は、糖尿病研究分野における重要な疑問、例えば、何がインスリンのエキソサイトーシスを制御しているのか、といった問いに対する答えを導き出します。

顆粒の融合はβ細胞の生存において単一で最も重要なイベントであるため、これは極めて重要です。この手法の主な利点は、無傷の膵島を使用できることであり、細胞が本来の環境にある状態で融合イベントを観察できる点にあります。当研究室の博士課程学生であるMadina Mahkmutovaが、この手法の実演を行います。

膵島が到着したら、まずそれらを50 mLファルコンチューブに移し、膵島懸濁液を1,000 rpmで5分間遠心分離します。膵島がチューブの底部に集まるので、2 mLのCMRL培養液を用いて、膵島を35 mm非組織培養処理ペトリ皿に移します。ウイルス感染させる前に、37 °C、5% CO2の条件下で24時間インキュベートします。単離後、約マウス膵島等量（islet equivalents）を2 mLのCMRL培養液で再懸濁し、35 mm非組織培養ペトリ皿に移します。

ウイルス感染させる前に、組織を37 degree celsius、5%carbon dioxideの条件下で24時間インキュベートします。ウイルス感染を行うには、2 mLのCMRL培養培地でヒトまたはマウスの膵島を含む各35 millimeterペトリ皿に、5～10 µLのウイルスストックを添加します。膵島を24時間培養した後、培地を吸引し、ウイルスを含まない2 mLのCMRL培養培地と交換します。

アイレットを4〜6日間培養し、3日ごとに培地を交換します。ここに記載した試薬を混合して細胞外液を調製し、その後バッファーをフィルター滅菌します。2 Mのグルコースストック液 75 µLを細胞外液 50 mLに加えることで、最終グルコース濃度を3 mMとした基礎グルコース培地を作成します。

次に、最終グルコース濃度が16 millimolarとなる高血糖培地を調製するため、2 molarのグルコースストック溶液400 microlitersを、50 millilitersの細胞外液に加えます。その他の刺激剤および3 millimolarのグルコースを含む細胞外液で希釈してください。実験を開始する前に、カバーガラスに1 milligram per milliliterのポリ-D-リシン溶液30 microlitersを添加して前処理し、1時間インキュベートします。

次に、水を用いてカバーガラスを十分に洗浄します。実験の少なくとも1時間前に、膵島の一群を3 mM glucoseを含む細胞外液が入った35 mmペトリ皿に移します。残りの膵島は37 °C、5% CO2の条件下で保持します。

実験開始の30分前に、シリコングリスを用いて封止し、カバーガラスをイメージングチャンバーに取り付けます。次に、イメージングチャンバーをイメージングプラットフォームに固定します。続いて、ピペットを用いて20〜30個の膵島をカバーガラスのpoly-d-lysine処理領域に転送し、膵島が表面に接着するまで20分間放置します。

このステップは実験の成功に不可欠であり、20〜30個のアイレットを10 µL未満のバッファーで回収し、20分間待ちます。アイレットの損傷を避けるため、カバースリップを完全に乾燥させないことが重要です。アイレットがカバースリップに接着している間に、水を用いて灌流システムを十分に洗浄し、準備します。

次に、この表に従って、各溶液を異なるチャンネルに加えます。各チャンネルを個別に開き、溶液を数分間流すことで、システム内からすべての気泡を取り除いてください。流量が一定であること、およびチューブに漏れがないことを確認してください。

次に、インライン溶液ヒーターを灌流出口チューブに接続し、流出するバッファーの温度を37 °Cに調整します。その後、吸引ポンプを準備します。チューブを接続してポンプの電源を入れ、液体が吸引されていることを確認してください。

アイレットを載せたイメージングプラットフォームを顕微鏡ステージ上に配置し、灌流システムおよび吸引ポンプに接続します。次に、3 mMのグルコースを含む細胞外液をイメージングチャンバーにゆっくりと満たします。共焦点イメージングを行うために、低倍率で顕微鏡視野内のアイレットを特定します。

島にフォーカスを合わせた後、より高倍率の対物レンズに切り替えます。撮影ソフトウェアを開き、常駐スキャンモードを有効にします。xyztイメージングを選択し、撮影設定を構成するために、アルゴンレーザーをオンにして30%に設定し、次に488 nmのレーザーラインをオンにし、pHluorinの励起に合わせてレーザー出力を約50%に調整します。

EGFPの放出スペクトルを指標として、505から555ナノメートルの範囲で放出光を収集します。解像度は512×512ピクセルに設定してください。ライブボタンを押してイメージングを開始し、ゲインレベルを調整します。

膵島の上端に焦点を合わせて「begin」を選択し、次にフォーカス可能な最後の平面まで移動して「end」を選択することで、zスタックの開始端と終了端を設定します。zスタックのサイズは5 µmに設定してください。各zスタック取得の時間間隔を1.5〜2秒程度に設定し、連続イメージングのために「acquire until stopped」オプションを選択します。

次に、スタートボタンを押してイメージングを開始します。顆粒のエキソサイトーシスを誘導するための刺激プロトコルについては、テキストプロトコルを参照してください。搭載のスキャナーを使用して、アイレットの共焦点画像を2秒未満のタイムラプス録画として取得します。

さらに、この手法は、膜電位や細胞質遊離カルシウム染料などの機能イメージング用染料と組み合わせることが可能です。NP Y-pHluorinがインスリン顆粒のダイナミクスをモニタリングするための適切なツールであるかを確認するため、感染させた島を、NP Y-pHluorinに対するGFP抗体、および島ホルモンであるインスリン、ソマトスタチン、またはグルカゴンに対する抗体で免疫染色しました。NP Y-pHluorinを発現している細胞のほとんどはインスリンも発現していたため、β細胞であることがわかりました。

グルカゴン陽性のアルファ細胞またはソマトスタチン陽性のデルタ細胞のごく一部のみがGFPでラベルされていました。重要な点として、感染細胞においてNP Y融合タンパク質はインスリンと共局在していました。この図は、pHluorinが効果的なpHセンサーであることを示しています。

50 millimolarの塩化アンモニウムを用いて細胞内pHを上昇させると、細胞内蛍光が500%以上増加しました。融合孔の開口に伴い、プラズマメンブレンとの融合によって顆粒内部のpHが上昇するため、塩化カリウムによる膜脱分極などのインスリン放出を刺激する条件下において、NPY-pHluorin含有顆粒が可視化されます。NPY-pHluorinを導入した膵島の共焦点タイムラプスイメージングを用いることで、無傷の膵島内にあるベータ細胞における個々の分泌イベントを視覚化することが可能です。

これらは、塩化カリウムによる直接的な膜脱分極や、その他のいくつかの生理学的刺激に反応して起こります。基底状態の細胞外グルコース濃度では、分泌活性はほとんど観察されません。しかし、高グルコース刺激に反応して、顆粒の細胞膜への融合が誘発されます。

この手順に続き、免疫組織化学などの他の手法を行うことで、細胞の特定の領域でなぜ顆粒融合が起こるのかといった追加の疑問を解明することができます。この手法の開発後、ヒト膵島におけるベータ細胞集団のインスリン顆粒分泌の時間的パターンの探索に利用されています。