体外ラットの結腸求心性線維の電気生理学的特性の評価

このプロトコルの全体的な目標は、in vitroで結腸直腸の感覚神経の電気生理学的記録の方法論を実証することです。この方法は、痛覚過敏を矯正するための外末梌泡性感度の寄与など、in vitro ペン分野で重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、頸動脈の区別がin vivo、動物または患者で行われるのと同様の方法で結腸直腸の区別を可能にすることです。

神経節の位置を特定し、神経を解剖することは比較的難しいため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。この手順を開始するには、メスを使用して腹壁の正中線切開を行うことにより、深く麻酔をかけたラットの腹腔を露出させます。その後、腸間膜や他の組織を脇に引っ張って、結腸直腸を露出させます。

次に、動物を解剖顕微鏡の下に置きます。慎重に解剖することにより、左骨盤神経節を特定し、骨盤神経とそれに結合する腰椎内臓神経を特定します。その後、骨盤神経節から数ミリメートル離れた場所でこれらの神経を切断します。

骨盤神経節の位置を特定し、神経を解剖することは、この手順の最も重要で困難なステップです。次に、結合骨を切開して直腸を露出させます。結腸直腸の上の組織を取り除き、骨盤神経節を無傷のままにしておくように注意してください。

ペントバルビタールの過剰投与の静脈内注射によってラットを犠牲にした後、骨盤神経節の約3センチメートル上の結腸を横断し、鉗子を使用して動物から結腸直腸を取り除きます。続いて、予冷したクレブス溶液で満たされたシャーレに結腸直腸を移します。結腸をやさしく洗い流して糞便を取り除きます。

次に、骨盤神経節を損なうことなく、残りの膀胱やその他の組織を慎重に取り除きます。この手順では、結腸を記録チャンバーに入れ、カルボゲン化クレブス溶液で組織を連続的に大量に使用します。次に、口腔端と肛門端の両方で結腸直腸をカニューレ挿入し、次に口腔から肛門への方向に生理食塩水を含む結腸の管腔内注入を開始し、その後、解剖顕微鏡の下で主要な骨盤神経節を特定し、昆虫ピンを使用して神経節を露出させます。

慎重に解剖して、神経節から発せられ、結腸に向かって走っている神経の細い枝を見つけ、次に、神経節の近くで神経を切断します。次のステップの前に、加熱バスをオンにし、クレブス溶液を摂氏34度に保ちます。次に、事前に引っ張られたガラスピペットを解剖顕微鏡で検査します。

電極の先端を一対の鉗子で折って、記録する神経の直径に適したサイズにします。その後、先端を明るいフレアの近くに置いて面取りします。この方法論に慣れていないと、神経のサイズに合わせて電極の先端を斜角にするのが難しいと感じるかもしれません。

次に、面取りされた電極を電極ホルダーに配置し、10ミリリットルのシリンジをホルダーのサイドポートに接続して、電極に負圧または正圧を加えます。その後、ホルダーをバイオアンプのヘッドステージに接続し、ヘッドステージをマニピュレーターに取り付けます。これに続いて、電極をティッシュバスに移動し、ホルダーの銀線に接触するまで穏やかに吸引して電極にクレブス溶液を充填します。

次に、電極の先端を神経の切り口の近くに置き、負圧を加えて神経を電極に吸い込みます。次に、さらに負圧を加えて、神経の約1ミリメートルが電極に引き込まれ、しっかりと密閉されるようにします。次に、バイオアンプをオンにし、フィルターを300〜3000ヘルツに設定します。

オシロスコープで信号を監視し、スパイクデータ処理ソフトウェアで神経信号と管腔内圧信号を記録します。次に、出口カニューレの三方向タップを閉じて、継続的に管腔内に注入しながら、結腸のランプ膨張を適用します。管腔内圧が60ミリメートル水銀柱に達するまで監視し、次に排水カニューレの三方向タップを開きます。

この手順を15分間隔で繰り返し、求心性神経の化学的感受性をテストするために、薬物を追加または管腔内に適用します。これは、遠位神経から骨盤神経節までの代表的な記録によるex vivoチューブ結腸直腸調製の実験セットアップの概略図です。正常なラットからの調製物では、結腸求心性神経は通常、規則的な自発的活動のレベルが低いです。

結腸のスロープ膨張は、発火率の漸進的な増加を誘発する。各神経の機械感覚特性は、管腔内圧求心性神経応答曲線をプロットすることによって表されます。あるいは、骨盤神経節の近位にある骨盤神経の枝から記録を行うこともできます。

骨盤近位神経の機械感覚活動のプロファイルは、通常、骨盤神経節の遠位神経に見られるものと似ています。マルチユニット記録からの活動電位の波形の主成分分析により、単一ユニットの活動を識別することができます。これは、2つの個々の骨盤心房の重ね合わせられた波形です。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば2時間で完了します。このビデオを見た後、主要な骨盤神経節と他の神経の解剖学的構造を十分に理解し、神経節を特定して神経を解剖し、求心性活動を記録できるようになるはずです。このプロトコルの利点は、骨盤および内臓求心性神経の電気生理学的特性および薬理学的プロファイルの比較を可能にする可能性があることである。