Name: 体外ラットの結腸求心性線維の電気生理学的特性の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 学ぶラットの結腸求心性線維の電気生理学的記録法。骨盤神経節からの神経剥離と機械刺激応答の測定により、内臓痛の神経機構を解明する手法を習得できます。

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このプロトコルは、国家自然科学基金、中国の (#31171066 #81270464) と中国とドイツ科学センター (GZ919) からの研究補助金によって支えられました。

ここで報告した実験的なプロトコルは、動物倫理委員会の上海交通大学医学部 (# SYXK2013-0050) によって承認されているそのまま神経節と神経大腸の解剖。トランクは、この手法ではかなり経験豊富な人のため 15 分の最小値を取る。それ以降の電気生理学的記録のための組織の生存を確保するため、解剖を実行しながら深麻酔下で動物の生きているが、維持が必要です。
 1 灌流液の準備とテスト混合物 <ol>クレブス ソリューションの準備 5 L <li>: 113 mM の NaCl、KCl、1.2 mM NaH 2 PO 4、1.2 mM MgSO 4、5.9 mM NaHCO 3、25 mM 1.2 mM CaCl 2。 と 11.5 mM グルコース。95% O 2 + 5% CO 2 ガス混合ソリューションを飽和させます。冷蔵庫の中に酸素のクレブスの ~ 500 mL をあらかじめ冷たい</li>。
	必要に応じて、株式の <li>準備因数は化合物 (エタノールと 10 mM 5-ヒドロキシトリプタミン (セロトニン) 生理食塩水での 1 mM カプサイシン) をテストします。クレブス (お風呂用) 及び (腔内管理) 用生理食塩水のストックを最終濃度使用する直前に希釈します</li>。
</ol> 2。記録電極の作製 <ol><li>プル標準的なガラスから記録電極チューブ内部のフィラメント (1.5 mm 外径) 従来の電極の引き手を使用してなし。熱のための引き手設定を調整し、引き出し、引っ張られた電極のシャンクは 20 と 25 mm.</li>
</ol> 3。組織コレクション <ol><li>Anaesthetize ラット深くペントバルビ タール ナトリウム (80 mg/kg, i. p.) を使用します。</li> <li>無菌性を確保しながらメスを使用して腹壁の正中切開を実行することによって腹腔内を公開します。腸と大腸を公開する他の組織は脇をプルします</li>。
	<li>は、解剖顕微鏡の下で動物を配置します。慎重な郭清を左の PG を探し、PN とそれに参加する LSN を識別します。これらの神経の項から数ミリをカット 
	注: PG は大腸の交差点近くにあります。PG ( 図 1) を腰仙部脊髄および LSN プロジェクトから通常、3-4 PN</li>。
	<li>は、直腸を公開する恥骨の骨をカットしました。大腸; 上記組織 (すなわち 膀胱等) を削除します。PG をそのまま残すように注意してください</li>。
	<li>は、ペントバルビ タールの過量の静脈内注入によるラットを犠牲します。トランセクト コロン PG の上約 3 cm と鉗子を用いた動物から大腸を削除します</li>。
	<li>は、予冷のクレブス液でいっぱいペトリ皿に大腸を転送します。糞便を削除するには、コロンを優しく洗浄します。残尿膀胱や他の組織を項を損なうことがなく、慎重に削除</li>
</ol> 4。結腸求心性神経の解剖 <ol><li>記録室 (20 mL) にコロンを配置し、carbogenated クレブス ソリューションを継続的に組織を灌流します。15 mL/分で灌流率を設定</li>
	<li>は、口腔と肛門の両端に大腸を cannulate します。アナル方向に口頭で 10 mL/h の速度で生理食塩水で結腸腔内注入を開始します</li>。
	<li>は、解剖顕微鏡の下で主要な PG を探します。昆虫ピンを利用して、神経節を公開します。慎重な郭清を伴う神経神経節から発せられるとコロン ( 図 1) に向かって実行しているの良い枝を見つけます。神経節の近くに神経をカットします 。
	注: 図 1 に示します、PG に末梢神経の枝からの録音神経おそらく骨盤と腰椎の内臓求心性線維が混在しています。PN や、PG に近位の LSN から録音が可能また、</li>
	<li>熱浴と暖かい 34 ± 0.5 ° C でチャンバー内の温度を保つためにクレブス ソリューションをオン</li>
</ol> 5。吸引電極の作製 <ol><li>予ガラス ピペット (手順 2) を取るし、解剖顕微鏡の下で検査します。鉗子のペアで電極の先端を破る記録される神経の径と互換性のあるサイズのだ</li>。
	<li>軽くフレアの近くに配置することによって先端の面取りします</li>。
</ol> 6。電気生理学的記録 <ol><li>接続電極ホルダーに斜め電極。10 mL のシリンジを電極に正または負の圧力を適用するホルダー側ポートに接続します</li>。
	<li>ホルダーを bioamplifier のパッチアンプ用アダプターに接続し、マニピュレーターにパッチアンプ用アダプターをマウントします</li>。
	<li>は、組織お風呂に電極を移動し、ホルダーの銀線接触するまで穏やかな吸引を適用することによってクレブス ソリューションと電極を入力します。神経の断端に近い電極を置き、電極に神経を吸うため否定的な圧力を適用します。否定的な圧力を適用して神経の 〜 1 mm の電極に引かれ、タイトなシールを形成します</li>。
	<li>ターン bioamplifier とセットのフィルター 300 3,000 Hz。 オシロ スコープで信号を監視し、神経信号 (20 kHz のサンプリング レート) とスパイク データの処理にコンピューターを使用して管腔内圧力信号 (100 Hz サンプリング レート) を記録ソフトウェアします</li>。
</ol> 7。結腸求心性感受性検定 継続的に intraluminally を注入しながらコンセント カニューレの 3 ウェイ タップを閉じることによってコロンの <ol><li>適用ランプ膨満。排水のカニューレに 3 ウェイ タップ オープン時 60 mmHg に到達するまでに内圧を監視します</li>。
	<li>15 分適用薬余分な - または求心性神経の化学物質過敏症をテストする intraluminally の一定の間隔でこの手順を繰り返します</li>。
</ol>

<ol><li>Al-Chaer, E. D., Traub, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+basis+of+visceral+pain%3A+recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Biological basis of visceral pain: recent developments.</a> Pain. 96 (3), 221-225 (2002).</li>
<li>Christianson, J. A., Traub, R. J., Davis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+spinal+distribution+and+neurochemical+phenotype+of+colonic+afferents+in+mouse+and+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Differences in spinal distribution and neurochemical phenotype of colonic afferents in mouse and rat.</a> J Comp Neurol. 494 (2), 246-259 (2006).</li>
<li>Wynn, G., Rong, W., Xiang, Z., Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+mechanisms+contribute+to+mechanosensory+transduction+in+the+rat+colorectum%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Purinergic mechanisms contribute to mechanosensory transduction in the rat colorectum.</a> Gastroenterology. 125 (5), 1398-1409 (2003).</li>
<li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairments+of+the+Primary+Afferent+Nerves+in+a+Rat+Model+of+Diabetic+Visceral+Hyposensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pain%22%5BJournal%5D)">Impairments of the Primary Afferent Nerves in a Rat Model of Diabetic Visceral Hyposensitivity.</a> Mol Pain. 11, (2016).</li>
<li>Lynn, P. A., Blackshaw, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+recordings+of+afferent+fibres+with+receptive+fields+in+the+serosa%2C+muscle+and+mucosa+of+rat+colon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">In vitro recordings of afferent fibres with receptive fields in the serosa, muscle and mucosa of rat colon.</a> J Physiol. 518 (Pt 1), 271-282 (1999).</li>
<li>Page, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+contributions+of+ASIC+channels+1a%2C+2%2C+and+3+in+gastrointestinal+mechanosensory+function%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Different contributions of ASIC channels 1a, 2, and 3 in gastrointestinal mechanosensory function.</a> Gut. 54 (10), 1408-1415 (2005).</li>
<li>Hockley, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2Y+Receptors+Sensitize+Mouse+and+Human+Colonic+Nociceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">P2Y Receptors Sensitize Mouse and Human Colonic Nociceptors.</a> J Neurosci. 36 (8), 2364-2376 (2016).</li>
<li>Peiris, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+visceral+afferent+recordings%3A+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Human visceral afferent recordings: preliminary report.</a> Gut. 60 (2), 204-208 (2011).</li>
<li>Feng, B., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+silent+afferents+in+the+pelvic+and+splanchnic+innervations+of+the+mouse+colorectum%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (1), G170-G180 (2011).</li>
<li>Feng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+guanylate+cyclase-C+attenuates+stretch+responses+and+sensitization+of+mouse+colorectal+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents.</a> J Neurosci. 33 (23), 9831-9839 (2013).</li>
<li>Feng, B., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Functional+Characterization+of+Mouse+Colorectal+Afferent+Endings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings.</a> J Vis Exp. (95), e52310(2015).</li>
<li>Nullens, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Recording+of+Mesenteric+Afferent+Nerve+Activity+in+Mouse+Jejunal+and+Colonic+Segments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments.</a> J Vis Exp. (116), (2016).</li>
<li>Rong, W., Hillsley, K., Davis, J. B., Hicks, G., Winchester, W. J., Grundy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jejunalafferent+nerve+sensitivity+in+wild-type+and+TRPV1+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Jejunalafferent nerve sensitivity in wild-type and TRPV1 knockout mice.</a> J Physiol. 560 (Pt 3), 867-881 (2004).</li>
<li>Brierley, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+chemosensory+function+and+receptor+expression+of+splanchnic+and+pelvic+colonic+afferents+in+mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential chemosensory function and receptor expression of splanchnic and pelvic colonic afferents in mice).</a> J Physiol. 567 (Pt 1), 267-281 (2005).</li>
<li>Brierley, S. M., Jones, R. C. 3rd, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splanchnic+and+pelvic+mechanosensory+afferents+signal+different+qualities+of+colonic+stimuli+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice.</a> Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).</li>
<li>La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+expression+of+transient+receptor+potential+channel+V1%2C+transient+receptor+potential+channel+A1+and+mechanosensitive+two+pore-domain+K%2B+channels+between+the+lumbar+splanchnic+and+pelvic+nerve+innervations+of+mouse+urinary+bladder+and+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differences in the expression of transient receptor potential channel V1, transient receptor potential channel A1 and mechanosensitive two pore-domain K+ channels between the lumbar splanchnic and pelvic nerve innervations of mouse urinary bladder and colon.</a> Neuroscience. 186, 179-187 (2001).</li>
<li>Wang, G., Tang, B., Traub, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+processing+of+noxious+colonic+input+by+thoracolumbar+and+lumbosacral+dorsal+horn+neurons+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Differential processing of noxious colonic input by thoracolumbar and lumbosacral dorsal horn neurons in the rat.</a> J Neurophysiol. 94 (6), 3788-3794 (2005).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

ここで提示されたプロトコルは、ラットの結腸求心性神経の電気生理学的特性を評価するために比較的簡単な実験です。(神経記録を設定する組織郭清) からプロトコルを完了する約 2 時間がかかります。組織コレクション (ステップ 3) 吸引電極 (手順 5) の作成は、重要なステップ。PG、LSN、PN を特定し、組織解剖時に神経節と神経を損傷しないように注意することが重要です。ガラス ピペットの先端を壊れたし、神経束と互換性のあるサイズに傾斜する必要があります。
準備はいくつかの時間、通常実行可能な骨、抗癌剤感受性、および大腸の求心性神経の薬理学的プロファイルの研究を可能にします。「フラット シート」準備11、機械的刺激が粘膜をなでるまたは円周方向ストレッチを適用されていると比較してこの「チューブ」準備ランプは、または傾斜のアプリケーションと同様の方法で膨満感大腸の拡張 (CRD) 内臓の痛みを評価するために, 麻酔下または目がさめている動物。同様のプロトコル、ウィンらを使用してください。...

消化管 (GIT の)、豊かな中枢神経系に腸からの感覚信号を伝えることと、腸と脳との対話に貢献する外因性の求心性神経で支配されています。これらの外因性求心性神経の変更された興奮性および求心性入力の変更された中央処理内臓痛と機能と炎症性腸疾患1を含む GI 条件の他の症状に基づいています。大腸からの感覚情報は、主に胸腰椎/下腹と腰仙部/骨盤神経 (PN)2を通じて伝達されます。齧歯動物疾患モデルでこれらの一次求心性線維の電気生理学的性質の研究に関心の高まりがあった。しかし、齧歯動物で結腸求心性神経の電気生理学的記録体内は技術的な課題は、手術のかなりのスキルが必要です。さらに、血行動態、組織の動き、および麻酔薬も影響を与えます神経活動と体内の刺激テストする感度。したがって、近年、研究の増加する数は生体外で(前のヴィヴォ) 準備人間、モルモット、マウス、ラットなど種の結腸における感覚情報伝達のメカニズムを調べるを採用しました。求心性神経と病気の条件に変更された興奮性。3,4,5,6,7,8
前のヴィヴォ下部消化管手術の 2 種類が主に報告されている:「フラット シート」準備5,9,10 「チューブ」準備3,4。「フラット シート」マウス大腸準備のためビデオ プロトコルは、以前に発行された11をされています。このプロトコルはマウス大腸、pn) で接続、腰部の内臓神経 (LSN) は収穫と隔組織の商工会議所または。大腸は縦、切り開かれ、神経束は、パラフィン オイルが充填された記録のコンパートメントに拡張されます。モノポーラ プラチナ イリジウム電極を用いた神経活動が記録されます。プロトコルは個々 の求心性線維の受容野の同定のため公平な電気刺激によることができます。それは化学的刺激のアプリケーションだけでなく、異なる機械的刺激パラダイムのアプリケーションをローカライズする (例えば、焦点粘膜プロービングと円周方向引張)、求心性神経終末へ。神経は、組織室から別の部屋に拡張する必要があります、ので比較的長い; 添付の神経を維持する重要です。神経の正常解剖この方法に新しいものに問題が生じます。最近では、Nullensらは、マウスの腸と大腸セグメント12求心系の腸間膜の培養記録用ビデオ プロトコルを公開しました。この「チューブ」準備の添付腸間膜を持つ腸セグメントはそのままに、こうして傾斜膨満感と異なる化学物質の内、余分な内腔の管理を可能にする保持されます。組織の近くに置くことができる、吸引電極を用いた腸間膜神経が記録されますので、腸間膜神経は比較的短いにもかかわらず、求心性活動を記録できます。しかし、腸間膜神経が腸を支配する迷走神経および脊髄の求心性線維の混合集団の構成や胸腰椎下腹。腰部骨盤求心性神経は、このプロトコルで差別されることはできませんが大腸を刺激する.ここでは、そのままのページで「チューブ」大腸製剤を用いたラット結腸求心性神経の電気生理学的記録のための詳しいプロトコルを提案します。この方法は内臓腰椎の機能特性の評価ができる (下腹) と腰仙部骨盤求心性神経。

<table><tbody><tr><td>ナトリウム ペントバルビタール</td><td>上海 Westang Bio-Tech</td><td>B558</td><td></td></tr><tr><td>カプサイシン</td><td>Σ</td><td>M2028</td><td></td></tr><tr><td>電極プーラー</td><td>MicroData Instrument Inc</td><td>PMP107</td><td></td></tr><tr><td>Neurolog System (Bioamplifier)</td><td>Digitimer, Ltd</td><td>Neurolog System</td><td></td></tr><tr><td>A/D converter</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td>Micro1401</td><td></td></tr><tr><td>データ処理ソフトウェア</td><td>ケンブリッジ電子設計</td><td>Spike2 version 6</td><td></td></tr><tr><td>銀線</td><td>ワールド精密機器</td><td>EP12</td><td></td></tr><tr><td>ガラス管</td><td>ワールド精密機器</td><td>1B150-4</td><td></td></tr><tr><td>電極ホルダー</td><td>ワールド精密機器</td><td>MEH3SBW</td><td></td></tr><tr><td>加熱バス</td><td>グラン</td><td>ト GR150</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>ズーム2000</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ワールド精密機器</td><td>PZMIII-BS</td><td></td></tr><tr><td>シガレットライター</td><td>任意の</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>手術器具</td><td>ワールド精密機器</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>昆虫ピン</td><td>0.1mmステンレス製の</td>自家製 <td>NA</td><td></td></tr><tr><td>三方マニピュレーター</td><td>ワールド精密機器</td><td>KITF-R</td><td></td></tr><tr><td>ラット</td><td>Any</td><td>NA</td><td>ひずみ・性別は問いません。</td></tr></tbody></table>

体外ラットの結腸求心性線維の電気生理学的特性の評価

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

大腸の感覚神経の機能不全は、いくつかの一般的な条件、機能と炎症性腸疾患、糖尿病などの病態に関与しています。ここでは、ラットの結腸求心性神経の電気生理学的特性の in vitro評価プロトコルについて述べる。アタッチすると、そのまま骨盤神経節 (PG) と、大腸がラット;隔 carbogenated 録音室でクレブス ソリューション膨満感を許可する口腔と肛門の端に ● キャニュレイテッド。PG から発せられる細かい神経束が識別され、吸引電極を用いたニューロン求心性神経活動が記録されます。大腸のセグメントの膨満は、ニューロンの放電の漸進的な増加を引き出します。主成分分析は、低閾値、高しきい値、広ダイナミック レンジの求心性線維を区別するために行われています。テスト混合物のバスタブまたは腔内投与による結腸求心性神経の化学物質過敏症を学ぶことができます。このプロトコルは、他の種、マウスやモルモットなどと正常で下行結腸の胸腰椎/下腹と腰仙部/骨盤求心性神経の電気生理学的特性の差異を検討するためにアプリケーションで変更できるし、病理学の条件。

図 1は、前のヴィヴォ「チューブ」大腸の準備に、PG に遠位神経から記録担当者と実験装置の模式図神経は、骨盤、腰椎の内臓求心性神経の混合物をおそらく含まれています。正常ラットから標本、結腸求心性神経は通常不規則な自発活動の低レベルを持ってください。コロンのランプを膨満感は、発火率 (図 1 b) の緩やかな増加を誘発します。それぞれの神経の機械刺激受容プロパティは、腔圧求心性神経応答曲線 (図 1) をプロットによって表されます。平均圧力応答曲線グループ間で比較することができます (すなわち、対コントロール治療) 治療が「栄ら結腸求心性神経の機械刺激受容プロパティを変更どうかを明らかにするには13圧力求心性応答曲線の詳細については)。
<p class="jove_content" fo...

感覚機能の異常は、内臓の痛みや機能および炎症性腸病気の他の症状に基づいています。に備えて、前のヴィヴォラット大腸結腸求心性神経の電気生理学的記録のためのプロトコルを次に示します。

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...

本プロトコルの全体的な目的は、結腸直腸の感覚神経におけるin vitroでの電気生理学的記録の手法を実証することです。この手法は、結腸直腸の痛覚過敏に対する外周性遠心性神経の感受性の寄与など、in vitro分野における重要な疑問の解明に役立ちます。この技術の主な利点は、動物または患者におけるin vivoでの頸動脈刺激と同様の方法で、結腸直腸への刺激が可能になることです。神経節の特定と神経の解離は比較的困難であるため、本手法の視覚的なデモンストレーションが極めて重要です。この手順を開始するには、メスを用いて腹壁に正中切開を行い、深く麻酔したラットの腹腔を露出させます。その後、腸間膜やその他の組織を脇に寄せ、結腸直腸を露出させます。次に、動物を解剖顕微鏡下に置きます。慎重に解剖を行い、左骨盤神経節を特定し、そこに結合している骨盤神経および腰腹腔神経を確認します。その後、これらの神経を骨盤神経節から数ミリ離れた位置で切断します。骨盤神経節の特定と神経の剥離は、本手順において最も重要かつ困難な工程です。次に、恥骨結合を 절断して直腸を露出させます。結腸直腸上の組織を除去し、骨盤神経節を損傷させないよう注意してください。ペントバルビタールの過剰量を静脈内投与してラットを安楽死させた後、骨盤神経節から約3 cm上の結腸を切断し、ピンセットを用いて結腸直腸を動物から摘出します。その後、結腸直腸をあらかじめ冷却したKrebs液を満たしたペトリ皿に移します。結腸を穏やかに洗浄し、糞便を除去します。次に、骨盤神経節を損傷しないよう注意しながら、残存する膀胱およびその他の組織を慎重に取り除きます。この手順では、結腸を記録チャンバー内に配置し、カルボゲン飽和Krebs溶液で組織を連続的に灌流させます。続いて、結腸の口側端と肛門側端の両方をカニュレーションし、口側から肛門側に向かって生理食塩水による管腔内注入を開始します。その後、解剖顕微鏡下で主骨盤神経節を特定し、昆虫ピンを用いて神経節を露出させます。慎重に解剖し、神経節から出て結腸に向かって伸びている細い神経枝を見つけ、神経節の近くでその神経を切断します。次のステップに進む前に、恒温槽のスイッチを入れ、Krebs液を34 °Cに保ちます。次に、解剖顕微鏡の下で、あらかじめ引き出したガラスピペットを点検します。ピンセットで電極の先端を折り、記録対象となる神経の直径に適合するサイズにします。その後、ライターの炎に近づけて先端を面取りします。この手法に不慣れな場合、神経のサイズに合わせた電極先端の面取りを行うのが難しいことがあります。次に、面取りされた電極を電極ホルダーに装着し、電極に負圧または正圧を加えるために、ホルダーのサイドポートに10 milliliterのシリンジを接続します。その後、ホルダーをバイオアンプリファイアのヘッドステージに接続し、ヘッドステージをマニピュレーターに取り付けます。続いて、電極を組織バスまで移動させ、ホルダーの銀線に到達するまで緩やかに吸引し、電極内をKrebs溶液で満たします。次に、電極の先端を切断した神経端の近くに配置し、陰圧をかけて神経を電極内に吸引します。さらに陰圧を強め、神経を約1 mm電極内に引き込み、密閉（シール）させます。ここで、バイオアンプの電源を入れ、フィルターを300〜3,000 Hzに設定します。オシロスコープで信号を監視し、スパイクデータ処理ソフトウェアにて神経信号と管腔内圧信号を記録します。次に、管腔内へ連続的に注入しながら、流出カニューレの三方活栓を閉じて結腸にランプ伸展を加えます。管腔内圧が60 millimeters mercuryに達するまで監視し、その後、排出カニューレの三方活栓を開きます。この手順を15分間隔で繰り返し、薬剤を管外または管腔内に投与して、求心性神経の化学的感受性を試験します。以下は、ex vivo結腸直腸管標本の実験セットアップの概略図と、骨盤神経節より遠位の神経からの代表的な記録です。正常ラットの標本において、結腸求心性神経は通常、低いレベルの規則的な自発活動を示します。結腸を段階的に拡張させると、発火率が緩やかに上昇します。各神経の機械受容特性は、管内圧に対する求心性神経反応曲線をプロットすることで示されます。あるいは、骨盤神経節に近い骨盤神経の枝から記録を行うことも可能です。近位骨盤神経の機械刺激受容活性のプロファイルは、通常、骨盤神経節より遠位の神経で見られるものと同様です。マルチユニット記録から得られた活動電位の波形に対して主成分分析を行うことで、シングルユニット活性を識別できます。ここでは、2つの個別の骨盤求心性神経の重ね合わせ波形を示します。この手技を習得すれば、適切に実施することで2時間で完了させることができます。このビデオを視聴することで、主要な骨盤神経節およびその他の神経の解剖学的構造を十分に理解し、神経を解剖して求心性活動を記録するために神経節を特定できるようになるはずです。このプロトコルの利点は、骨盤求心性神経と内臓求心性神経の電気生理学的特性および薬理学的プロファイルの比較が可能になる点にあります。

in-vitro-characterization-electrophysiological-properties-colonic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオは、ex-vivoラット結腸の結腸求心性神経の活動を記録する方法を示しています。このビデオは、両端にカニューレを挿入し、生理食塩水を注入して管腔内圧を上昇させる方法を示しています。圧力が上昇すると、神経信号が上昇し、その刺激を示します。...

Ex Vivoラット結腸における結腸求心性神経からの電気生理学的記録

このビデオは、解剖されたマウス空腸セグメントで腸間膜求心性神経からの電気信号を記録するプロセスを示しており、組織の圧力と運動の変化が求心性神経活動に及ぼす影響を研究しています。...

Ex Vivoマウス空腸セグメントにおける腸間膜求心性神経活動の記録

このビデオは、ラットのC線維神経伝導の単線維記録を示しています。麻酔をかけたラットを切開して坐骨神経を露出させ、下肢に感覚と運動の供給を提供します。その後、個々のCファイバーが露出します。足に埋め込まれた刺激電極を用いて電気刺激を行い、1本の神経線維から反応を記録します。...

ラットの坐骨神経C線維のin vivo単線維記録

出典:Fried, D. E., Gulbransen, B. D.In Situ Ca2+ 腸神経系のイメージング J. Vis. Exp.

マウス大腸筋神経叢における腸内ニューロンとグリア活性のカルシウムイメージング

出典: Lai, J., et al. げっ歯類脳における電気生理学的記録と抑制剤のマイクロインジェクションの同時投与J. Vis.

ラットにおける神経活動の阻害とその電気生理学を用いた検出

腸神経系のニューロンおよびグリア成分を直接研究するための細胞培養プロトコルを実演します。成体マウスの筋神経叢から、電気生理学、免疫組織化学などにより個々のニューロンとグリアの機能を調べる能力を提供する、カバースリップ上のニューロン/グリア混合培養物。...

不定冠詞<em&gt;インビトロ</em成体マウスの筋層間神経叢から分離腸ニューロンとグリアの&gt;準備

このビデオは、in vitroマウスの結腸直腸神経製剤で単繊維電気生理学的記録を行うためのプロトコルを示しています。...

マウス大腸求心性終末の体外機能解析では、

腸間膜求心性神経は、正常な恒常性と病態生理学に関する情報を消化管から脳に伝えます。胃腸求心性神経活動は、求心性神経が付着した孤立した腸管セグメントを臓器浴に取り付け、神経を分離し、基礎活動と刺激活動を評価することで評価できます。...

マウス空腸および結腸セグメントにおける腸間膜求心性神経活動のin vitro記録で

軸索興奮性のテクニックは、病態と不可逆的な変性イベントの前に生体の変化を調べるための強力なツールを提供します。この原稿は、麻酔下ラットの尺骨神経のこれらのテクニックの使用方法を示します。...

生体内で軸索興奮性のテストでラットの尺骨神経の電気生理学的測定

シングルファイバー記録は、中枢および末梢神経系に適用可能な効果的な電気生理学的手法である。付着した坐骨神経を持つ無傷のDRGの調製と共に、伝導障害のメカニズムが調べられる。両方のプロトコルは、末梢神経系と痛みとの関係の理解を向上させます.

インビボシングルファイバー記録と無傷の後部根神経を用いて伝導障害のメカニズムを調べる

学ぶラットの結腸求心性線維の電気生理学的記録法。骨盤神経節からの神経剥離と機械刺激応答の測定により、内臓痛の神経機構を解明する手法を習得できます。

体外ラットの結腸求心性線維の電気生理学的特性の評価

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