Name: 生産、結晶化、および人間 IKK1/α の構造決定へのガイド (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: 学ぶ人間IKK1/αの生産・結晶化・構造決定手法。昆虫細胞発現と分子置換法を用いた構造生物学的手法で、免疫シグナル伝達の機構解明と創薬プラットフォーム構築に貢献します。

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ビームライン 19ID、24ID、および様々 な結晶でのデータ収集の間にサポートのための高度な光子源、レモント、イリノイ州で 13ID でスタッフに感謝いたします。EM 地図/モデルの構築、初期 IKK1 分子置換検索モデルの作成に使用された初期の段階での低分解能の低温電子顕微鏡マップを取得私たちのドミトリー ・ Lyumkis、ソーク研究所に感謝しております。これらの結果につながる研究は、GG に NIH 助成金 AI064326、CA141722、および GM071862 から資金を受けています。SP は、Wellcome の信頼 DBT インド中間。

<ol><li>Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB%2C+an+active+player+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+immunology+research%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB, an active player in human cancers.</a> Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).</li>
<li>Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity%2C+inflammation%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Immunity, inflammation, and cancer.</a> Cell. 140 (6), 883-899 (2010).</li>
<li>Ben-Neriah, Y., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+meets+cancer%2C+with+NF-kappaB+as+the+matchmaker%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker.</a> Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).</li>
<li>Hinz, M., Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IkappaB+kinase+complex+in+NF-kappaB+regulation+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond.</a> EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).</li>
<li>Karin, M., Ben-Neriah, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+meets+ubiquitination%3A+the+control+of+NF-%5Bkappa%5DB+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity.</a> Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).</li>
<li>Ghosh, S., Karin, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11983155">Missing pieces in the NF-kappaB puzzle.</a> Cell. 109, Suppl . S81-S96 (2002).</li>
<li>Sun, S. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22435551">The noncanonical NF-kappaB pathway.</a> Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).</li>
<li>Bonizzi, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+NF-kappaB+activation+pathways+and+their+role+in+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity.</a> Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).</li>
<li>DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytokine-responsive+IkappaB+kinase+that+activates+the+transcription+factor+NF-kappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB.</a> Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).</li>
<li>Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus+specificity+of+gene+expression+programs+determined+by+temporal+control+of+IKK+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity.</a> Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).</li>
<li>Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IkappaB+kinase+complex+%28IKK%29+contains+two+kinase+subunits%2C+IKKalpha+and+IKKbeta%2C+necessary+for+IkappaB+phosphorylation+and+NF-kappaB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation.</a> Cell. 91 (2), 243-252 (1997).</li>
<li>Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IKK-gamma+is+an+essential+regulatory+subunit+of+the+IkappaB+kinase+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex.</a> Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).</li>
<li>Yamaoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementation+cloning+of+NEMO%2C+a+component+of+the+IkappaB+kinase+complex+essential+for+NF-kappaB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation.</a> Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).</li>
<li>Li, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IKKbeta+subunit+of+IkappaB+kinase+%28IKK%29+is+essential+for+nuclear+factor+kappaB+activation+and+prevention+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis.</a> J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).</li>
<li>Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+principles+in+NF-kappaB+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Shared principles in NF-kappaB signaling.</a> Cell. 132 (3), 344-362 (2008).</li>
<li>Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+nuclear+factor-kappaB+in+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity.</a> Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).</li>
<li>Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAFF-induced+NEMO-independent+processing+of+NF-kappa+B2+in+maturing+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells.</a> Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).</li>
<li>Senftleben, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+by+IKKalpha+of+a+second%2C+evolutionary+conserved%2C+NF-kappa+B+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway.</a> Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).</li>
<li>Coope, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100+to+p52%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52.</a> EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).</li>
<li>Dejardin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lymphotoxin-beta+receptor+induces+different+patterns+of+gene+expression+via+two+NF-kappaB+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways.</a> Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).</li>
<li>Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+p100+processing+by+NF-kappaB-inducing+kinase+involves+docking+IkappaB+kinase+alpha+%28IKKalpha%29+to+p100+and+IKKalpha-mediated+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation.</a> The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).</li>
<li>Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB-inducing+kinase+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100.</a> Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).</li>
<li>Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+basally+translated+NF-kappaB-inducing+kinase+%28NIK%29+protein+functions+as+a+molecular+switch+of+processing+of+NF-kappaB2+p100%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100.</a> J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).</li>
<li>Zarnegar, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncanonical+NF-kappaB+activation+requires+coordinated+assembly+of+a+regulatory+complex+of+the+adaptors+cIAP1%2C+cIAP2%2C+TRAF2+and+TRAF3+and+the+kinase+NIK%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).</li>
<li>Vallabhapurapu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonredundant+and+complementary+functions+of+TRAF2+and+TRAF3+in+a+ubiquitination+cascade+that+activates+NIK-dependent+alternative+NF-kappaB+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).</li>
<li>Annunziata, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+engagement+of+the+classical+and+alternative+NF-kappaB+pathways+by+diverse+genetic+abnormalities+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma.</a> Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).</li>
<li>Keats, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promiscuous+mutations+activate+the+noncanonical+NF-kappaB+pathway+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma.</a> Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).</li>
<li>Staudt, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+activation+of+NF-kappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+perspectives+in+biology%22%5BJournal%5D)">Oncogenic activation of NF-kappaB.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109(2010).</li>
<li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+basis+for+IkappaB+kinase+2+activation+via+oligomerization-dependent+trans+auto-phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation.</a> PLoS Biol. 11 (6), e1001581(2013).</li>
<li>Hinz, M., Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IkappaB+kinase+complex+in+NF-kappaB+regulation+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond.</a> EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).</li>
<li>Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IkappaB+kinase+complexes%3A+gateways+to+NF-kappaB+activation+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription.</a> Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).</li>
<li>Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+infectious+recombinant+baculoviruses+by+site-specific+transposon-mediated+insertion+of+foreign+genes+into+a+baculovirus+genome+propagated+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli.</a> J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).</li>
<li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Basis+for+the+Activation+of+IKK1%2Falpha%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha.</a> Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).</li>
<li>Otwinowski, Z. aM., W, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+X-ray+Diffraction+Data+Collected+in+Oscillation+Mode%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode.</a> Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+human+IkappaB+kinase+beta+asymmetric+dimer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological+crystallography%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li>
<li>McCoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?he5368">Phaser crystallographic software.</a> Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li>
<li>Vagin, A. T., Teplyakov, A. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?li5010">MOLREP: an automated program for molecular replacement.</a> J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).</li>
<li>Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Version+1.2+of+the+Crystallography+and+NMR+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Version 1.2 of the Crystallography and NMR system.</a> Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).</li>
<li>Brunger, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallography+%26+NMR+system%3A+A+new+software+suite+for+macromolecular+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological%22%5BJournal%5D)">Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).</li>
<li>McRee, D. E. <a target="_blank" href="http://www.iucr.org/__data/assets/pdf_file/0010/8983/dem.pdf">XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview.</a> J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).</li>
<li>Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+biomolecular+crystallography+with+low-resolution+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data.</a> Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).</li>
<li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+basis+for+IkappaB+kinase+2+activation+via+oligomerization-dependent+trans+auto-phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation.</a> PLoS biology. 11 (6), e1001581(2013).</li>
<li>Christopher, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+discovery+of+2-amino-3%2C5-diarylbenzamide+inhibitors+of+IKK-alpha+and+IKK-beta+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+medicinal+chemistry+letters%22%5BJournal%5D)">The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases.</a> Bioorganic & medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).</li>
<li>Karplus, P. A., Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+crystallographic+model+and+data+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Linking crystallographic model and data quality.</a> Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).</li>
<li>Chen, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MolProbity%3A+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological+crystallography%22%5BJournal%5D)">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).</li>
</ol>

著者はない競合する金銭的な利益やその他の利害の関係を宣言します。

2 つの関連する IKK タンパク質の生産、結晶化・構造ソリューション IKK2/β タンパク生産、結晶化、構造決定と私たちの経験を与えられる比較的簡単な運動であろう概念と IKK1/α の x 線結晶構造を決定するのに着手しました。ただし、我々 はこれら 2 つの関連蛋白質は結晶化のしやすさに関する非常に異なる振る舞いこと非常に驚いていた。いくつかの知名度の高い所から努力にもかかわらず、IKK1 構造の決定はほぼ 2 年を取った。これは主にいくつかのキーのボトルネックから生じた。
最初の難関は、高純度、可溶性タンパク質のフォームを入手していた。昆虫細胞発現系には、合理的に水溶性だった純粋な蛋白質の mg 量を得ることが有効になります。表現のレベルに関してすべての IKK1/α 構造を IKK2/β を昆虫細胞発現系の構築よりもはるかに低いレベルで表明しました。可溶性で, 大腸菌で発現と機能性どちらもタンパク質であることに注意してください。昆虫の細胞表現システム、IKK2/β 断片 10 〜 30 mg/L、構造に応じて文化...

二量体転写因子の NF κ B 家族の転写活性は、炎症と免疫生存と死に至るまで多様な細胞機能に必要です。これらの活動は、細胞と自己免疫疾患や癌1,2,3を含む様々 な病理学の条件に規制つながるの損失に厳しく制御されます。刺激がないと、NF-κ B の活性抑制 IκB (κ B の阻害剤) 蛋白質4で保持されます。IκB タンパク質特定 Ser 残基のリン酸化ユビキチン化とそれに続くプロテアソームまたは選択的処理5のマークを付けます。セリン/スレオニンの 2 つの高い相同性キナーゼ IKK2/β と IKK1/α はこれらのリン酸化イベント6、7の遂行によって NF-κ B の活動の調節因子として機能します。
リガンドと受容体の相互作用は、一連の仲介因子 NF-κ B の活性化につながる信号をペリプラズムします。NF-κ B シグナル伝達プロセスは、2 つの異なる経路-正規と非正規 (代替)8に広く分類できます。IKK2/β の活動は主に、炎症性と生得免疫応答9に不可欠な標準的な経路の NF-κ B シグナル伝達を調節します。この経路の特徴はこれまで生化学メタボライト IKK 複雑な内 IKK2/β10の迅速かつ短時間活性化-IKK1、IKK2、規制成分、ネモ (NF-κ B 重要な変調器で構成されると推定)11,12,13。IKK 複合体の 2 つの触媒 IKK サブユニット、間 IKK2 主担当です14原型 IκBs (α ・ β ・ γ) の特定の残基のリン酸化のため NF-κ B とも非定型の IκB 蛋白質にバインド NF-κB1/p105 である、NF-κ B p50 サブユニット5の前駆体。リン酸化によるユビキチンとプロテアソームの IκB (または p105 の処理) がリリースと NF-κ B 二量体15の特定のセットの活性化に 。IKK2 の誤規制機能による異常な NF-κ B 活性は、自己免疫疾患2,3,16のように同様に多くの癌で観察されています。
IKK2/β と対照をなして IKK1/α の活動は、NF-κ B が開発と耐性のために不可欠である非正規の経路のシグナル伝達を調節します。IKK1 は、C 末端 IκBδ のセグメントについては、その処理と p52 の生成につながる NF-κB2/p100 の特定残基を廃止します。転写活性状態 p52:RelB ヘテロダイマーの形成発達信号7,17,18,19,20をゆっくりと持続的な応答を開始します。興味深いことに、この経路の中央 NF-κ 係数 p52 の世代はもう一つの要因は、NF-κ B を誘発するキナーゼ (NIK)21,22ではなく、IKK2 またはネモに大きく依存します。静止期細胞のニックのレベルがその一定のプロテアソーム依存低下23,24,25により低いまま。'非正規' の配位子と特定の悪性の細胞で細胞の刺激、ニック化を採用して IKK1 をアクティブにするが安定/ニック ・ IKK1 α キナーゼ活動が p527に p100 の効率的な処理に不可欠であります。IKK1 とニックはに対する 3 セリン (Ser866、870 と 872) NF-κB2/p100 の処理と p52 の世代につながる、C 末端 IκBδ セグメント上です。非正規の経路の異常な活性化は、多発性骨髄腫26,27,28を含む多くの癌に関与しています。
IKK2/β のいくつかの非常に効率的かつ特定阻害剤が知られているが、どれもはこれまで有効な薬剤であると判明しています。対照的に、IKK1/α-特定の阻害剤は、まばら。これは、部分的に構造および生化学的 IKK1/α、セル、および合理的な薬剤設計の IKK1 によって NF-κ B の活性化の機構の基礎を理解することについての私達の欠如から幹があります。IKK2/β の x 線構造は、IKK2/β29; の活性化機構への洞察を提供してくれましたしかし、これらの構造がどのように異なる上流の刺激を明らかに IKK1/α または IKK2/β NF-κ B 活動30,31の異なるセットを規制するためのアクティブ化をトリガーします。IKK1/α の異なるシグナル伝達関数の基になる機構の基礎を理解して、合理的な薬剤設計のためのプラットフォームを確立するには、我々 は IKK1/α の構造決定に焦点を当てた。

<table><tbody><tr><td>Cellfectin/Cellfectin II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10362100</td><td>Cellfectinは現在製造中止となり、Cellfectin II</td></tr><tr><td>Sf900 III昆虫細胞培地</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12658-027</td><td></td></tr><tr><td>SF9</td>細胞 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Scientific 12659017</td><td></td></tr><tr><td>抗IKK1抗体</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-56704</td><td>以前はImgenexが販売していました</td></tr><tr><td>抗ペンタHis 抗体</td><td>キアゲン</td><td>34460</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 膜</td><td>ミリポア</td><td>IPVH00010</td><td>ニトロセルロース ニトロセルロース ニトロセルロース</td></tr><tr><td>Ni-NTA アガロース</td><td>キアゲン</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>ブラッドフォード アッセイ試薬</td><td>BioRad</td><td>500001</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 カラム</td><td>GE ヘルスケア</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>アミコン コンセントレーター</td><td>ミリポア</td><td>UFC801008、UFC803008、UFC201024、UFC203024</td><td></td></tr><tr><td>化合物A</td><td>バイエル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カルビオケム IKK-inhibitor XII</td><td>カルビオケム</td><td>401491</td><td></td></tr><tr><td>スタウロスポリン</td><td>SIGMA</td><td>S4400</td><td></td></tr><tr><td>MLN120B</td><td>ミレニアム</td><td>ギフトアイテム</td><td></td></tr><tr><td>AMPPNP</td><td>SIGMA</td><td>A2647</td><td></td></tr><tr><td>デキストラン硫酸塩</td><td>SIGMA</td><td>51227、42867、31404、</td><td></td></tr><tr><td>Dextran sulfate</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62101</td><td></td></tr><tr><td>PEG</td><td>SIGMA</td><td>93593、81210、88276、95904、81255、89510、92897、81285、95172</td><td>それらのいくつかは、SIGMAカタログの新しいCat#です。私たちが持っていたのは、もともと猫#が違うフルカからのものでした。</td></tr><tr><td>結晶化スクリーン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>クリスタルスクリーンIおよびII(クリスタルスクリーンHT)</td><td>ハンプトンリサーチ</td><td>HR2-130</td>インデックスHTハンプトンリサーチHR2-134 PEG /イオンおよびPEG/イオン2(PEG /イオンHT)ハンプトンリサーチHR2-139 PEGRX 1およびPEGRx 2(PEGRx HT)ハンプトンリサーチHR2-086 SaltRx 1およびハンプトンリサーチHR2-139 PEGRX 1およびPEGRx 2(PEGRx HT)ハンプトンリサーチHR2-086 SaltRx 1およびハンプトンリサーチHR2-130<td></td></tr>インデックス<tr><td></td><td></td><td></td>HT <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SaltRx 2 (SaltRx HT)</td><td>ハンプトンリサーチ</td><td>HR2-136</td><td></td></tr><tr><td>クリスタルマウントハ</td><td>ンプトンリサーチ</td><td>HR8-188、190、192、194</td><td></td></tr><tr><td>シンクロトロン</td><td>米国エネルギー省の高度な光子源(APS)s アルゴンヌ国立研究所</td><td>ビームライン 19 ID</td><td>The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy'アルゴンヌ国立研究所は、ほぼすべての科学分野の研究に、超高輝度で高エネルギーの蓄積リング生成X線ビームを提供しています。</td></tr></tbody></table>

生産、結晶化、および人間 ikk1/α の構造決定へのガイド

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

細胞外刺激のクラスには、NF-κ B サブユニット、p52、その前駆体の p100 の処理による生成を誘導する IKK1/α の活性化が必要です。p52 ホモまたはヘテロダイマー別 NF-κ B サブユニット、RelB ととして機能します。これらの二量体はターンでは何百もの炎症、細胞生存率、細胞周期に関与する遺伝子の発現を調節します。IKK1/α 三元複合体として主に IKK2/β とネモに関連付けられたままです。しかし、それの小さなプールがまた低分子量 complex(es) として観察されます。P100 処理アクティビティが大きく内 IKK1/α の活性化または小さい複雑なプールによってトリガーされる場合は不明です。IKK1/α の構成アクティビティがいくつかの癌や炎症性疾患で検出されました。IKK1/α の活性化のメカニズムを理解し、創薬のターゲットとしての使用を有効にする、我々 は大腸菌など、別のホスト システムでの組換え IKK1/α を表明した昆虫および哺乳類細胞。成功したバキュロ ウイルスで水溶性 IKK1/α を表現する感染昆虫細胞、非常に純粋な蛋白質の mg 量を取得、阻害剤の存在下で結晶化、x 線結晶構造を決定します。ここでは、組換えタンパク質、その結晶の x 線結晶構造解析を生成する詳細な手順について述べる。

IKK1/α の異なる構造体のクローニングと発現 タグ付き IKK1 の N 末端ヘキサ ヒスチジンを取得するその EcoRI とノッティ制限サイト内バキュロ ウイルス発現ベクター pFastBacHTa に人間 IKK1/α のクローンだった完全な長さ。タグは、TEV プロテアーゼ消化によって削除でした。全長 IKK1/α に両端に柔軟な地域が含まれているので、柔軟な地域によってレンダリングに蛋白質通常結晶化することは困難私達 IKK1/α pFastBacHTa ベクトルの上記サイト内の様々 な切り捨てられた断片のクローン作成。IKK1/α のトランケーション変異は、野生型 (wt) と S176E、180E 生成された (EE) バックボーン。IKK1/α EE はリン酸キナーゼの恒常活性フォームの擬態を指します。組換えバキュロ ウイルスの生産と蛋白質の表現をマイナーな修正43 (図 1) で以前に公開されたプロトコルを...

IκB キナーゼ 1/α (IKK1/α CHUK) は主に転写因子の NF-κ B の活性化を介して細胞活動の無数に関係するセリン/スレオニン蛋白質キナーゼ。ここでは、生産、この蛋白質の結晶構造解析に必要な主な手順について述べる。

生産、結晶化、および人間 IKK1/α の構造決定へのガイド

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

この手順の目的は、シグナル伝達機能の機構基盤を理解し、合理的な薬物設計のためのプラットフォームを確立するために、ヒトIKK1-αの生産、結晶化、構造決定のためのガイダンスを提供することです。この方法は、研究者が免疫シグナル伝達の分野で主要なクエリへの答えを提供するIKK1の構造を決定するのに役立ちます。この技術は、結晶化に対して難治性であり、構造を決定する際のボトルネックを克服する上で様々な重要な情報を提供するIKKタンパク質の結晶を得るための合理化された経路を記述する。一般的に、この方法に新しい個人は、可溶性の、行き届いたタンパク質のミリグラム量を生成するので、昆虫細胞でその発現を必要とし、結晶化は非常に狭い条件の窓の下でのみ行うことができるので、苦労します。IKK1の構造を決定する際に使用される分子置換手順は、特に結晶の偏向特性が悪いため、適切な検索モデルがない場合に多くのIKK1分子を含む非対称ユニットの部位ではなく、非常に難しい場合があります。手順を実証するには、カイル・シュマテとソンジアラ・ホッチキス(私の研究室の学生)がいます。1日目には、Sf903昆虫細胞培地2ミリリットルのSf9細胞を6ウェルプレートの各ウェルにプレートし、摂氏27度でインキュベートする。細胞を2~3倍の密度に達すると、1ミリリットル当たり6個の細胞を新鮮な培地に希釈し、約6倍の濃度で5個まで通過する。2日目には、SF-903またはグレースの昆虫培地の100マイクロリットルにSf9トランスフェクション試薬の8マイクロリットルを希釈します。その後、混合物を短時間渦液します。別のチューブで、同じ媒体の100マイクロリットルにキット精製組換えバクミドの1マイクログラムを希釈します。希釈したDNAとトランスフェクション試薬を組み合わせます。室温で15~30分間インキュベートした後、ウェルから培地を取り出します。その後、新鮮な媒体の1ミリリットルを追加します。次に、希釈したDNAトランスフェクション試薬混合物を細胞上に滴下して添加し、接着細胞を外さないようなドロップサイズを調整する。6時間後、細胞の上に新鮮な培地を1.5ミリリットル加えます。細胞を摂氏27度でインキュベートし、ウイルス感染の兆候がないか12時間ごとに定期的に井戸をチェックする。5日目に、感染後60〜72時間の細胞を含む培地を取り除く。培地をチューブに移した後、500倍gと摂氏4度で5分間遠心分離機。終了したら、P1ウイルススタックである上清を保存します。1日目に、以前に調製したHis-IKK1細胞ペレットを40ミリリットルのリシスバッファーに再中断する。細胞懸濁液を氷の上に置き、60%〜70%のデューティサイクルで超音波処理し、1分以上の間隔で30秒の持続時間の5〜10パルスで細胞をライスします。摂氏4度で45分間、28,000g以上で遠心分離により、リセートを明らかにする。テキストプロトコルに従ってニッケルNTAアガロース樹脂を調製した後、20ミリリットルの溶出バッファーを使用して重力流下でHisタグ付きIKK1アルファタンパク質を溶出する。1から1.5ミリリットルの分数を収集します。タンパク質を含む分画を組み合わせた後、摂氏4度で一晩TEVプロテアーゼでサンプルを消化する。2日目の朝、塩化マグネシウム、β-グリセロリン酸、フッ化ナトリウム、オルトバナジン酸ナトリウムの存在下で、27°Cで1時間、ATPの1ミリモルでタンパク質をインキュベートします。インキュベーション後、0.45ミクロンのフィルターを介してタンパク質溶液を濾過します。その後、サンプルの約6ミリリットルを120ミリリットルの調製サイズ排除カラムに積み込み、自動液体クロマトグラフィーシステムに取り付けます。平衡後、サイズ排除クロマトグラフィーを1分間に1ミリリットルの流量で実行し、2ミリリットル分数を収集します。走行中、280および254ナノメートルで溶出を監視します。純粋な分画を引っ張った後、メーカーの指示に従って、30キロダルトン、分子量カットオフ遠心濃縮器に濃縮します。次に、濃縮タンパク質の25マイクロリットルのアリコートを分配し、液体窒素中でフラッシュフリーズします。ロボットを用いて、96ウェルプレートの貯留槽に結晶化試薬のピペット80〜100マイクロリットル。結晶化ロボットを使用して、0.2~0.25マイクロリットルのIKK1とその阻害剤複合体を同じ体積のリザーバー溶液で分配して混合します。滴を設定した直後に、蒸発を避けるために光学的に透明なフィルムで各プレートを密封する。冷たい部屋で1つのプレートを摂氏18度で、もう一方のプレートを摂氏4度でインキュベートします。偏光板付きのステレオ顕微鏡を使用して、毎日、最初の7日間、そしてより長い間隔で、各ドロップ中の結晶の外観を確認します。先に説明したようにIKK1とその阻害剤複合体を調製した後、24ウェルプレートの各ウェルにウェル溶液を移します。1~1.5マイクロリットルのウェル溶液をきれいなガラスカバースリップに置きます。ガラスカバースリップに等量のIKK1とその阻害剤複合体を加え、上下に3〜4回ピペットで軽く混ぜます。プレートの各ウェルのリングにグリースを塗布した後、ガラスカバースリップを裏返し、各ウェルに鉗子を置きます。その後、ガラスのカバースリップを押し下げて井戸を密封します。24ウェルプレートにすべての滴を設定した後、暗闇の中で、冷たい部屋でインキュベート。時折、結晶の外観と成長のために顕微鏡の下で滴をチェックしてください。結晶の成長が完了したら、クリスタルを含むガラスカバースリップをそっと取り出し、クリスタルドロップを上向きにして固体表面に置きます。10マイクロリットルのクライオA溶液をドロップの上にそっと加え、結晶が触れないようにピペッティングして軽く混ぜます。顕微鏡を使用して、ゆっくりと結晶から液体を取り出し、溶液の約5〜8マイクロリットルを保ちます。2.5~4マイクロリットルのクライオB溶液をドロップにそっと加え、ピペットで軽く混ぜます。クリスタル上の直接の気流を避けるために、小さなペトリー皿でガラスカバースリップを覆います。5分待った後、適切なベースに取り付けられた適切なクライオループのドロップから慎重に単一の結晶を選びます。液晶を液体窒素でフラッシュフリーズします。その後、クライオループを含む結晶を、シンクロトロンでX線回折の準備ができるまで、デュワーフラスコの液体窒素に浸したパックに保管します。いくつかの異なるIKK1変異体を用いた広範な試験の後、結晶は1つの切り捨てられた構造で得られ、IKK阻害剤XIIの存在下でのみ適切なX線特性を示した。低解像度X線データの強度の弱さ、非対称ユニットの多数のIKK1分子、およびIKK1単量体二量体モデルの立体構造変化を組み合わせることで、既知のIKK2モデルと比較して分子置換溶液IKK1を得てその構造を決定することが困難となった。異なるIKK2構造は、2つのキナーゼドメインにおけるP578のアルファ炭素間の距離が、4つの異なるダイマーモデルにおいて、39から61のオングストロームの間で変化するように、そのダイマー内で異なる単量体配向を示した。低解像型のクライオ電子顕微鏡マップと、高解像度IKK2構造に基づいて生成できるIKK1ドメインの高精度モデルにより、有用な探索モデルを得ることが可能でした。最初のモデルは、IKK2モノマーと58オングストロームのN端子開口部に対して24度回転したキナーゼドメインの向きを示した。52オングストローム開口部を持つダイマーの1つをモデルとして使用して、非対称ユニット内に6つのダイマーが配置されました。一度習得すると、この技術は、それが適切に実行されている場合、数ヶ月で実行することができます。この手順を試みる間、可溶性、活性および行行性の高いタンパク質の取得が最初の重要なステップであることを覚えておくことが重要です。このビデオを見た後、IKK1タンパク質の結晶化と構造の決定に成功するために、詳細に従う必要があるすべてのステップをよく理解する必要があります。この手順を学ぶと、キナーゼ-マイトゲンシグナル伝達に関する追加の質問に答えるために決定できる他のIKKファミリータンパク質の構造がまだあります。

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JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

構造に基づいたドラッグデザインは、薬物開発において重要な役割を果たしている。並行して複数のターゲットを追求すると、大幅にリード発見のための成功の可能性が高くなります。次の記事では、感染症のためにシアトル構造ゲノム科学センターでは、PB2インフルエンザサブユニットの遺伝子対構造決定のためのマルチターゲットアプローチを利用してどのように強調しています。...

インフルエンザポリメラーゼPB2サブユニットの遺伝子の構造決定のためのマルチターゲット並列処理アプローチ

タンパク質-DNA複合体の結晶構造は、タンパク質の機能、機構、ならびに、特定の相互作用の性質についての洞察を提供することができます。ここでは、との共結晶の長さ、配列および二本鎖DNAの末端を最適化する方法を報告して...

SeqA-DNA複合体の結晶化のためのDNA二重鎖の反復最適化

βバレル外膜タンパク質(OMP)は、グラム陰性菌、ミトコンドリア、葉緑体の外膜内で多くの機能を果たします。ここでは、X線結晶構造解析またはNMR分光法による構造決定に十分な量のβバレルOMPを生成するためのプロトコルを提示することにより、構造研究における既知のボトルネックを軽減したいと考えています。...

βバレル外膜タンパク質の構造決意を目指して - 構築物から結晶へ

私たちは、大規模なコイルドコイルドメインの特性評価と結晶化を導くための簡単な生化学的および計算的分析を組み込んだフレームワークを記述します。このフレームワークは、球状タンパク質に適合させることも、さまざまなハイスループット技術を組み込むために拡張することもできます。...

大コイルドコイル含有タンパク質の結晶化を導くためにウェットとドライラボテクニックを組み合わせます

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) は、ヒトの病原体であるClostridium...

の生産、結晶化と構造決意<em&gt; C。ディフィシル</em&gt; PPEP-1 Microseeding及び亜鉛SADを介しました

タンパク質微結晶を用いたX線結晶解析のためのプロトコールが提示されている。精製後又はcelluloにおける微結晶-grown インビボで分析する2つの例が比較されます。...

タンパク質結晶の微結晶化および<em&gt;セルロで</em&gt;回折

Biolayer 干渉計、等温滴定型熱量計、x...

糖タンパク質 x 線結晶構造解析および生物物理学的手法によって、免疫グロブリンフォールドのキャラクタリゼーション

X線結晶学によるNEMOのIKK結合ドメインの構造決定のためのプロトコルについて説明する。この方法には、タンパク質発現、精製および特性評価、ならびに結晶最適化を成功させるための戦略および非結合形態のタンパク質の構造決定が含まれる。...

NEMOのIKK結合ドメインの生産・結晶化・構造決定

プロトコルは、異なる種からの2-ミクログロブリン(β 2m)置換...

異種β 2-ミクログロブリンを有するコウモリ主要組織適合性複合体クラスIの安定性と構造

本稿では、マイクロシードを用いてI3C(5-アミノ-2,4,6-トリヨードイソフタル酸)で誘導体化したタンパク質結晶を生成し、まばらなマトリックススクリーンで新しい結晶化条件を生成する方法を紹介します。トレイは液体分配ロボットを使用して、または手で設定することができます。...

ランダムマイクロシードマトリックススクリーニングによるI3Cによるタンパク質結晶の誘導体化

この寄稿では、結晶オンクリスタルデバイスでタンパク質結晶化をセットアップする方法と、オンチップ結晶化プラットフォームを使用して室温で自動シリアルデータ収集を実行する方法について説明します。...

室温でのオンチップ結晶化と大規模シリアル回折

学ぶ人間IKK1/αの生産・結晶化・構造決定手法。昆虫細胞発現と分子置換法を用いた構造生物学的手法で、免疫シグナル伝達の機構解明と創薬プラットフォーム構築に貢献します。

生産、結晶化、および人間 IKK1/α の構造決定へのガイド

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