Name: 生体内培養-高速、シンプルで、安価な AWESAM プロトコルを使用してマウスのアストロ サイトのように (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 学ぶ AWESAMプロトコルを用いたマウスアストロサイトの高速・簡便・低コスト培養法。生体内に近いカルシウムシグナリングと遺伝子発現プロファイルを維持した単一培養の樹立により、神経膠細胞生物学の研究に貢献します。

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我々 は、欧州研究評議会 (FP7/260916)、アレクサンダー ・ フォン ・ フンボルト ・財団 (Sofja Kovalevskaja) とドイツ研究振興協会 (DE1951 と SFB889) からの資金を認めます。

ここで説明したすべての動物実験は、ドイツの動物福祉に関する指針に従って行われました。
注: タイムラインとプロトコルの主な手順は図 1に示します。
1. 準備
<ol><li>
以下のソリューションを準備します。
	<ol>
<li>培養アストロ サイト MD 多角形の DMEM + 準備: 10 %fcs、100 U ペニシリン 100 μ g/mL ストレプトマイシンと DMEM。</li>
		<li>培養アストロ サイトの星状の NB + H の準備: 5 ng/ml の HBEGF、B-27 サプリメント、1 x グルタミン、100 U ペニシリンおよび 100 μ g/mL ストレプトマイシン × 1 neurobasal 中。 注: HBEGF の高濃度の因数を作成し、必要な時に培地に添加するのに-20 ° C で保存します。</li>
		<li>解剖中 (10 mM HEPES HBSS で) を準備します。</li>
		<li>0.05% トリプシン-EDTA と 6-7 ミリリットル 0.25% トリプシン-EDTA 15 mL チューブに 6-7 mL の因数を準備します。これらは、-20 ° C で保存し、37 ° C の水浴で解凍できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>プロトコルを開始する前に日はコートの 0.04% ポリエチレンイミン (PEI) 各 5 ml 10 cm 培養処理料理です。</li>
	<li>次の日は、プリンスエド ワード島を削除し、2 回蒸留脱イオン水で食器を洗います。各プレートに DMEM + 12 mL を追加し、中古セルをメッキする前に少なくとも 30 分の 37 ° C、5% CO2でインキュベーターで平衡します。</li>
	<li>郭清範囲を準備: 層流剥離フード解剖中氷の上でいっぱいに場所 2 10 cm シャーレ。各脳領域の分離 (例えば皮質、海馬)、14 mL 解剖中でいっぱい 15 チューブを準備し、氷の上を保ちます。70% のエタノールとボンネットの解剖顕微鏡の横にある場所で郭清ツール (高級はさみ、デュモン #3 #5 鉗子) をスプレーします。</li>
</ol>2. ラットまたはマウス脳解剖
注: 両方のマウス、ラットを使用できます。P8 はまた使用するかもしれないより古い動物 (我々 は P12 までテスト)、髄膜の取り外しはますます困難になるが。さらに、細胞収率と健康が低下し、複雑なプロセス、および組織の解離、細胞死に至る間壊れるかもしれない接続より古い動物から脳細胞が形成しているので。ここでは、皮質の準備を説明しますが他の頭脳領域も使用できます。
<ol><li>37 ° C の水浴中 0.05% トリプシン-EDTA を配置します。</li>
	<li>安楽死 (E19 子犬または P0 P8 動物の妊娠ラット) ゆっくりと CO2濃度を上げることによって、脳を隔離します。次の手順では、生殖不能の技術を必要があります。</li>
	<li>
萌芽期ティッシュの場合は、まず胚を子宮から削除し胚嚢を開き、すぐに頭をハサミでカットします。すべてのヘッドが途中で切れているときは、予冷の解剖中に転送します。
	<ol>
<li>ヘッドは媒体に沈んでいる、一度、小脳をピンチと鉗子皮膚と頭蓋骨 (両方とも若い動物で非常に柔らかい) を開きます。慎重にレバーを持ち上げて、頭蓋骨の脳の残りの部分。 注: 2 ~ 4 E19 胚解剖の日にメッキ皿あたりの 500,000 の細胞は皮質アストロ サイトの少なくとも 8 10 cm 皿のため十分な組織が得られます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>新生児やそれ以上の年齢の子犬の頭をはさみでカットし、内側頭の後ろから鼻の先端までの直線で皮膚を切断することによって脳を分離します。さておき、慎重にカット頭蓋骨の左し、右頭蓋骨骨までリフト肌を引き出します。小脳を切断し、頭蓋骨から脳の残りの部分のレバーします。 注: 2 ~ 3 P0 P8 子犬解剖の日にメッキ皿あたりの 500,000 の細胞は皮質アストロ サイトの少なくとも 8 10 cm 皿のため十分な組織が得られます。</li>
	<li>中脳の基になる構造体から大脳皮質を区切ります。無料それぞれの半球をピンチに (縦の割れ目に垂直な) 1 つの半球の皮質、中脳の構造の間に鉗子を移動半球間縦裂内で鉗子を配置します。</li>
	<li>鉗子を使用して、それぞれの半球 (とその海馬) からすべての髄膜を削除し、別のなった。海馬アストロ サイトが必要な場合は、氷の上 14 mL 郭清培地 15 mL チューブに各海馬を移動します。</li>
	<li>領域を削除さらにそれぞれの大脳半球の皮質から特定領域が必要 (例えば前頭葉) 場合。1 mm3を超える作品にアストロ サイトを生成するために使用する任意の大脳皮質組織をカットします。氷の上の郭清培地別 15 mL チューブで大脳皮質組織のすべての部分を収集します。</li>
</ol>3. 組織の消化と解離
<ol><li>すべての組織の部分が収集されると、管の底に沈殿するまで待機し、できるだけ多くの媒体を吸引します。</li>
	<li>0.05% トリプシン-EDTA 血清ピペットを使用して 2-3 mL を追加し、20 分間 37 ° C の水浴のチューブを孵化させなさい。 注: は、迅速組織部分をミックスして再度解決を許可するピペットからすべてトリプシン-EDTA を解放します。</li>
	<li>慎重にチューブの下部に、可能な限り小さな液体としての組織部分を残して、トリプシン EDTA を吸い出しなさい。</li>
	<li>残存トリプシン-EDTA を洗浄する予冷郭清培地 5 mL を追加します。ティッシュ部分の混合を達成するために管の上部の側にピペットします。</li>
	<li>郭清培地を吸引し、できるだけ少量の液体としての組織の部分を残してください。予冷の解剖中 2 回以上洗濯を繰り返します。</li>
	<li>最終的な洗浄ステップの後 DMEM + (部屋の温度に温め) 気泡を導入することがなくの 1,000 μ L ピペット チップとカップ刻んだピペッティングによる組織の上下を使用しての 1 つの mL を追加します。 これはアストロ サイトが非常に敏感な液の pH を変更可能性があります、注意: 生産の泡を避けるために重要です。</li>
	<li>50 mL チューブの開口部に 100 μ m セル ストレーナーを置き、前の予冷 DMEM + 4.5 ml フィルターをウェットします。</li>
	<li>セル ストレーナーに解離組織懸濁液の 1 mL のピペットし、別の 4.5 mL を追加事前冷却 DMEM + セル ストレーナーを介して、細胞を洗浄します。</li>
</ol>4 継によるアストロ サイト濃縮用セルめっき
<ol><li>10 μ L トリパン ブルー色素の細胞懸濁液の 10 μ L を希釈して、検定にミックスをピペッティング、例えばのセルをカウントします。</li>
	<li>12 mL DMEM + 10 cm 皿あたりの 500,000 の細胞をプレートします。 注: DMEM + はアストロ サイトの成長に役立つニューロンまたはミクログリアのよりもっとそう。揺れ、中にウエル内でガラス coverslips に作用する物理的な力、(coverslips) なし 10 cm 皿に作用よりもはるかに強い。セルは、24 ウェル プレートに揺さぶられる場合、彼らは不健康になるか死にます。揺れの後 24 ウェル プレートにアストロ サイトをプレートのみです。</li>
	<li>7 日間のインキュベーターで 37 ° C、5% CO2での細胞培養を維持します。</li>
	<li>6 日目、揺れと細胞を継前日準備ペイ コート培養皿手順 5 で説明したよう。</li>
</ol>5. 細胞の継
<ol><li>
通過、前日 0.04 %pei と細胞培養皿をコートします。
	<ol>
<li>免疫細胞化学、ウイルス伝達プラスミド トランスフェクションの 24 ウェルまたは 6 ウェル プレート (各を含む滅菌 12 mm または 25 mm ガラス基板、それぞれ) を使用します。</li>
		<li>ガラス coverslips を少なくとも 1 時間を 70% エタノールで消毒して、井戸、coverslips を配置する前に脱イオン蒸留水水で 3 回を洗ってください。</li>
		<li>24 ウェル プレートで 12 mm coverslip あたり 0.04 %pei と 600 μ L 0.04 %6 ウェル プレートで 25 mm coverslip あたり少なくとも 70 μ L を追加します。</li>
		<li>西部のしみまたは RNA シーケンス解析、解剖後セルを既に含む 10 cm 皿は使用を続行できます。動揺するだけで料理し、セルを 1 × PBS で洗浄して NB + H で扱われる (新しい料理への転送しない)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>日の in vitro (DIV) 7 郭清後、インキュベーターで研究室のシェーカーを DMEM + 細胞で 10 cm 皿に配置、6 時間 110 rpm で料理を振る。</li>
	<li>脱イオン蒸留水水でコーティング coverslips からプリンスエド ワード島を 2 回洗浄します。NB + H の中を板 (500 μ L/ウェル 24 ウェル プレートと 6 ウェル プレートのウェルあたり 2 mL) に追加します。37 ° C と 5% CO2 10 cm 皿、揺れている間、少なくとも 30 分のためのインキュベーターでプレートを平衡事前。</li>
	<li>6 h の揺れの終わりの前に 20-30 分前 1 x PBS、DMEM +、NB + H、および 0.25% トリプシン-EDTA 水浴中の 37 ° c を温めます。</li>
	<li>6 h、揺れのシェーカーを培養皿を取るし、すぐに 10 ml (を含む動揺をニューロン、オリゴデンドロ サイト、ミクログリア) 媒体を交換後皿あたり 1x PBS で加温します。 注: それはすぐに再アタッチ非アストロ サイト細胞を避けるために独立した細胞を含む古い培地を吸引することが重要です。</li>
	<li>PBS を削除し、皿あたり 3 mL に予め温めておいたトリプシン-EDTA を追加します。各皿 37 ° C、5% CO2でインキュベーターで 4 分間、インキュベートします。 注: 西部のしみまたは RNA シーケンスのサンプルの準備している場合、トリプシン-EDTA を追加しないでください。代わりに、置換、PBS 12 mL NB + H の文化インキュベーターに配置することができますで加温。</li>
	<li>5 mL 各 3 mL のトリプシン-EDTA + DMEM に予め温めておいた皿、ピペット 5 mL の血清ピペットを使用して皿からセル、50 mL のチューブに細胞懸濁液を収集を追加します。 注: ピペット - 皿の底から直接料理の床はセルをデタッチと明確になるはず。のみ血清トリプシンを不活化 (代わりに DMEM +)、血清含有培地を使用します。</li>
	<li>4 分 20 ° C で 3,220 × g の細胞懸濁液を遠心します。</li>
	<li>上澄みを除去し、NB + H で加温 1 mL の細胞ペレットを再懸濁します。</li>
</ol>6 最後のアストロ サイト文化のセルめっき
<ol><li>セルをカウントします。</li>
	<li>(ウェルあたり 2 mL NB + H 中) で 6 ウェル プレートのウェルあたり 20,000 セルまたは (の井戸あたり 500 μ L NB + H 中) 24 ウェル プレートのウェルあたり 5,000 の細胞をプレートします。</li>
	<li>インキュベーターでの培養細胞を 37 ° C、5% CO2でさらに処理または分析までにしてください。</li>
	<li>週に一度半分の媒体を交換します。 注: 低栄養環境でアストロ サイトの増殖を停止、任意の残りのミクログリアが増殖する (ただし、私たちの経験ではミクログリアの AWESAM 文化に掲載なし)。一週間を豊かな可能性のある残りミクログリア8、防ぎ、モノカルチャーは、少なくとも 3 週間は健康維持と半分の培地交換すること。</li>
</ol>

<ol><li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+3D+cell+culture+system+minimizes+cellular+stress+and+maintains+the+in+vivo-like+morphological+complexity+of+astroglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Bioactive 3D cell culture system minimizes cellular stress and maintains the in vivo-like morphological complexity of astroglial cells.</a> Glia. 61 (3), 432-440 (2013).</li>
<li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HB-EGF+affects+astrocyte+morphology%2C+proliferation%2C+differentiation%2C+and+the+expression+of+intermediate+filament+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins.</a> J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).</li>
<li>Foo, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+method+for+the+purification+and+culture+of+rodent+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes.</a> Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).</li>
<li>Wolfes, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+culturing+stellate+astrocytes+reveals+spatially+distinct+Ca2%2B+signaling+and+vesicle+recycling+in+astrocytic+processes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes.</a> J Gen Physiol. 149 (4), (2016).</li>
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<li>Zamanian, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+reactive+astrogliosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of reactive astrogliosis.</a> J Neurosci. 2 (18), 6391-6410 (2012).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+signaling+in+astrocytes+from+Ip3r2%28-%2F-%29+mice+in+brain+slices+and+during+startle+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (5), 708-717 (2015).</li>
<li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J Gen Physiol. 141 (5), 633-647 (2013).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Transgenic+Mouse+Lines+for+Selectively+Targeting+Astrocytes+and+Studying+Calcium+Signals+in+Astrocyte+Processes+In+Situ+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li>
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<li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+Opening+of+the+Mitochondrial+Permeability+Transition+Pore+Induces+Microdomain+Calcium+Transients+in+Astrocyte+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transient Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore Induces Microdomain Calcium Transients in Astrocyte Processes.</a> Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

プロトコル内で 4 つのステップが重要です: 1) 濃度の小さい増加が未熟な文化、例えばにつながることができますので、正確に 5 ng/ml、HBEGF 濃度を準備、10 ng/mL HBEGF は解除アストロ サイト4に区別組織または pH を変化でき、アストロ サイトの健康を阻害する細胞を含むソリューションで 2) 回避の泡3) 事前それなくメディア健康アストロ サイト; 成長温度と最適 pH を達成するために(ただし、ミクログリアが見つかりませんでした AWESAM 文化のこれまでのところ)、4) 交換媒体を半分だけ週に一度任意の残りのミクログリアは十分な栄養素が存在し、メディアが増殖する可能性が低いので8交換定期的に。この最後の点では、アストロ サイトの生存・分化・増殖がサポートされる場合と、文化の中でアストロ サイト由来因子は完全削除されませんする必要があります、注意してくださいすることが重要です。
DIV14 またはより古い文化成熟アストロ サイトのソースと...

アストロ サイト栄養サポート、血流、シナプス シグナルと可塑性の細胞間コミュニケーション - 薄いアストロ サイト プロセスの中心機構である脳機能に影響を与えます。ここで記述されている AWESAM プロトコルにより、ニューロンと、役に立つなど、異なる脳細胞間の多くの蛋白質とも Ca2 +シグナル伝達式が重なるため他のグリアからの干渉なしにこれらのプロセスに関する研究タイプ。さらに、このメソッドは、以前利用可能な技術の限界を克服します。体内特に私たちのプロトコルを提供します-形態 (薄膜プロセスと星状アストロ サイト) とクイック, 簡単, 遺伝子発現と安価な方法のようです。
細胞の形態、遺伝子発現、および他の多くの規制プロセスは環境によって直接影響します。培養皿の周囲の細胞も細胞が成長して媒体によって解放の要因を指します。アストロ サイト、HBEGF 以前星状の形態1を誘導するために報告されたが、解除アストロ サイト2を区別することが分かった。ただし、低濃度 HBEGF の後より生体内で生成するため使用された-アストロ サイトのように 2 つの異なるプロトコル3,4の RNA シーケンスで識別されます。さらに、アストロ サイトの形態変化4プロトコルに関係なく、ミディアムの組成: HBEGF の低濃度 Neurobasal 媒体 (例えば他の培地の成分中の星状のアストロ サイトを成長に最適です血清を含む DMEM) (さらに新鮮な immunopanning によって分離されたアストロ サイト) 多角形の細胞を作り出します。
AWESAM プロトコルは、アストロ サイト モノカルチャー4成長のための前の技術の欠点を克服します。アストロ モノカルチャーの成長のための前の技術次の欠点があります: は体内(MD 法) 星状アストロ サイト5; の特徴的な多角形の形態長さとプロトコル (3ヶ月誘導多能性幹細胞からアストロ サイトの準備と高価な成長因子を含む多くの試薬が必要です) のコスト6;少量の素材 (immunopanning 法)3アストロ サイトの解消の分化と 3 D マトリックス (Puschmannら) の要件1,2対照的に、AWESAM プロトコルを提供します:生体内で-形態 (薄膜プロセスと星状アストロ サイト); のような。迅速、簡単、および安価な方法;大量の素材。生体内最も-遺伝子発現 immunopanned と MD アストロ サイトと比較してのように。さらに、2 D の文化は、Ca2 +シグナル伝達と薄膜プロセスや膜に近いイベントをリサイクルの研究 (例えば、全反射型顕微鏡では不可能です 3 D 文化)。
MD 法は、1980年5、多角形のアストロ サイト モノカルチャーのシンプルで高速な手法を提供するの出版以来広く使用されています。簡単に言えば、MD 法を伴なう牛胎児血清 (FCS) の成長の混合脳細胞-(型デタッチお皿から他のすべての脳細胞) としてアストロ サイトを豊かにし、さらに同じ培地で培養する手順を揺れが続く、DMEM を含みます。DMEM FCS とは、線維芽細胞と脂肪細胞から異なるがん細胞、すべての共有の文化における MD アストロ サイトが出展した多角形の形態に至るまで他の多くの細胞型に使用されます。初期の 2000 年代の7時まで少し考えていたアストロ サイトに合わせたメディアに与え、彼らの典型的な星状の形態を支持する具体的にはin vivoを発見します。2011 年に公開された 1 つのプロトコルがこのような星状の形態を達成する: immunopanning メソッドが呼び出されると、それは無血清培地培養アストロ サイト3用に最適化を採用しています。このメソッドを使用して、新鮮な分離脳細胞料理アストロ サイトを豊かにするため、セルの型固有のセル表面蛋白質を対象とする抗体でコーティングのシリーズにさらされています。生体内でより多くにもかかわらず-immunopanned アストロ サイトの形態と発現プロファイルのような生体外の研究の大半は、まだ MD アストロ サイト メソッドに依存します。MD 法はシンプルかつ高速で、immunopanning メソッドは、文化の最初の日により複雑な時間のかかる手順を装備されている (長い酵素消化期間など別の密度、自体は、immunopanning の解の慎重なレイヤーといくつか遠心分離の手順 - めっき前にすべて)。しかしより専門的な媒体を使用して、AWESAM メソッド提供速度分子動力学法と生体内で-immunopanning プロトコルの形態のような。
全体的に、AWESAM プロトコルは生体内でより多くを学ぶ-(immunostainings、immunoblots、RNA シーケンス、以前特徴4 ) としてニューロンとグリア他から分離された 2次元模型林分におけるアストロ サイトのように。それシンのアストロ サイト プロセスの研究のためと自発的 Ca2 +シグナル伝達とイベント (例えば、全反射顕微鏡を用いたイメージング) 膜に近い可視化する偉大なアクセシビリティを提供できます。

<table><tbody><tr><td>0.05%トリプシン-EDTA</td><td>ギブコ</td><td>25300054</td><td>37で暖かいです。使用前のCウォーターバス</td></tr><tr><td>0.25%トリプシン-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td>は<td>37&ordmで暖かいです。Cウォーターバス使用前</td></tr><tr><td>B-27サプリメント</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>50Xストック</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100Xストック</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>50ストック;ペニシリン:5000 U / ml;ストレプトマイシン:5000 &micro;g/ml</td></tr><tr><td>神経基礎中</td><td>ギブコ</td><td>21103049</td><td>L-グルタミンなし</td></tr><tr><td>DMEM ギ</td><td>ブコ</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>HBEGF</td><td>シグマ</td><td>4643</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ギブコ</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ギブコ</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>ギブコ</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ギブコ</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>1X 100 &mu;mナイロンセルス</td>トレーナーBD352360<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>シグマ</td><td>T8154&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養インキュベーター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Hera Cell 240i 細胞培養インキュベーター</td><td></td></tr><tr><td>ラボラトリーシェーカー</td><td>ハイドルフ</td>・<td>ロタマックス 120&nbsp;</td><td>細胞培養インキュベーター内で使用</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

生体内培養-高速、シンプルで、安価な awesam プロトコルを使用してマウスのアストロ サイトのように

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

AWESAM (、 low-コストeasy stellate 、strocyte「ウィズダム) プロトコルは生体内での大量を生成する高速シンプルで、安価な方法を伴います-マウスおよびラットのグリア モノカルチャーのような: 脳細胞は異なる脳の領域から分離することができ、細胞培養の週後非アストロ サイト細胞はインキュベーターで 6 h のシェーカーに培養皿を置くことによって振り落とさ。残りのアストロ サイトが (NB + H と呼ばれる) アストロ サイト固有の培地で継代新しいプレートにし。NB + H には、低濃度培地に血清の代わりに使用されているヘパリン結合 EGF 様増殖因子 (HBEGF) にはが含まれています。NB + H で成長して後、AWESAM アストロ サイトがある星状の形態と機能の細かいプロセス。さらに、これらのアストロ サイトがより多く体内ある-アストロ サイト以前に発行されたメソッドで生成されたよりも遺伝子発現のように。Ca2 +イメージング、小胞ダイナミクスと細胞膜の近くに他のイベントは、罰金のアストロ サイト プロセスの in vitro、例えば、生きているセルの共焦点または全反射型顕微鏡を使用して研究できることは従って。特に、AWESAM アストロ サイトも示す自発的 Ca2 +シグナリング体内のアストロ サイトに似ています。

文化 (図 2) の 2 週間後の星状神経細胞と共培養、NB + 培地で成長しているアストロ サイトが表示されます。NB + 媒体に加えて、共培養アストロ サイトは彼らの生存と形態に貢献する可能性の高い未知のニューロン由来因子にさらされています。対照的に、(通路の前に他のセルタイプをふっ飛ばす) 後、DMEM + でモノカルチャーとして成長した MD アストロ サイトは 2 週間後に多角形表示されます。培養 2 週間後の細かい工程が多い星状後揺れ、NB + H で栽培 AWESAM アストロ サイトが表示されます。
我々 は以前 AWESAM アストロ サイトの RNA 発現プロファイルはアストロ サイト生体内でMD と immunopanned アストロ サイト4と比較した場合のそれに近いことを示した。アストロ サイト特異蛋白...

ここで記述されている AWESAM プロトコルは、高速、簡単、かつ安価な方法で他の脳細胞から分離してマウスアストロを培養に最適です。AWESAM アストロ サイトを示す自発的 Ca2 +シグナリング、形態、遺伝子発現プロファイル体内のアストロ サイトに似ています。

生体内培養-高速、シンプルで、安価な AWESAM プロトコルを使用してマウスのアストロ サイトのように

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

本手順の全体的な目的は、簡便かつ迅速で経済的な方法を用いて、生体内に近いアストロサイト単一培養細胞を作製することです。この手法は、アストロサイトによる物理的な放出または取り込みの効率など、アストログリア生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本技術の主な利点は、得られる細胞が形態、mRNAおよびタンパク質発現、ならびに細胞間カルシウム変動において、生体内のアストロサイトに非常に近い特性を示すことです。この手順を開始するために、解剖用培地を満たした10 cmのペトリ皿2枚を氷上に置き、ラミナーフロー解剖フード内に配置して解剖エリアを準備します。単離する脳領域ごとに、14 mLの解剖用培地を満たした15 mLチューブを用意し、氷上に保持します。次に、解剖器具に70%エタノールをスプレーし、フード内の解剖顕微鏡の横に配置します。胚組織を使用する場合は、まず子宮から胚を取り出し、胚嚢を開きます。直ちにハサミで頭部を切り離してください。すべての頭部の切り離しが完了したら、あらかじめ冷却しておいた解剖用培地に移します。頭部を培地に浸した状態で、ピンセットで皮膚と頭蓋骨を開き、小脳を摘出します。次に、脳の残りの部分を慎重に持ち上げて頭蓋骨から取り出します。その後、皮質を下層の中脳構造から分離します。ピンセットを大脳半球間の縦裂に挿入し、一方の半球の皮質と中脳構造の間を動かして、各半球を慎重に切り離します。続いて、各半球からすべての髄膜を取り除き、海馬を分離します。海馬アストロサイトが必要な場合は、各海馬を氷上の14 mLの解剖培地を満たした15 mLチューブに移します。その後、アストロサイトの作製に使用する皮質組織を、1立方ミリリットル以下の大きさに細切します。次に、すべての皮質組織の断片を、氷上で解剖培地を満たした別の15 mLチューブに回収します。すべての組織片を回収したら、それらがチューブの底に沈殿するまで待ちます。次に、培地を可能な限り吸引します。続いて、0.05% tripsen EDTAを2-3 mL加え、サンプルを37 °Cのウォーターバスで20分間インキュベートします。その後、tripsen EDTAを慎重に吸引し、チューブ底部の組織片に最小限の液体が残るようにします。次に、5 mLの冷却済み解剖用培地を加えて残りのtripsen EDTAを洗い流し、組織片が混ざり合うように上部チューブの側面にピペッティングします。その後、解剖用培地を吸引し、組織片を最小限の液体の中に残します。この洗浄ステップを冷却済み解剖用培地で2回繰り返します。最後の洗浄ステップの後、室温のD-Mem Plusを1 mL加え、気泡が入らないようにピペッティングして組織をトリチュレーションします。アストロサイトはpHに非常に敏感であるため、溶液のpHが変化する可能性がある気泡の発生を避けることが重要です。次に、50 mLチューブの開口部に100 µmのセルストレーナーを設置し、あらかじめ冷却したD-Mem Plusを4.5 mL加えてフィルターを十分に濡らしておきます。分離した組織懸濁液1 mLをセルストレーナーにピペットで滴下し、さらに4.5 mLの冷却済みD-Mem Plusを加えて細胞を洗浄しながら通過させます。解剖後のin vitro 7日目に、D-Mem Plusを含む細胞が入った10 cmディッシュをインキュベーター内のシェーカーに設置し、110 RPMで6時間振とうします。6時間の振とう終了の20〜30分前に、1 XPBS、D-Mem Plus、NB+H、および0.25%tripsen EDTAをウォーターバスで37 °Cに予熱しておきます。6時間の振とう後、培養皿をシェーカーから取り出し、直ちに培地を1枚あたり10 mLの予熱済み1 XPBSに交換します。続いて、PBSを除去し、1枚あたり3 mLの予熱済みtrypsin EDTAを加えます。その後、サンプルを37 °Cで4分間インキュベートします。ウェスタンブロッティングまたはRNAシーケンシング用のサンプルを調製する場合は、Tripsen EDTAを添加しないでください。その代わりに、PBSを12 mLの予熱したNB+Hに置き換え、その後、培養物をインキュベーターに戻します。次に、各ディッシュに予熱したD-Mem Plusを5 mLとtripsen EDTAを3 mL添加します。ディッシュから細胞をピペッティングで回収し、50 mLチューブに細胞懸濁液を集めます。その後、細胞懸濁液を20 °Cで3220 ×g、4分間遠心分離します。次に、上清を除去し、あらかじめ温めておいた1 mLのNB+Hで細胞ペレットを再懸濁します。これらの画像は、G-campを導入したausamアストロサイトが、細い突起を含むアストロサイトネットワーク全体で自発的なカルシウムイオンイベントを示すことを表しています。ここでは、異なる時点で撮影した画像において、カルシウムイオン波が複数のアストロサイトを介して左から右へと伝播しています。明るい色はカルシウムイオン濃度が高い領域を、黒い領域は細胞外領域を示しています。このグラフでは、色分けされた領域におけるカルシウムイオン濃度の経時的変化がG-campの蛍光強度トレースとして示されており、カルシウムイオンシグナリング波が複数のアストロサイトにわたってどのように広がるかが描かれています。この手法を習得し、適切に実施すれば、1時間15分で完了することができます。本手順に続いて、トランスフェクションやウイルス導入実験と組み合わせた生細胞イメージングなどの他の手法を用いることで、アストロサイト膜でどのような現象が起こるかといった追加の疑問を解消することが可能です。このビデオを視聴することで、in vivoに近いアストロサイト単一細胞培養を、簡便かつ迅速で経済的な方法で準備する手順を十分に理解できるはずです。

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ラットの子犬の脳からのアストロサイトの初代培養物の生成

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マウスのアストロサイトを分離して培養する簡単な技術

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マウス大脳皮質アストロサイトの単離および培養

表現型の野生型アストロサイトと神経幹細胞は、floxed、条件付き発癌性対立遺伝子で操作され、ウイルスCre媒介組換えを介して形質転換されたマウスから採取され、同系で免疫能力のある同腹仔の脳に形質転換細胞を同所性注射することにより、in vitroおよびin...

モデル星細胞腫発症機序体外とインビボ皮質アストロサイトまたは条件付き、遺伝子改変マウスから神経幹細胞を使用した

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虚血性脳卒中、酸素無グルコース (OGD) に影響を受ける脳の領域にアストロ サイトの特定の貢献がさらされて複雑なイベントは調査しにくい。孤立したアストロ サイトを取得し、反応性、OGD...

反応性アストロ サイトと増殖の in Vitro虚血のような条件下での監視

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成体マウス脊髄からの純粋なアストロサイトおよびミクログリアの単離(Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord for the In Vitro Assays and Transcriptomic Studies)

学ぶ AWESAMプロトコルを用いたマウスアストロサイトの高速・簡便・低コスト培養法。生体内に近いカルシウムシグナリングと遺伝子発現プロファイルを維持した単一培養の樹立により、神経膠細胞生物学の研究に貢献します。

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