細胞間腔の形態形成と単一細胞レベルでのIn Vivo偏光膜生合成のためのモデルとして線虫腸: 抗体の汚損、RNAi 損失の機能解析、イメージングによるラベリング

この標準的な方法の組み合わせの全体的な目標は、C.elegans腸を分極膜生合成および内腔形態形成の単一細胞および細胞内レベルでのin vivo解析にどのように使用できるかを実証することです。この方法は、極性および生合成の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。例えば、頂端膜ドメインと基底外側膜ドメイン、その他の細胞内非対称性がどのように確立され、形態形成中および形態形成後に維持されるかなどです。このモデルシステムの主な利点は、わずか20個の細胞からなるこの透明な単層がin vivo組織チャンバーで生き残り、単一細胞の分極膜と内腔の生合成を解剖できることです。

この技術は、他のC.Elegans形態形成表現型の分析に拡張することができ、ここでの焦点は膜生合成、特に頂端膜と内腔の生合成の分析にあります。この手順には、固定動物と生きた動物で、膜ドメインと細胞内成分を区別し、C.elegans腸内の内腔の形態形成表現型を特定するための洗練されたイメージング技術が含まれます。腸管尿細管形成に関するこのビデオには、排泄管尿細管形成の相互情報モデルに関するビデオが添付されており、分極膜生合成のin vivo分析が行われています。

イメージング用の蛍光標識融合タンパク質によるトランスジェニック動物の作製については、排泄管尿細管形成の解析に関する添付ビデオで説明しています。このような動物は、RNAi実験に直接使用することができます。通常、第3世代は、この手順の組み合わせの最初のステップです。

このビデオは、動物を固定する必要がある代替標識法の抗体染色から始まります。さまざまな標識手順を、最終的なイメージング分析に通常使用される免疫組織化学と組み合わせることができます。このプロトコールには、腸特異的な膜マーカー、プロモーター、および両方の標識手順に役立つその他のリソースの例もあります。

免疫組織化学を実証した後、このビデオでは、腸頂部膜をERM-1 GFPで標識するトランスジェニック株を使用して、RNAiを使用して極性および内腔の形態形成表現型を検索します。まず、ワームを固定するためのスライドを準備します。30マイクロリットルのポリ-L-リジンをスライドにピペットで移し、次に2番目のスライドをもう一方のスライドにセットし、それらを一緒にドロップして溶液を両方に均等に広げます。

次に、2つのスライドをはがし、30分間自然乾燥させます。次に、液体窒素で満たされた容器に平らな金属ブロックを置きます。プレートをM9溶液で洗浄し、ワームを含む約10マイクロリットルのM9を移します。

または、ワームを選択し、スライドにM9を追加します。ワームが移動したら、カバースリップを横方向にそっと落とし、カバースリップオーバーが一方の端にぶら下がるようにします。次に、横方向に動かさずにカバースリップをそっと押します。

次に、すぐにスライドを液体窒素の金属ブロックに移し、凍結させます。5分後、張り出した端を使用してカバースリップをはじき出します。キューティクルの適切な亀裂を得るために、これを迅速に行ってください。

次に、スライドをメタノールを充填したガラスCoplinジャーにマイナス20°Cで浸します。5分後、スライドをアセトン充填ガラスのCoplinジャーに同じ温度でさらに5分間移します。スライドは直接染色することも、マイナス20°Cで保存することもできます。

スライドをアセトンから取り出し、室温で自然乾燥させます。次に、スライドの下側にワセリンの円形の壁の位置をマークし、ゼリーの壁を構築します。この手順では、ゼリーをこすり落とさないでください。

次に、濡れたペーパータオルでビンに濡れたチャンバーを準備し、スライドをその中のラックに置きます。タオルと滑り台の間、または隣接する滑り台の間に接触してはなりません。次に、その領域を覆うのに十分なPBSをゼリーサークルにピペットで入れます。

ピペットの先端を円の端にそっと置き、液体がワーム上にスムーズに分散するのを待ちます。その後、蓋を閉めて5分待ちます。5分後、スライドを傾け、スライドからワームを失わないように注意しながら、PBSをゆっくりと吸引します。

次に、ゼリーサークルを新しく調製したブロッキング溶液で慎重に満たします。そして、スライドを室温で15分間インキュベートします。15分後、ブロッキング溶液を一次抗体を含むブロッキング溶液と交換します。

そして、スライドを摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、一次抗体を取り出し、ブロッキング溶液を3回塗布してスライドを洗浄します。各ブロックアプリケーションを10分間インキュベートします。

次に、ブロッキング溶液で希釈した二次抗体を添加し、スライドを室温で1時間インキュベートします。その後、スライドをブロッキング溶液で2回洗浄し、次にPBSで1回洗浄します。次に、標本が乾燥するのを許さずにできるだけ多くのPBSを取り除き、標本の周りのゼリーを慎重に取り除きます。

試料に封入剤を一滴垂らし、続いてカバースリップとマニキュアシールを塗布します。次に、スライドを摂氏4度の暗闇に保管します。RNAiライブラリープレートをマイナス80°Cからドライアイスに移します。

シーリングテープをはがします。そして、目的のクローンを選択オーガーに移します。次に、クローンを縞模様にして、一晩でバクテリアを成長させます。

ライブラリープレートをマイナス80°Cの冷凍庫に戻す前に、新しいシーリングテープを貼ってください。翌日、プレートからコロニーをアンピシリンを含む液体培地の1ミリリットルのアリコートに接種します。その後、摂氏37度で約14時間振ってください。

翌日、クローンあたり200マイクロリットルを別々のRNAiプレートに播種します。プレートを乾燥させ、室温で一晩インキュベーションしてRNAi産生を誘導します。翌日、5つのL4ステージの線虫を、標的とする特定の遺伝子で標識された各RNAiプレートに移します。

次に、プレートを通常20°Cのインキュベーターに移します。まず、低倍率および高倍率の明るい光の下で、コントロール動物とRNAi動物を比較します。次に、適切なフィルターの下で蛍光下でのコントロールとRNAi動物の比較を検討します。

RNAi動物を含むプレートをプレート全体の左上から右下に系統的にスキャンし、表現型を検索します。興味のある動物を探してください。選択したRNAi表現型を詳しく調べるには、腸に焦点を当て、ズームを使用して尿細管形成と内腔の形態形成表現型を評価します。

共焦点顕微鏡で目的の線虫を調べるには、まず手でマウントして固定し、スライドガラス上に真空グリースまたはワセリンの細い円を作ります。グリース層は、0.1ミリメートル以下の厚さで薄くする必要があります。次に、円の中央に約3.5マイクロリットルの10ミリモルアジ化ナトリウムを追加します。

次に、溶液が乾く前に、解剖顕微鏡で目的のワームを溶液にすばやく取り込みます。その後、カバースリップをそっと貼り、30分以内に動物をイメージします。穏やかな圧力を使用し、顕微鏡下で、ワームが溶液中に浮いていないことを確認します。

共焦点顕微鏡の下で、低電力と焦点でワームを見つけます。次に、60倍または100倍の油浸対物レンズを使用して、腸を観察し、画像化します。次に、適切なチャネルの蛍光灯の下で動物を検査し、目的の細胞欠損を示す領域を選択します。

写真の漂白を避けるために素早く動きます。次に、レーザースキャンに切り替え、背側と腹側にスキャン境界を設定して、画像を腸に制限します。画像シリーズをキャプチャし、後で画像を 1 つの投影画像に結合します。

このプロトコルは、頂端膜と内腔の形態形成が一致する発達中のC.elegans腸で分極膜生合成を分子的に分析し、視覚的に解剖する方法を説明しています。頂端および基底外側の膜ドメイン、膜関連接合部、および腸管腔を解決し、それらの相互関係を発生全体を通じて調べることができます。これらの細胞内成分は、添付の論文に記載されているように、蛍光標識抗体または蛍光融合タンパク質によって二重または三重に標識することができます。

グロスルーメンの欠陥は、解剖蛍光顕微鏡を使用して迅速にスキャンできます。GFPに結合した頂端膜細胞骨格リンカーERM-1は、RNAiスクリーニングに有用な堅牢に発現するマーカーです。このマーカーを使用すると、一連の新しい腸管腔の形態形成と極性の表現型、およびそれらの根底にある遺伝子欠陥が発見されました。

次に、共焦点レーザースキャンによって取得された高倍率の画像を使用して、表現型をより慎重に調べ、根本的な欠陥をよりよく理解しました。一部の表現型は定量化できます。定量化を使用して、このような欠陥を比較し、開発を通じての進行状況を追跡しました。

このビデオを見れば、免疫染色による腸管および膜内膜コンパートメントの標識方法、および分極膜および内腔生合成の機能RNAi表現型の解析方法について十分に理解できるはずです。