Name: 細胞間腔の形態形成と単一細胞レベルでのIn Vivo偏光膜生合成のためのモデルとして線虫腸: 抗体の汚損、RNAi 損失の機能解析、イメージングによるラベリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: 学ぶC. elegans腸を用いた偏光膜生合成と内腔形態形成のin vivo解析法。抗体染色、RNAi、蛍光イメージングで単一細胞レベルの膜極性と内腔形成を可視化し、形態発生の分子メカニズムを解明する。

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私たちありがとうマリオ・ デ ・ボノ (MRC 分子生物学研究所、ケンブリッジ、イギリス)、ケネス ・ J Kemphues (コーネル大学、イサカ、米国)、ミシェル ・ Labouesse (Institut de生物学パリ セーヌ川、大学ピエール エ マリー キュリー, パリ, フランス)、グルゴワール ミショー (ユニヴェルシテ・ ド ・レンヌ 1, レンヌ, フランス)、CGC、緊張および抗体の研究インフラ プログラム (P40 OD010440) の NIH のオフィスによって資金を供給します。この作品は、英領バージン諸島に SAA 223809、MGH は 224570 NIH の GM078653 の助成金によって支えられました。

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著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

このプロトコルは、標準機能喪失遺伝的/RNAi とイメージングを視覚的・分子解剖の生体内でのモデルとして線虫腸上皮の活用 (ラベルと顕微鏡的) アプローチを結合する方法をについて説明します偏光膜と内腔の器官。
ラベリング
このプロトコルは、抗体の汚損に焦点を当てています。その場で抗体による分類蛍光融合タンパク質 (排泄管膜器官に付属の紙で説明)2によって分類する特異性の高い方法であります。抗体の汚損ライブ イメージングを許容しないが、(どちらのラベリング方法は失敗することがなく) 興味の蛋白質の局在化のための確認があります。さらに、形態形成やタンパク質の細胞内局在に関する質問は固定動物でよく評価できます。免疫染色はダブルと複数ラベルに便利、これらは必要な固定と透過の手順を保持できる場合、蛍光融合タンパク質によるラベリングと組み合わせることができます。ここで輪郭を描かれたプロトコルは通常、(<s...

細胞と細胞の非対称性、偏光膜ドメイン形成などの発生は形態形成と細胞、組織、器官1の機能にとって重要です。複数連続して一致する細胞外および細胞内シグナルに依存して細胞レベル下のコンポーネント割り当ての方向変化以来、技術的な課題のまま上皮における偏光膜生合成に関する研究ほとんどのモデルの分離し、モデル システムに強く依存することは困難。モデル紹介 - 単層線虫腸 - 絶妙なシンプルさの組織であります。単一セルと一緒にc. の elegans排泄運河 ( c. の elegansの排泄管の偏光膜生合成紙に同行を参照)2、身分証明書のいくつかのユニークな利点を提供し、偏光膜生合成に必要な分子の性格描写。男に酵母から分子極性手がかりの保全するこの単純な無脊椎動物オルガン優れた「生体内で組織の部屋」はまだあまり人間のシステムに直接関係のある上皮細胞極性に関する質問を解決するシングルでこれらのイベントのビジュアル解剖を許可する複雑な細胞レベルの生体です。
複数保存されている極性 (1) などの細胞外マトリックスから手がかりを (2) 細胞膜および接合、および (3) 細胞内小胞輸送がされて識別された3の過程において彼らの統合の基本原則偏光上皮膜と組織器官はかり4です。(E.g.S. 酵母と線虫受精卵) の生体内で古典的な単一細胞モデル偏光セル分割前後極性の原理を定義することに尽力しているし、重要な識別しました。膜の極性決定要因 (小低分子量 g 蛋白質/CDC-42、分割不良パルス)5,6, しかし、彼らユニークな対称性の破れ (芽傷、精子のエントリ) の手がかりに依存しており、接点保護を欠いています。apicobasal 膜ドメインと、おそらく、機械をソート対応する細胞内 apicobasal。偏光上皮、人身売買の組織について我々 の現在の知識ただし、主に依存している哺乳類の 2D モノカルチャー7膜の位置を変更できる生理的細胞外および発達の合図を欠いています。ドメインおよび人身売買軌跡の方向 (2 D から 3 Dの in vitro培養系単独への切り替えは (マディン-ダービー犬腎臓) MDCK 細胞の膜の極性を反転するのには十分である)8。無脊椎動物モデルで上皮細胞の極性に関する発達研究生体内をフラット上皮、例えば、彼らは重要な貢献を認識、キイロショウジョウバエ表皮で最初行った偏光細胞遊走と細胞シートの動き9、ジャンクション ダイナミクスとエンドサイトーシスの極性メンテナンス10の人身売買。3 D体外と体内の MDCK 細胞とc. の elegansの腸、尿細管上皮細胞の内腔の形態形成解析, 最近識別したドの細胞内輸送の要件novo (尖) ドメインと腔器官および11,12,13を位置決めします。厚みの鋼管 (フラット) 対上皮細胞は細胞の非対称性の 3次元解析のための利点それは内腔側のアピカル膜、切端側接合、外側の膜の優れた視覚的に区別を可能にするので、細胞内小器官の位置。これらの視覚の利点に線虫モデル追加の体外、発達軸、透明性、ボディ計画、インバリアントと定義された細胞系譜、分析の単純化 (遺伝) と以下の付加的な利点。
線虫自体は、その透明性と単純なアーキテクチャを作る同様に管状の臓器管と内腔の形態の視覚的分析に直接アクセスできる管状構造の回虫です。その腸 (21 または 22 セル時々)14の 20 セル単一前駆細胞 (E) から派生するため 9 INT リングの左右相称なチューブにインターカレーション一歩二層上皮から開発 (細胞の 4 つ、最初のリング;図 1概略)14,,1516。腸の系列と組織分析、核アイデンティティ17を介してノマルスキー光学およびその後ラベルの付いた膜を介して蛍光顕微鏡最初によって決まりますがその形態形成に重要な洞察力を提供します。特定方向の細胞分裂の動き (例えばインターカレーション、左右非対称、前部と後部のチューブ回転)14,18 細胞自律的および細胞非自律的要件.初期の内胚葉細胞の仕様、このクローン モデル器官の開発を制御する遺伝子調節ネットワークよく特徴付けられて19,20.ここでは、フォーカスはただし、単一の尿細管細胞の偏光膜と内腔の膜、細胞骨格構造、このプロセスに伴う細胞内小器官の細胞の非対称性の解析です。分析はどこ (微細構造レベルの微絨毛によって区別) のすべて頂端膜内腔に直面し、すべての基底膜直面アウター チューブ表面膜互いに接触、このチューブのシンプルさによって促進されます。接合による管腔膜から分離 (図 1の模式図; c. の elegansの参照参照 (16,21)-タイトの所属する組織や単接合部品)。頂側膜器官、内腔の形態と同一です。さらに、成人腸細胞 - この小動物の (を除く排泄セル) の最大細胞 - のサイズおおよその細胞の要素、例えば体内視標追跡を許可する哺乳類のセルのサイズ通常は小胞の軌跡は体外培養皿にしようとしました。
この細胞と細胞内局在の解析を目的として、適切なラベルを付けることは重要です。腸の遠藤やプラズマ膜ドメイン、接合、細胞骨格構造, 核とその他の細胞小器官は、その特定分子コンポーネントのラベル化による視覚化できます。このような多くのコンポーネント、特徴づけられているそして発見される続けます (表 1いくつかの例を与えるし、リソースを参照)。例えば、細胞膜にポスト ゴルジ小胞を介してゴルジに ER と腸内システムの鋼管および/または小胞のコンパートメントを区別する様々 な分子は、識別された22をされています。特定蛋白質 (と同様、脂質、糖質) どちらかラベル付けできますが、直接または間接的結合蛋白質を介して。このプロトコルはその場で抗体染色固定標本は、2 つの標準的な分類の技術の 1 つに焦点を当てて (排泄管 tubulogenesis 他手法の2 - の説明のために付属の紙を見る体内標識蛍光タンパク質融合 - 経由; 腸に直接適用されます。テーブル2の例を示します腸管特異的発現プロモーター腸へのような融合蛋白質の表現をドライブするために使用できます)。ダブル複数分類のどちらの方法でも両方プラス追加化学染色の組み合わせ、または、詳細な視覚解像度を大きくとの共局在の時空間変化の検討し、特定の募集分子や細胞レベル下のコンポーネント (図 2)。固定と染色免疫染色手順中に表示緑色蛍光タンパク質 (GFP) のこのプロトコル サポートの保存で説明されている手順。イメージングのための検出のポイントし、標準的な顕微鏡手順 (蛍光性解離性と共焦点顕微鏡) 経由で表現型が tubulogenesis の特性説明(図 3, 4)。これらより高い解像度 (ここでは説明しません) インスタンス, 高分解能顕微鏡および透過電子顕微鏡のためのアプローチをイメージングする拡張できます。
キーの強さがこのシステムは、成人期を通じて胚から、さまざまな発達段階で個々 の細胞の極性を分析する能力です。ERM - 1、エズリン ラデキシン モエシン家族23,24 の非常に節約された膜アクチン リンカー ラベルを介して単一セルのレベルで開発中アピカル膜ドメインと腔器官を追跡ことができますたとえば、.ERM 1 は、胚管形成時に頂端膜器官 (1) を視覚化する偏光の細胞分裂と移行 (頂角インターカレーション中ルーメン周辺細胞移動)15; 付随して発生したとき(2) 細胞分裂または移行の不在で進む後半の胚および幼生管延長中(3) 偏光膜ドメインが (図 1) を維持、成人の腸管で。拡大の後分裂幼虫上皮におけるde novo偏光膜器官はほとんど体内と体外の上皮細胞極性モデルでは不可能です、偏光組織の形態形成からこうして分けることが単一セルの解像度 (例: 3 D MDCK 嚢胞モデル8) を含みます。この設定は他のコンポーネントの表示、(特に、L1 幼虫の段階で細胞が細胞質・核の比率が高い) 機会を提供しますに固有のこれらの細胞内の変更を区別するために偏光膜器官 (例えば人身売買の軌道の向きかえ) 偏光の細胞分裂と移行に必要な付随してそれらから。
線虫の遺伝的多様性はよく知られている25です、任意の生物学的問題の分子分析のための強力なモデル システムになります。形態形成に関する研究、例えば、野生型株、蛍光マーカーやこの欠陥または利得の-機能喪失変異体興味 (例えば膜) の構造がラベル付けされて形質転換株を始めることができます。構造体です。典型的な逆遺伝学的研究 (通常生産関数の利得や削減、結果の損失と点突然変異の突然変異誘発によって変更 (例:ターゲットの削除によって)、生殖興味の遺伝子の削除、突然変異を生成するかもしれません遺伝子) の RNAi によりその成績証明書を削減または。RNAi のc. の elegans26で供給することにより使いやすさは、興味の遺伝子の大規模なグループを調べる対象となる画面のデザインにも適しています。遺伝モデル有機体の間違いなく最大の強みは生体内で前方の画面 (例えば突然変異、組織的または全ゲノム RNAi 画面) の表現型の分子原因に対する公平な調査を許可するを実施する能力関心します。公平なビジュアルでは例えば、RNAi線虫tubulogenesis 画面で、ERM 1 ラベル頂端膜、遺伝子組換え動物から始まる魅力的な可逆的腸管極性変換と異所性内腔表現型、使用を発見しました。ここではこのタイプの分析のための例として。この画面は、この極性を引き起こしている特定の分子欠陥としてスフィンゴ糖脂質 (GSLs; 義務づける膜脂質、GLS 生合成酵素遺伝子の識別される) の枯渇および小胞のコート クラスリンとその AP 1 アダプターのコンポーネントを識別されます。変換の表現型、それにより分子を人身売買として生体内でこれらの特性の頂端膜の極性とルーメン12,13を位置決め手掛かり。特定の遺伝的変異/形態形質とを開始するときのような画面 (または単一の遺伝的/RNAi 相互作用実験) がも関心 (紙に、排泄に伴う参照の 2 つのまたは複数の遺伝子間の機能的相互作用を調べることができます。このような分析の例の運河)2。このプロトコルは、形態形成の分析の特定の利点で、直接失われる前方の画面での表現型の原因遺伝子を特定する能力に加えて RNAi に焦点を当てください。形態形成をしばしば演出遺伝子製品は、用量依存的に動作したので、RNAi は通常表現型のスペクトルの生成に成功。有益な機能の部分的な損失の表現型を生成する機能はまた重要である tubulogenesis 遺伝子の大半が不可欠であると彼らの損失が不妊や初期胚性致死を引き起こす可能性を問題に対処に役立ちます。このプロトコルは、この困難を克服するために条件付きの RNAi の戦略が含まれています、最適な表現型の突然変異誘発によって生成された対立シリーズなどの広範なスペクトルを生成する方法を示します。

<table><tbody><tr><td>抗体染色</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>poly-L-リジン</td><td>Sigma</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A949SK-4</td><td></td></tr><tr><td>トゥイーン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-213-612</td><td></td></tr><tr><td>パーマウント</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>粉ミルク</td><td>シグマ</td><td>MT409-1BTL</td><td></td></tr><tr><td>一次抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MH27(マウス)</td><td></td><td></td><td>濃度:1:20リソース:発生研究ハイブリドーマバンク。</td></tr><tr><td>MH33(マウス)</td><td></td><td></td><td>濃度:1:10リソース:発生研究ハイブリドーマバンク。</td></tr><tr><td>抗ICB4(ウサギ)</td><td></td><td></td><td>濃度:1:5 リソース:マリオdeボノ(英国医学研究評議会)</td></tr><tr><td>抗PAR-3(ウサギ)</td><td></td><td></td><td>濃度:1:50 リソース:ケネス・J・ケンフューズ(コーネル大学)からの贈り物</td></tr><tr><td>Secondary antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Floor 568(抗ウサギ)</td><td>ABCam</td><td>AB175471</td><td>濃度:1:200</td></tr><tr><td>Cy5(抗マウス)</td><td>Life technologies</td><td>A10524</td><td>濃度:1:200</td></tr><tr><td>TRITC(抗ウサギ)</td><td>Invitrogen</td><td>T2769</td><td>濃度:1:200</td></tr><tr><td>FITC(抗マウス)</td><td>Sigma</td><td>F9006</td><td>濃度:1:100</td></tr><tr><td>標識化学物質</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-Phalloidin</td><td></td><td></td><td>濃度:1:100 リソース:分子プローブ-T7471</td></tr><tr><td>材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>真空グリース シリコーン</td><td>ベックマン</td><td>335148</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>4448</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡カバースリップ (22x22-1)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans 関連</強い></td><td></td><td></td><td>Reference 29 for standard C. elegans Culture and Maintenance Proceduresを参照してください。</td></tr><tr><td>LB Mediumおよびplates</td><td></td><td></td> <td>プロトコルのための参照29を参照してください。</td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>Acros Organics</td><td>611845000</td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出物</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>シグマ</td><td>S7653</td><td></td></tr>バ<tr><td>クト寒天</td><td>BDバイオサイエンス214040</td><td></td><td></td></tr>アン<tr><td>ピシリン</td><td>シグマ</td><td>A0116</td><td></td></tr>テ<tr><td>トラサイ</td><td>クリンフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP912</td><td></td></tr><tr><td>M9Medium</td><td></td><td></td> <td>プロトコルについては、リファレンス29を参照してください。</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>NGM plates</td><td></td><td></td><td>参照29 プロトコル用。</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Σ</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>ペプトン</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>Acros Organics 611845000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214040</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>コレステロール</td><td>Σ</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Σ</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</sub</td><td>>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>RNAi plates</td><td></td><td></td> <td>プロトコルについては、リファレンス30を参照してください。</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Σ</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>ペプトン</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>Acros Organics 611845000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214040</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>コレステロール</td><td>シグマ</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>US Biological</td><td>I8500</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2648</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>FisherScientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>次亜塩素酸ナトリウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>50371500</td><td></td></tr><tr><td>Bacteria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 bacteria</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT115 bacteria</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ゲノムワイド RNAi ライブラリー Ahringer ゲノムワイド RNAi フィーディングライブラリー (ref 30,49,50)</td><td>出典:BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C. elegans ORF-RNAiフィーディングライブラリー(ref51)</td><td>出典:BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging related</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9221-500</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>SMZ-U</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡 高出力ステレオ蛍光アタッチメント (Kramer Scientific社)、CCD カメラ (Q キャプチャーソフトウェア付き)、X-Cite 蛍光灯 (Photonic Solutions)オ</td><td>リンパス</td><td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>ライカ マイクロシステム</td><td>TCS SL</td><td></td></tr><tr><td>レーザー走査型共焦点レンズを ECLIPSE Ti-E inverted に搭載顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>C2</td><td></td></tr></tbody></table>

細胞間腔の形態形成と単一細胞レベルでのin vivo偏光膜生合成のためのモデルとして線虫腸: 抗体の汚損、rnai 損失の機能解析、イメージングによるラベリング

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

多管、すべての内部器官の基本単位は、互いおよび/または細胞外マトリックスへのお問い合わせルーメンと基底膜の内側を覆う細胞膜と偏光の上皮や内皮細胞で構成されます。この特徴的な膜の非対称性を確立・器官形成の間に維持する方法はまだ細胞生物学の未解決の質問です。このプロトコルでは、頂端膜と内腔形成に重点を置いて、管の形成の間に偏光膜生合成の解析のためのモデルとして線虫腸をについて説明します。20 セル線虫 c. エレガンス一層腸上皮は単一セルのレベルの分析を許可する単純な左右相称なチューブに整理されます。偏光膜は付随して偏光の細胞分裂と初期胚発生がde novo偏極移行で発生します、もはや増殖し、移動する細胞膜器官が幼虫の成長を通して継続します。後者の設定では、同時にこれらのほとんどの極性モデルを区別することは困難異なる偏光プロセスを仲介する細胞の変化を分離することができます。頂、基底膜-、接合部-細胞骨格、-内コンポーネントのラベルし GFP の融合蛋白質によって開発全体を通して追跡かその場で抗体の汚損によって評価。一緒に生物の遺伝的多様性、 c. の elegans腸はこうして視覚、発達、ユニークな体内モデルと偏光膜および管器官の遺伝子解析を提供します。ここで説明した特定のメソッド (すべての標準) を含める方法: 抗体の汚損; 腸細胞レベル下のコンポーネントにラベルを付ける通常重要な tubulogenesis の遺伝子に適応した機能喪失研究によって偏光膜生合成に関与する遺伝子を解析します。極性; さまざまな発達段階で欠陥を評価します。落射蛍光、差動干渉の対照 (DIC)、共焦点顕微鏡による表現型を解釈します。視覚的な欠陥を定量化します。このプロトコルは、上皮細胞極性、膜器官、管および内腔の形態形成に関与する多くの場合非常に節約された分子のいずれかを分析に適応することができます。

このプロトコルでは、分子を分析、偏光膜の合成と内腔の形態形成単一セルおよび細胞内レベルでのc. の elegans腸内を表示する方法について説明します。20 セルの単一層にされた線虫腸は監督の細胞分裂と半ば胚発生中に移行によって形成されます。この時間、偏光膜のドメインが定着、まだde novo偏光膜器官が成熟したの継続しますが、偏光解析に焦点を当てることができます 4 つの幼虫の段階で上皮を展開すると、成人期まで、膜器官 (図 1 a)。
線虫の細胞および細胞レベル下のコンポーネントを可視化、2 つの戦略は、一般的に使用される: 蛍光抗体法 (セクション 1; は、このプロトコルの詳細図 2, <strong class="xfi...

透明な線虫の腸、「体内組織商工会議所「多細胞 tubulogenesis の中に apicobasal の膜と内腔の生合成単一セルおよび細胞内レベルでの勉強のためとして使用できます。このプロトコルでは、分子レベルでこれらのプロセスを分析するミクロ アプローチ、機能喪失遺伝的/RNAi 標準ラベルを結合する方法をについて説明します。

細胞間腔の形態形成と単一細胞レベルでのIn Vivo偏光膜生合成のためのモデルとして線虫腸: 抗体の汚損、RNAi 損失の機能解析、イメージングによるラベリング

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

これら標準的な手法を組み合わせた全体の目的は、C.elegansの腸管を用いて、単一細胞および細胞内レベルでの極性膜のバイオジェネシス（生合成）とルーメン（管腔）形態形成のin vivo解析を行う方法を実証することです。本手法は、形態形成中および形成後に、頂端膜ドメインと基底側膜ドメイン、およびその他の細胞内非対称性がどのように確立され維持されるかといった、極性とバイオジェネシスの分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。このモデルシステムの主な利点は、わずか20個の細胞からなる透明な単層組織であるため、in vivo組織チャンバー内で生存させることができ、単一細胞の極性膜およびルーメンのバイオジェネシスを解剖的に解析できる点にあります。これらの手法は、C.elegansの他の形態形成表現型の解析にも応用可能ですが、ここでは膜生合成、特に頂端膜およびルーメン（管腔）の生合成の解析に焦点を当てます。本手順には、固定動物および生体動物における高度なイメージング技術が含まれており、膜ドメインと細胞内コンポーネントを区別し、C.elegansの腸におけるルーメン形態形成の表現型を特定します。この腸管形成に関するビデオは、排泄管の管形成に関するビデオと共に提供されており、極性膜生合成のin vivo解析において相互に補完的なモデルとなっています。蛍光標識融合タンパク質を発現するトランスジェニック動物の作製によるラベル化については、排泄管の管腔形成分析に関する付随ビデオで説明されています。これらの動物は、RNAi実験に直接利用することが可能です。通常、これら一連の手順の組み合わせにおいて、第3世代が最初の段階となります。このビデオは、動物を固定する必要がある代替標識法である抗体染色から始まります。これらの異なる標識手順を組み合わせることができ、通常、最終的なイメージング解析には免疫組織化学が用いられます。また、本プロトコルでは、両方の標識手順に有用な、腸管特異的な膜マーカープロモーターおよびその他のリソースの例を提示しています。免疫組織化学のデモンストレーションに続き、このビデオでは、RNAiを用いて極性と管腔形態形成の表現型を探索するため、腸の頂端膜をERM-1 GFPで標識したトランスジェニック系統を使用します。まず、線虫を固定するためのスライドグラスを準備します。ポリ-L-リジンを30 µL、スライドグラス上にピペットで滴下し、別のスライドグラスをその上に重ねてから、2枚を同時に落下させて溶液を両方の面に均一に広げます。次に、2枚のスライドを剥がし、30分間自然乾燥させます。続いて、液体窒素を満たした容器に平らな金属ブロックを入れます。プレートをM9溶液で洗浄し、線虫を含むM9溶液を約10 µL転移させます。あるいは、ワームをピックアップし、スライドにM9を加えます。ワームを移した後、カバーガラスを、端が少しはみ出すように、彼らの上に静かに十字に掛けます。次に、横方向への動きが出ないように、カバーガラスを静かに押さえます。直ちにスライドを液体窒素中のメタルブロックに移し、凍結させます。5分後、はみ出した端を利用してカバーのスリップを弾いて外します。キューティクルを適切に割るため、この操作は迅速に行ってください。次に、スライドを-20°Cのメタノールを満たしたガラス製コプリンジャーに浸します。5分後、スライドをアセトンを満たしたガラス製コプリンジャーに移し、同じ温度でさらに5分間保持します。スライドはそのまま直接染色するか、-20°Cで保存してください。スライドをアセトンから取り出し、室温で自然乾燥させます。次に、スライドの裏面にワセリンで円形の壁を作る位置に印を付け、ワセリンの壁を構築します。この操作中にワセリンを擦り落とさないようにしてください。次に、濡れたペーパータオルを入れた容器で湿室を用意し、その中のラックにスライドを配置します。タオルとスライドの間、および隣接するスライド同士が接触しないようにしてください。その後、ジェリーサークル内の領域が覆われる十分な量のPBSをピペットで加えます。ピペットチップを円の端にそっと置き、液体がワームの上にスムーズに広がるようにします。次に、蓋を閉めて5分間待ちます。5分後、スライドを傾けながら、ワームをスライドから失わないように注意してPBSをゆっくりと吸引します。次に、新鮮に調製したブロッキング溶液でジェリーサークルを慎重に満たします。そして、室温で15分間スライドをインキュベートします。15分後、ブロッキング溶液を一次抗体を含むブロッキング溶液に交換します。その後、スライドを4 °Cで一晩インキュベートします。翌日、一次抗体を除去し、ブロッキング溶液を3回添加・除去してスライドを洗浄します。ブロッキング溶液を添加するたびに、10分間インキュベートしてください。次に、ブロッキング溶液で希釈した二次抗体を加え、スライドを室温で1時間インキュベートします。その後、スライドをブロッキング溶液で2回、続いてPBSで1回洗浄します。次に、検体が乾燥しないように注意しながらPBSを可能な限り除去し、検体周囲のジェリーを慎重に取り除きます。封入剤を標本に1滴滴下し、カバーガラスを被せ、マニキュアで封印します。その後、スライドを4°Cの暗所に保存します。RNAiライブラリープレートを-80°Cからドライアイス上に移動させます。シーリングテープを取り除きます。次に、目的のクローンを選択培地に移します。その後、クローンをストリークし、細菌を一晩培養します。ライブラリープレートを-80°Cのフリーザーに戻す前に、新しいシーリングテープを貼付します。翌日、プレート上のコロニーを、アンピシリンを含む1 mL分注の液体培地に接種します。その後、37°Cで約14時間振盪培養します。翌日、クローンごとに 200 µL ずつ別々の RNAi プレートに播種します。プレートを乾燥させた後、室温で一晩インキュベートし、RNAi の産生を誘導します。その翌日、標的とする特定の遺伝子がラベルされた各 RNAi プレートに、L4 段階のワームを 5 本ずつ移します。その後、プレートを通常20 °Cのインキュベーターに移します。まず、明視鏡を用いて、低倍率および高倍率でコントロール群とRNAi個体を観察します。次に、適切なフィルターを用いて、蛍光灯下でコントロール群とRNAi個体を観察します。RNAi個体が配置されたプレート全体を、左上から右下に向かって系統的にスキャンし、表現型を探索します。関心のある個体を探してください。選択したRNAi表現型をより詳細に検討するには、腸に焦点を合わせ、ズーム機能を用いて管形成および管腔形態形成の表現型を評価します。共焦点顕微鏡で目的の線虫を観察するために、まず手動でマウントして固定します。ガラススライド上に、真空グリースまたはペトロラタムで薄い円を描きます。グリースの層は薄く、0.1 millimeterを超えないようにしてください。次に、円の中央に10 millimolarのアジ化ナトリウムを約3.5 microliters加えます。溶液が乾燥する前に、実体顕微鏡下で目的の虫体を速やかに溶液の中へ選び出します。次に、カバーガラスを静かに被せ、30分以内に個体を撮影します。軽く圧力をかけ、虫体が溶液中で浮いていないことを顕微鏡下で確認してください。共焦点顕微鏡を用いて、低倍率で虫を探索し、ピントを合わせます。次に、60倍または100倍の油浸対物レンズを使用して、腸を観察し、画像を撮影します。続いて、適切なチャンネルの蛍光光の下で個体を観察し、目的の細胞欠損を示す領域を選択します。光退色を避けるため、迅速に操作してください。次に、レーザースキャニングに切り替え、スキャン範囲を腸の背側と腹側に設定して、画像を腸の範囲に限定します。一連の画像をキャプチャし、後でそれらの画像を統合して1枚の投影画像を作成します。本プロトコルでは、頂端膜と管腔の形態形成が同時に進行する、発達中のC.elegans腸における極性膜生合成の分子分析および視覚的解剖方法について説明します。頂端膜および基底外側膜ドメイン、膜関連接合部、および腸管腔を分離し、発達過程におけるそれらの相互関係を検討することが可能です。これらの細胞内コンポーネントは、付随する論文に記載されている通り、蛍光標識抗体または蛍光融合タンパク質を用いて、二重または三重標識を行うことができます。解剖用蛍光顕微鏡を用いることで、管腔の粗大な欠損を迅速に走査することが可能です。GFPに結合した頂端膜細胞骨格リンカーERM-1は、RNAiスクリーニングに有用な、強固に発現するマーカーです。このマーカーを用いることで、一連の新規の腸管腔形態形成および極性の表現型と、その原因となる遺伝子欠損が明らかになりました。その後、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて取得した高倍率画像により、表現型をより詳細に検討し、潜在的な欠損についての理解を深めました。一部の表現型については定量化が可能でした。定量化を用いることで、そのような欠損を比較し、発生過程における進行を追跡しました。このビデオを視聴することで、免疫染色による腸管膜および内膜区画の標識方法と、極性膜および管腔形成のRNAi表現型の機能解析方法について、十分に理解することができます。

the-c-elegans-intestine-as-model-for-intercellular-lumen

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

イメージング C.エレガンス</em落射蛍光顕微鏡とオープンソースソフトウェアを使用して>胚

この記事では、線虫の胚発生の初期のイベントの可視化のための手法について説明...

の初期発生のタイムラプス顕微鏡線虫（Caenorhabditis elegans）

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線虫の凍結亀裂:染色のために内部の線虫組織を露出させる方法

このプロトコルは、画像に線虫（Caenorhabditis elegans）の胚における組織内の細胞を分割する方法について説明します。いくつかのプロトコルは、初期胚の画像細胞分裂に、このプロトコルはどのように中期後期胚形成の間に開発し、組織内の細胞分裂像に説明して方法について説明している。...

中に神経芽細胞細胞質分裂を可視化する<em&gt; C.虫</em&gt;胚

ここでは、C.エレガンスの発生過程を追跡し定量化する方法を示しています。提示されている方法は、簡単に実装できるオープンソースのツールに基づいています。3D細胞形状モデルの再構築方法、細胞内構造の手動追跡方法、皮質収縮流の解析方法などを実演します。...

の発達過程を追跡し、定量化<em&gt; C。エレガンス</em&gt;オープンソースのツールを使用しました

線虫 c. エレガンスの排泄管はde novo偏光膜生合成の視覚的生体内解析のためのユニークな単一細胞モデルです。このプロトコルでは、標準的な遺伝学的/RNAi とアプローチ、同定と解析分子単細胞 tubulogenesis...

細胞内の内腔の形態形成と単一細胞におけるIn Vivo偏光膜生合成のためのモデルとして線虫排泄管: GFP 融合、RNAi 操作画面やイメージングによるラベリング

体内組織から腸管の 3 D 構造の隔離のためのプロトコルを提案して地下行列体外埋め込み organoids、ディテールの異なる固定と、微小管の免疫分類のために最適化されたプロトコルを汚すcentrosomal、および接合部のタンパク質だけでなく細胞マーカー Lgr5...

微小管と 3 D培養腸 Organoids とEx Vivo腸組織における Centrosomal 蛋白質の免疫蛍光ラベリング

ここでは、 elegans胚における高分解能顕微鏡、計算ツール、および単一細胞標識法を用いて、neurodevelopment...

等方性光シート顕微鏡と自動細胞系譜分析による、細胞内分解能を Caenorhabditis elegans 胚発生

C.エレガンス胚発生を解析するセミハイスループットイメージング法とデータ可視化ツールキット

細胞外細菌やオルセーウイルスや微胞子虫(真菌)などの細胞内病原体を含む腸内微生物は、野生の カエノラブディティス 線虫と関連していることがよくあります。この記事では、 C.エレガンス...

RNA蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)による カエノラブディティスエレガンス 腸における微生物のコロニー形成と感染を可視化

このプロトコルは、マイクロ流体ベースの C.エレガンス...

すべての幼虫期にわたる高解像度 のC.エレガンス イメージング

学ぶC. elegans腸を用いた偏光膜生合成と内腔形態形成のin vivo解析法。抗体染色、RNAi、蛍光イメージングで単一細胞レベルの膜極性と内腔形成を可視化し、形態発生の分子メカニズムを解明する。

細胞間腔の形態形成と単一細胞レベルでのIn Vivo偏光膜生合成のためのモデルとして線虫腸: 抗体の汚損、RNAi 損失の機能解析、イメージングによるラベリング

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