Name: 光分留と標準的な顕微鏡装置を用いたマウス中脳のドーパミン作動性ニューロン数の薬剤の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 学ぶマウス黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの無作為ステレオロジー計数法。標準的な顕微鏡装置を用いてパーキンソン病の前臨床研究で神経細胞数を正確に推定する手法です。

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著者は、専門家の技術援助; Keali Röhm、ルイザ Frieß、平家メンツェルに感謝してヘルガ Brünner 動物のケアのためにクリストファー s. 病棟の生成と ImageJ ソフトウェアの光 disector グリッドのプラグインの配布します。

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C. w. i.、メルツ医薬品、LLC、テバ; の科学的なボードを務めていますイプセン、メルツ医薬品、LLC は、アラガン株式会社からの旅行のための資金を受けた応募作品外メルツ、テバと、アラガン社からスピーカーの謝礼を受けた。J. V. ボストンサイエンティフィック、メドトロニック、および AbbVie のコンサルタントを務めて、提出した応募作品外メドトロニック、ボストンサイエンティフィック、AbbVie、ビアル、アラガン社、および GlobalKinetics から謝礼を受けた。

ステレオロジーは、ティッシュの処理から始まります。SN 組織のシリアルの切削は、解析中にセクションの損失を防ぐために慎重に行う必要があります。さらに、1 つの重要なステップは、ステレオロジーを実行するとき、SN の左から右を区別するために 1 つの半球をマークします。脳幹の上の部分に小さな穴を配置すると、提示された研究で最良の結果が生成されます。また、組織が光分留メソッド要求の使用以来、免疫、抗体、中に他のインキュベーション流体組織の浸透でより一般的に使用される 5-10 μ m ではなく、約 30-40 μ m の厚さのセクションでカットします。免疫組織化学染色保障されなければならない、このような洗剤を使用しています。
免疫は、SN から内側のある腹側被蓋野 (VTA) 内回抗体ラベル SN ニューロンとニューロンを用いたドーパミン作動性ニューロンのドパミン神経細胞染色します。したがって、別の臨界点 sn ステレオロジーを実行するときは、標準的な免疫組織化学的または組織学的染色によって専ら SN ニューロンを視覚化することはできませんのでマウス SN 解剖学の知識です。代わりに、...

神経細胞数の定量化は、前臨床パーキンソン病研究では神経変性疾患中脳 (SN)1,2内のレベルを決定する極めて重要です。関心の領域で細胞数の公平な薬剤推定は、ゴールド スタンダード3,4、5と見なされます。
公平な立体の出現の前のセクションでのニューロンの数をカウント セル ニューロンがセクションで見えて来ること変数の確率を修正するプロファイルを操作することによって評価しました。最も一般的に使用される方法の 1 つは、アバクロンビー6によって記述された定量化された細胞数の補正だった。このメソッドは、隣接する薄いセクションで同じセルのフラグメントが見つかった場合に何度も示すことができる、細胞を考慮ましょう。したがって、アバクロンビーや他の作家は、形状、サイズ、およびカウントの細胞7,8の方向を知るのために必要な方程式を生成しました。ただし、これらの仮定された通常は実現し、したがって実際のセル数 (すなわちバイアス) からの系統誤差との分岐につながった。また、バイアスを追加サンプリング3縮小できませんでした。
光の分留を使用してセル番号の薬剤の推定直接定義された、3 次元ボリュームのセル番号を直接推定する数学的原理が適用されます。このメソッドの利点は、形状、サイズ、およびカウントされて細胞の向きについての仮定を必要としないことです。したがって、推定の細胞数は真の値に近い、サンプル サイズが増加3(すなわち、公平な) 近づきます。すぐに使える商用ステレオロジー システムが開発されているステレオロジーを使用して公平な方法を維持するとき多くの規則が続かれなければならないので (レビュー、シュミッツとホフ, 2005年4を参照してください)。特殊な立体システム実装図形、サイズ、分布、およびの向きから自立につながる薬剤の評価のために事前定義されているプローブとサンプリング方式のデザイン ベースの薬剤方法、分析4,9セル。ただし、市販の立体システムは高価です;これは新しい研究での実装に制限があります。
本研究の目的は SN、光分留方式を採用した、標準的な顕微鏡装置 (すなわち、光を用いたマウスにおけるドーパミン細胞数のデザイン ベースの薬剤評価のため使用可能な手法の開発、顕微鏡、顕微鏡の標準ソフトウェア、および電動 x、y、z ステージ)。このため、マウス脳組織を処理する方法、および公平な立体のデザイン ベースを用いた SN 細胞数を推定する方法についてステップバイ ステップ ガイドが表示されます。さらに、エラー (CE) の係数と推定される細胞数の計算のテンプレートが提供されます。
ここで説明したメソッドは、SN の分析に限定されていないが、マウスまたはラットの脳の他の解剖学的に定義された地域での使用に適応することができます。例えば、海馬10や11の軌跡青斑核神経細胞の数を推定する公平なステレオロジーを使用されています。さらに、アストロ サイト12とミクログリア13など、神経細胞以外の細胞型も同様に評価することができます。したがって、このメソッドは、科学者の研究で公平なステレオロジーを実装するつもりが、ステレオロジー システムを購入するお金の多くを費やすことをいとわないされてすることができます。

<table><tbody><tr><td>Paxinosマウスアトラス</td><td></td><td></td><td>マウス脳 ジョージPaxinos キースB.J.フランクリンCopyright @2001 アカデミックプレスCD ROMデザイン&ポールハラス</td></tr>脳<tr><td>マトリックススライサーマウス</td><td>Zivicインスツルメンツ</td><td>BSMAS 001-1</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒドメル</td><td>ク</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖/ D(+)サッカロス</td><td>ロス</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>イソペンタン</td><td>Roth</td><td>3927.1</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Merck</td><td>1040931000</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32205-1L</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水成分:</強></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31434-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二水素カリウム</td><td>メルク</td><td>1048731000</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二ナトリウム二水和物</td><td>メルク</td><td>1065801000</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>メルク</td><td>1049360500</td><td></td></tr><tr><td>正常なヤギ血清</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Σ</td><td>A4503-100G</td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>X100-100ml</td><td>洗剤</td></tr><tr><td>3,3-ジアミノベンジジン-テトラ塩酸塩/DAB錠 10mg pH 7.0</td><td>ケムエンテック</td><td>4170</td><td></td></tr><tr><td>H2O2/ 過酸化水素 30%</td><td>メルク</td><td>1072090250</td><td></td></tr><tr><td>アビジン/ビオチン試薬</td><td>Thermo Scientific</td><td>32050</td><td>Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100</td></tr><tr><td>rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody</td><td>abcam</td><td>Ab112</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>ビオチン化ヤギ-抗ウサギ IgG H+L</td><td>ベクター研究所</td><td>BA-1000</td><td>1:100</td></tr><tr><td>StereoInvestigator version 11.07</td><td>MBF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BX53 microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visiview</td><td>Visitron Systems GmbH</td><td>3.3.0.2</td><td></td></tr><tr><td>Axiophot2</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH</td><td>Version 4.7</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-TEK OCT</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>ドライアイス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>グリッド オーバーレイ プラグイン</td><td>Wayne Rasband</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html</td></tr><tr><td>セルカウンタープラグイン</td><td>Kurt de Vos</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).&nbsp;</td></tr><tr><td>光学式二分線マクロ</td><td>クリストファー・ウォード</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6N 雄マウス</td><td>チャールズ川、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus コーティングされたオブジェクトスライド</td><td>ランゲンブリンク、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25G ニードル Microlance 3</td><td>BD</td><td>300400</td><td></td></tr><tr><td>REGLO アナログ輸液ポンプ</td><td>Ismatec</td><td>ISM 829</td><td></td></tr><tr><td>StereoInvestigator システム</td><td></td><td></td><td>StereoInvestigator バージョン 11.07</td></tr><tr><td>BX53 顕微鏡</td><td></td><td></td><td>BX53 顕微鏡</td></tr><tr><td>自己整列立体学</td><td></td><td></td><td>Visiview</td></tr><tr><td>Axiophot2</td><td></td><td></td><td>Axiophot2</td></tr></tbody></table>

光分留と標準的な顕微鏡装置を用いたマウス中脳のドーパミン作動性ニューロン数の薬剤の評価

Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

パーキンソン病臨床研究では、黒質中ドーパミン作動性ニューロンの損失の定量化を含む黒質線条体路の解析が不可欠です。合計ドーパミン作動性ニューロンの数を推定するには、公平なステレオロジー光分留メソッドを使用して現在のゴールド スタンダードと見なされます。光分留メソッドの背後にある理論は複雑、ステレオロジーが特別な装置なしに達成するために困難であるため、必要なソフトウェアを含むいくつかの市販の完全な立体システム純粋存在してセルの理由を数えます。専門ステレオロジー セットアップを購入はないので常に実行可能な多くの理由のため、このレポートは、方法を記述するドーパミン作動性神経細胞の薬剤の推定カウント標準的な顕微鏡検査機器、光学顕微鏡を使用してのイメージング ソフトウェアと解析のためのコンピューター オブジェクト テーブル (x、y、z 平面) モーターを備えられました。光分留メソッドを使用して薬剤の定量化を実行する方法のステップバイ ステップの説明は与えられたし、推定される細胞数算定のため事前にプログラムされたファイルが提供されます。このメソッドの精度を評価するために市販ステレオロジー装置から得られたデータとの比較を行った。匹敵する細胞の数は、こうして公平な立体のこのプロトコルの有効桁数を示すこのプロトコルとステレオロジー デバイスを使用して発見されました。

提案手法は, TH + 右 SN 7,363 と 7,987 セル間であったのと、SN、左のドーパミン作動性ニューロンの推定数を使用して、7,446 7,904 細胞間。したがって、ドーパミン作動性ニューロン (± SEM) の平均数は、SN 右と左の SN 7,675 ± 66 7,647 ± 83 細胞だった。各動物のため計算される CE は 0.08 より低かった (範囲: 0.073 0.079) (図 7)。商業的に特殊な立体を用いたこの方式の比較可能性を確認するためには、ステレオロジー セットアップ (図 8) を使用して SN セル番号も定量化しました。カウント パラメーター: グリッドのサイズ、130 × 130 μ m;カウント フレーム、50 × 50 μ m;ガード ゾーン、3 μ m の範囲のセクションを行った 100 x 1.25/開口 BX53 顕微鏡の目的。TH + SN ニューロン 〜 7,067 8,105 セル/SN ...

この作品には、標準的な顕微鏡装置 (すなわち、光学顕微鏡 (x、y、z のモーターを備えられたオブジェクト テーブルを使用してマウス中脳ドーパミン作動性神経細胞数の公平な薬剤推定手順プロトコル平面)、およびデジタル画像解析のためのパブリック ドメイン ソフトウェア。

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the ...

このプロトコルの全体的な目標は、標準的な顕微鏡装置を使用して、マウスSNのドーパミン作動性細胞数の設計ベースの立体推定を記述することです。この方法は、デザインベースの偏りのない立証学を使用して、前臨床パーキンソン病研究のためにマウス黒質のドーパミン作動性ニューロンの数を推定するのに役立ちます。この技術の主な利点は、市販の完全な立体学のセットアップを必要とせずに、標準的な顕微鏡装置で達成できることです。手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるLouisa Friezです。まず、パラホルムアルデヒド固定マウスの脳を脳マトリックスに入れ、ブレグマから0.74ミリメートル以上のカットを行います。SNを含む脳の尾側部分を0.1モルで4%PFAに移し、摂氏4度で一晩固定します。翌日、PFAを0.1モルPBS中の30%スクロースと交換し、さらに4°Cで2日間インキュベートしてサンプルを凍結保護します。脳がショ糖に沈んだ2日後、最適な切断温度の化合物で満たされたクライオモールドに組織を入れ、液体ドライアイスで冷却したイソペンタンで組織をゆっくりと凍結します。クライオスタットを使用して、コロナル平面内の30ミクロンのクライオ切片を連続的に切断します。脳幹の上部領域に小さな穴を開けて、右半球をマークします。bregma から -2.46 ミリメートルから始まり、bregma から 4.04 ミリメートルで終わる 4 つの一連のセクションを収集します。凍結保護剤で満たされたチューブに各セクションのセクションを移し、摂氏マイナス20度で保存します。顕微鏡と組み合わせたイメージングソフトウェアを使用して、チロシンヒドロキシラーゼ免疫組織化学的に染色されたSN切片のデジタル画像をキャプチャします。まず、セクションごとにランダムに選択された3つのカウントサイトで、セクションの実際のマウントと厚さを決定します。まず、上部のオフセットを表示をクリックして、セクションの上部を定義します。次に、ストップビュートップをクリックします。その後、ビューボトムオフセットをクリックし、次にストップビューボトムをクリックします。セクションの厚さを書き留めます。上部オフセットから 3 ミクロンを差し引いてガード ゾーンを計算し、結果を上部オフセット ボックスに入力します。次に、上部のオフセット番号から光学ディセクタの 13 ミクロンの高さを減算し、結果を下部のオフセット ボックスに入力します。次のパラメータ、ステップ14、サイズ1.00を選択します。ファイルを保存するディレクトリを選択します。シーケンスをクリックして、取得を開始します。画像が取得されたら、処理をクリックし、次のパラメータ、シーケンス、モンタージュ、および画像のオーバーラップが10%の高速ボックスとステッチボックスのすべての平面を選択します開始をクリックして画像をステッチします。これにより、分析用のスタックイメージが生成されます。まず、ファイルをクリックして画像を開きます。analyze and set scale コマンドを使用して、イメージのスケールを設定します。この手順から、定義されたサイズをピクセルからミクロンに変更します。プラグインを選択し、次にグリッドを選択し、次にグリッドタイプlinesコマンドを選択して、グリッドをランダムに挿入します。ランダムオフセットボックスにチェックを入れます。グリッド内の 1 つの正方形のサイズを 130 ミクロン x 130 ミクロンとして定義し、16, 900 平方ミクロンに等しくします。画像の種類を16ビットからRGBカラーに変更するには、画像をクリックしてからRGBカラーを入力します。substantia nigra pars compactaを見つけます。ペイントブラシツールで、ブラシ幅11を使用して領域を囲みます。[分析]、[スケールの設定]の順にクリックしてスケールの設定コマンドを元に戻します。次に、ミクロン単位ではなくピクセル単位で計算するスケールの削除をクリックします。スクリーンショットを撮り、画像ファイルを保存して、ImageJで新しいファイルを開きます。ブラシとブラシ幅 25 を選択します。SNに接触するすべてのグリッド正方形にマークを付けて、光学ディセクタを配置します。SN の一部を含むグリッド正方形を 1 つ選択します。ImageJ のカーソルで正方形の左上隅を測定し、開始 x 座標と y 座標を定義します。「光学式ディセクタ位置」というタイトルのスプレッドシートテンプレートを選択し、光学式ディセクタ位置を計算します。次に、プロトコルの書面に記載されているセルカウントスプレッドシートの計算を使用して、セル数を推定します。この低電力画像は、ドーパミン作動性ニューロンのTH染色後のマウス脳の切片を示しています。倍率が高いほど、TH陽性のドーパミン作動性ニューロンが描かれています。挿入図は、拡大拡大時のボックス化された領域を示しています。この画像は、マウスのSN全体を吻側から尾側まで覆う一連のTH染色SN切片を示しています。各セクションは、連続するセクションから120ミクロン離れています。マウスの右SNと左マウスSNのTH陽性ニューロンの数は、このビデオに示されている方法と市販の立体学システムを使用して推定されました。ここで見られるように、どちらの方法もセル数が同等であり、データセット間に有意差はありませんでした。パラホルムアルデヒドの取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には、保護手袋などの個人用保護具の着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。このビデオを見れば、光学フラクション法と標準的な顕微鏡装置を使用して、マウス黒質のドーパミン作動性ニューロン数の偏りのない立体推定を行う方法についてよく理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

ドーパミンは、はっきりとドーパミンニューロンの細胞体と樹状突起を含む脳核、で規制されています。ここでは黒質（SN）とげっ歯類では腹側被蓋野（VTA）の中​​脳核のドーパミン調節では、結果を最大化するために解剖し、サンプル処理のアプローチを説明し、その結果、結論と洞察力。...

黒質や腹側被蓋野のドーパミン規制の包括的なプロファイリング

このビデオは、α-シヌクレインの既成線維で前処理された胚マウスドーパミンニューロンにおけるα-シヌクレイン蓄積を定量化するプロセスを示しています。免疫蛍光法を用いて、α-シヌクレイン凝集体を含むドーパミンニューロンを固定、染色、定量する手順を概説しています。...

初代胚性マウスドーパミンニューロンにおけるα-シヌクレイン蓄積の研究

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光分画器技術を用いたラット脳組織における新規生成ニューロンの定量化

このプロトコルは、成体マウスの適応行動と脳修復の根底にある環境誘発性の脳変化を研究するための、2つの異なる環境操作と同時脳注入プロトコルを説明しています。...

成体マウスにおける中脳ドーパミンニューロンの数の環境モジュレーション

パーキンソン病（PD）では、黒質（SNC）ドーパミン作動性ニューロンは、運動機能障害につながる、退化します。ここでは、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）プロモーター配列によって駆動されるeGFPを発現するマウスから腹側中脳の神経細胞を培養する培養物から個々の蛍光ニューロンを収穫し、RNA-seqのを使用して、それらのトランスクリプトームを測定するためのプロトコルを報告しています。...

RNA配列決定およびTH-プロモーター駆動EGFP発現を使用して中脳培養における生活ドーパミン作動性ニューロンの信頼性の高い同定

ここでは、電気刺激刺激後のラット海馬における新しいニューロンの形成およびその生存を定量化するために使用される立体的方法、光学分画器を提示する。正確に実施されると、立体方法の感度と効率は、固定された所定の精度で正確な推定を保証する。...

電気ショック療法のラットモデルにおける細胞数の推定のための光学分画器技術

側坐核ドーパミン D1-アルファ受容体の同定は、中枢神経系疾患の中に D1 受容体の機能不全を明らかにするため重要です。特定の脳領域の RNA 分子を可視化する交配アッセイの in situ新規 RNA...

検出技術その場で革新的な RNA 側坐齧歯動物の核内ドーパミン D1-アルファ受容体の同定

ここでは、蛍光染色を使用してマーカー蛋白質、共焦点顕微鏡、コンピューターによる解析を基準にしてシナプス蛋白質の分布を決定する定量的アプローチについて述べる。...

蛍光抗体法を用いたマウス脳内シナプス蛋白質の不均質分布の定量化

脳領域の三次元構造内の神経線維の長さは、特定の神経構造の完全性または変性を定量化する信頼できるパラメータである。本稿では、マウスにおけるマイナート核内のコリン作動性繊維長を測定する立体定量法を例に説明する。...

マウス脳のマイナート核基底部におけるコリン作動性繊維長の立体的推定

ここでは、一次マウスドーパミンニューロンにおけるニューロンα-シヌクレイン蓄積を研究するための詳細なプロトコルを提示する。リン酸化されたα-シヌクレイン凝集体は、ニューロン内で、あらかじめ形成されたα-シヌクレイン線維で誘導される。免疫蛍光標識細胞の自動イメージングと偏りのない画像解析により、この堅牢なプロトコルは、α-シヌクレイン蓄積を阻害する薬剤の中~高スループットスクリーニングに適しています。...

原発性胚マウス中脳ドーパミンニューロンにおける前形成線維誘導α-シヌクレイン蓄積の研究

ここでは、ラットの実質的なニグラ・パルス・コンパクでのドーパミン作動性ニューロン数の半定量的決定のための自動化された方法を提示する。...

自動画像解析を用いたげっ歯類モデルのサブスタチングニグラにおけるドーパミン作動性ニューロン密度の半定量的決定

学ぶマウス黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの無作為ステレオロジー計数法。標準的な顕微鏡装置を用いてパーキンソン病の前臨床研究で神経細胞数を正確に推定する手法です。

光分留と標準的な顕微鏡装置を用いたマウス中脳のドーパミン作動性ニューロン数の薬剤の評価

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