光分留と標準的な顕微鏡装置を用いたマウス中脳のドーパミン作動性ニューロン数の薬剤の評価

このプロトコルの全体的な目標は、標準的な顕微鏡装置を使用して、マウスSNのドーパミン作動性細胞数の設計ベースの立体推定を記述することです。この方法は、デザインベースの偏りのない立証学を使用して、前臨床パーキンソン病研究のためにマウス黒質のドーパミン作動性ニューロンの数を推定するのに役立ちます。この技術の主な利点は、市販の完全な立体学のセットアップを必要とせずに、標準的な顕微鏡装置で達成できることです。

手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるLouisa Friezです。まず、パラホルムアルデヒド固定マウスの脳を脳マトリックスに入れ、ブレグマから0.74ミリメートル以上のカットを行います。SNを含む脳の尾側部分を0.1モルで4%PFAに移し、摂氏4度で一晩固定します。

翌日、PFAを0.1モルPBS中の30%スクロースと交換し、さらに4°Cで2日間インキュベートしてサンプルを凍結保護します。脳がショ糖に沈んだ2日後、最適な切断温度の化合物で満たされたクライオモールドに組織を入れ、液体ドライアイスで冷却したイソペンタンで組織をゆっくりと凍結します。クライオスタットを使用して、コロナル平面内の30ミクロンのクライオ切片を連続的に切断します。

脳幹の上部領域に小さな穴を開けて、右半球をマークします。bregma から -2.46 ミリメートルから始まり、bregma から 4.04 ミリメートルで終わる 4 つの一連のセクションを収集します。凍結保護剤で満たされたチューブに各セクションのセクションを移し、摂氏マイナス20度で保存します。

顕微鏡と組み合わせたイメージングソフトウェアを使用して、チロシンヒドロキシラーゼ免疫組織化学的に染色されたSN切片のデジタル画像をキャプチャします。まず、セクションごとにランダムに選択された3つのカウントサイトで、セクションの実際のマウントと厚さを決定します。まず、上部のオフセットを表示をクリックして、セクションの上部を定義します。

次に、ストップビュートップをクリックします。その後、ビューボトムオフセットをクリックし、次にストップビューボトムをクリックします。セクションの厚さを書き留めます。

上部オフセットから 3 ミクロンを差し引いてガード ゾーンを計算し、結果を上部オフセット ボックスに入力します。次に、上部のオフセット番号から光学ディセクタの 13 ミクロンの高さを減算し、結果を下部のオフセット ボックスに入力します。次のパラメータ、ステップ14、サイズ1.00を選択します。

ファイルを保存するディレクトリを選択します。シーケンスをクリックして、取得を開始します。画像が取得されたら、処理をクリックし、次のパラメータ、シーケンス、モンタージュ、および画像のオーバーラップが10%の高速ボックスとステッチボックスのすべての平面を選択します開始をクリックして画像をステッチします。

これにより、分析用のスタックイメージが生成されます。まず、ファイルをクリックして画像を開きます。analyze and set scale コマンドを使用して、イメージのスケールを設定します。

この手順から、定義されたサイズをピクセルからミクロンに変更します。プラグインを選択し、次にグリッドを選択し、次にグリッドタイプlinesコマンドを選択して、グリッドをランダムに挿入します。ランダムオフセットボックスにチェックを入れます。

グリッド内の 1 つの正方形のサイズを 130 ミクロン x 130 ミクロンとして定義し、16, 900 平方ミクロンに等しくします。画像の種類を16ビットからRGBカラーに変更するには、画像をクリックしてからRGBカラーを入力します。substantia nigra pars compactaを見つけます。

ペイントブラシツールで、ブラシ幅11を使用して領域を囲みます。[分析]、[スケールの設定]の順にクリックしてスケールの設定コマンドを元に戻します。次に、ミクロン単位ではなくピクセル単位で計算するスケールの削除をクリックします。スクリーンショットを撮り、画像ファイルを保存して、ImageJで新しいファイルを開きます。

ブラシとブラシ幅 25 を選択します。SNに接触するすべてのグリッド正方形にマークを付けて、光学ディセクタを配置します。SN の一部を含むグリッド正方形を 1 つ選択します。ImageJ のカーソルで正方形の左上隅を測定し、開始 x 座標と y 座標を定義します。

「光学式ディセクタ位置」というタイトルのスプレッドシートテンプレートを選択し、光学式ディセクタ位置を計算します。次に、プロトコルの書面に記載されているセルカウントスプレッドシートの計算を使用して、セル数を推定します。この低電力画像は、ドーパミン作動性ニューロンのTH染色後のマウス脳の切片を示しています。

倍率が高いほど、TH陽性のドーパミン作動性ニューロンが描かれています。挿入図は、拡大拡大時のボックス化された領域を示しています。この画像は、マウスのSN全体を吻側から尾側まで覆う一連のTH染色SN切片を示しています。

各セクションは、連続するセクションから120ミクロン離れています。マウスの右SNと左マウスSNのTH陽性ニューロンの数は、このビデオに示されている方法と市販の立体学システムを使用して推定されました。ここで見られるように、どちらの方法もセル数が同等であり、データセット間に有意差はありませんでした。

パラホルムアルデヒドの取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には、保護手袋などの個人用保護具の着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。このビデオを見れば、光学フラクション法と標準的な顕微鏡装置を使用して、マウス黒質のドーパミン作動性ニューロン数の偏りのない立体推定を行う方法についてよく理解できるはずです。