Name: アドレス指定可能な液滴マイクロ アレイによる単一細胞におけるタンパク質をカウント (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: 学ぶアドレス指定可能な液滴マイクロアレイを用いた単一細胞タンパク質定量法。p53発現異質性の解析により、がん細胞におけるタンパク質動態を解明し、細胞集団の個々の変動性を捉える革新的アプローチを理解する。

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ASR は、実験を設計プロトコルを開発し、データを分析しました。SC と PS は、セル サイズの実験を行った。ASR では、OC は、原稿を書いていた。著者は機器へのアクセスを提供するため教授デビッド r. Klug のサポートを感謝したいです。著者作製と試作設備にアクセスするために帝国大学高度な Hackspace を感謝したいです。

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</ol>

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アドレス指定可能な液滴マイクロ アレイは、単一細胞内でタンパク質の絶対コピー数を決定する定量的敏感かつ拡張可能な方法です。
非特異的結合のレベルを制限すること (NSB) は、低として可能な限り検出限界を達成するためにプロトコル内で重要です。蛋白質および他の生化学的な種がありますバインド インターフェイス液滴内に存在の数非具体的-coverslip 表面、スポットの抗体・油/水界面。タンパク質は、インターフェイスまたはオイル自体に分割が失われることができます。我々 は 4 %bsa 水溶液液滴内に存在がプロトコルで指定した抗体を用いてタンパク質の NSB を限ることができることを示しています。代わりとなる蛋白質の目標とそれらを検出するために使用する抗体は、代替ブロック的なアプローチ、そのような非イオン性洗剤または互換性のある界面活性剤を必要があります。フッ素オイルもソリッド オイルとしての適合性をテストできます。このような場合、臨界ミセル濃度とキャッピングの油の密度などの追加の考慮事項を行う必要があります。
各スポットの位置配...

このメソッドの目的は、単一セルの解像度を持つセル人口のターゲット蛋白質の豊富さで変化を決定することです。単一細胞解析は、いくつかの伝統的なアンサンブル生化学的方法では利用できない利点を提供します。1,2,3,4,5まず、単一セルのレベルで働く伝統的なアンサンブル生化学的手法で発生するそれ以外の場合、平均することによって失われるだろう細胞集団の豊富な多様性をキャプチャできます。仕事馬の生化学的方法の大半を連れた、必要とされる職務とは多くの場合、結果を生成する細胞の数百万。もちろん、全体細胞集団の評価の結果によって異なりますいくつかの要因、たとえば、不均質構造タンパク質発現蛋白質量分布のいくつかの重要な機能を見逃す可能性があります。実用的な観点から単一のセル技術の必要な感度させる機能により敏感の一括技術も十分ではない生物学的材料の量を操作することができます。このキーの例は珍しいセルなどの循環癌細胞 (Ctc) 描画単一 7.5 mL の血液に存在する 10 の Ctc より予後見通しで貧しい患者のためにもどこの研究です。6ここでオイル キャップの液滴を用いた抗体アッセイは抗体のマイクロ アレイの印刷量を削減を用いた単一細胞蛋白質測定の実行に必要な方法論を紹介します。
マイクロ液滴プラットフォームは、高スループット、生化学的アッセイの広い配列を実行する個々 のしぶきの滴/秒との分離、及びも培養の単一セルの対応の数千を生成することです。液滴ベースの技術は、単一細胞解析、大幅の力によって支援されています DropSeq10 inDrop11を含む顕著な最近例の7,8,9に最適増幅テクニック。材料の限られた量、蛋白質のための増幅のメソッドは、単一細胞プロテオミクスを特に挑戦的なの作るに。
液滴はメソッドの数によって分析される可能性があり、蛍光顕微鏡が用いられています。全内部反射蛍光 (TIRF) 顕微鏡などの単一分子技術により蛍光分子信号対雑音比の比類のない可視化することができます。12によるエバネッ セント場の指数関数的減衰、高 (100 nm オーダー) 表面近傍でのみ fluorophores が付いて興奮している複雑な混合物に少量の標的分子を検出するに全反射の良い戦略を作るします。全反射の光学セクショニング強さまた洗浄手順を避けるために、制限時間と複雑さの分析できます。全反射平面サーフェスを必要とし、流における液滴に適用される全反射型顕微鏡の例を含むイメージを平面の形成。13この目的のために単一細胞プロテオミクス技術設計マイクロ流体チップ マイクロ アレイ フォーマットでキャプチャの表面固定化エージェント周り。4,14
自分自身、液滴を形成して、平坦なサーフェス、いわゆる液滴マイクロ アレイでよい。15,16,17空間的配列に液滴を整理する便利なインデックス、簡単に時間をかけて監視、個別に対処して、必要な場合、取得することができます。液滴マイクロ アレイは、フリースタンディングまたはマイクロウェル構造体でサポートされている、チップあたりの要素の何千もの超小型原子炉の高密度を実現できます。18,19,形成することができる20液体ハンドリング ロボット、インク ジェット マニアによって順次蒸着によって先生方、院生21,22,23,24,25にお問い合わせください 26または彼らは自己 superhydrophillic などの面で組み立てることができるスポットは、超撥水表面のパターンします。27,28,29
念頭に置いてこれらの考慮点は、アドレス指定可能な液滴マイクロ アレイ (Adm) 定量的に単一分子全反射型顕微鏡の感度と汎用性、空間のアドレッシング機能により、液滴マイクロ アレイのボリュームを減少を結合する設計されていたタンパク質の量を測定します。5 Adm は、蒸発を防ぐためにオイルの蓋は、抗体マイクロ アレイを単一細胞を含む液滴マイクロ アレイを形成する単一細胞分析を有効にします。液滴のボリュームは、オンチップ マイクロ流体連続フローで弁体によって達成されるそれ以外の場合サンプル損失を防ぐ離散。30単一のセルからのターゲット蛋白質の絶対量が非常に小さいです。しかし、水滴の量の削減により比較的高い濃度のため、順序では、彼らはサンドイッチ抗体アッセイを使用して検出されます - 抗体を固定化すると、異なる地域や順番を結合する蛋白質をキャプチャする表面上のスポット蛍光標識検出の抗体, 液滴体積中に存在。ADMs が処理血液などの主要な情報源からの細胞の分析に一般的に適用されるラベル無料アプローチ (すなわちタンパク質のターゲットを直接にラベル付けする必要はありません)、として、うまく吸引解離腫瘍生検と培養細胞を必要とその溶解液。
薬に応答して、たとえば、不均一性を左右する重要な細胞集団全体蛋白質量の変化を測定と細胞機能と経路、集団の評価に洞察力を提供するのに役立つだろう、動作と同様一括方法によってマスクされるまれな事象を識別します。このプロトコルは、生産し、アドレス指定可能な液滴マイクロ アレイを使用して定量的ひとがん細胞における転写因子 p53 の豊かさを確認する方法について説明し、化学療法薬への応答における p53 の役割を調査するために使用可能性があります。ターゲット蛋白質はキャプチャと検出抗体の選択によって決定され、詳細、または別のターゲットを含めるように変更することがあります。手順は、手動でオイルを上限 10 nL 液滴を配列する一般的なラボ消耗品から同心円状のノズルを組み込んだシンプルな装置を構築する提供されます。各液滴分離するか、単一のセル、全反射顕微鏡を用いた 1 分子分解能で決定したタンパク質の発現とロードされるという完全実験のプロセスを説明します。

<table><tbody><tr><td>細胞培養</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10010015</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 高グルコース</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>Biochrom</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養フラスコ</td><td>Corning</td><td>SIAL0639</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Biochrom</td><td>L2153</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Microarray</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcontact Arrayer</td><td>DigiLab、英国</td><td>OmniGridマイクロ</td><td></td></tr><tr><td>マイクロコンタクトピン</td><td>ArrayIt、USA</td><td>946MP2</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips (Nexterion)</td><td>Schott, Europe</td><td>1098523</td><td>サイズ (mm): 65.0 x 25.0;厚さ(mm)0.17</td></tr><tr><td>p53捕捉抗体</td><td>Enzo</td><td>ADI-960-070</td><td></td></tr><tr><td>p53検出抗体、Alexa Fluor 488</td>標識<td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td>ストック濃度200&mu;g/mL</td></tr><tr><td>生理食塩水-クエン酸ナトリウム緩衝液</td><td>Gibco</td><td>15557-044</td><td></td></tr><tr><td>ベタイン</td><td>シグマ</td><td>61962</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>384 ウェルプレート (低容量)</td><td>シグマ</td><td>CLS4511</td><td></td></tr><tr><td>窒素ガスボンベ</td><td>BOC</td><td>工業グレード、無</td><td></td>酸素</tr><tr><td><強力>名前</強力></td><td>会社</td><td>strongカタログ番号</td><td>コメント<</td></tr><tr><td>strong>Droplets</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Eppendorf</td><td>Patchman NP2</td><td></td></tr><tr><td>Manual Microinjector</td><td>Eppendorf</td><td>CellTram Vario</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Origio, Denmark</td><td>MBB-FP-L-0</td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>KDサイエンティフィック</td><td>KDS-210</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu;Lシリンジ</td><td>ハミルトン</td><td>81020</td><td>ガスタイト、PTFE ルアーロック</td></tr><tr><td>1 mLシリンジ</td><td>ハミルトン</td><td>81327</td><td>ガスタイト、PTFE ルアーロック</td></tr><tr><td>シリコンアイソレーター</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR24R-A-0.5</td><td>6x4 ウェルシリコンアイソレーター 接着剤付き</td></tr><tr><td>レーザーカッター</td><td>VersaLASE</td><td>VLS2.30 CO2 レーザー 3W</td><td>カスタムアイソレーターのレーザー切断用</td></tr><tr><td>厚さ 1mm アクリルシート</td><td></td><td>カスタムアイソレータのレーザー切断のための</td>Weatherall-UK <td>Clarex精密シート001</td></tr><tr><td>マイクロアレイカバースリップにカスタムアイソレータを接着するために使用される</td><td>粘着シート</td><td>3M</td><td></td></tr><tr><td>スーパーグルー</td><td>ロックタイト</td><td>LOCPFG3T</td><td></td></tr><tr><td>150 &mu;m ID/360 &mu;m 外径溶融シリカチューブ</td><td>IDEX</td><td>FS-115</td><td></td></tr><tr><td>1.0 mm ID/1/16"外径PFAチューブ</td><td>IDEX</td><td>1503</td><td></td></tr><tr><td>0.014"ID/0.062インチOD PTFE チューブ</td><td>Kinesis</td><td>008T16-100</td><td></td></tr><tr><td>1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP チューブ</td><td>IDEX</td><td>1673</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清卵白 (BSA)</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>BP9700100</td><td></td></tr><tr><td>鉱物油</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>超純水</td><td>ミリポア、ドイツ</td><td>MilliQ</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社名</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>顕微鏡&光学</強></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TIRF顕微鏡、エンコードXYステージ</td><td>ニコン、日本</td><td>ニコン Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD</td><td>Andor Technologies、アイルランド</td><td>IXON DU-897E</td><td></td></tr><tr><td>レーザー励起光源</td><td>Vortran、米国</td><td>Stradus 488-50</td><td></td></tr><tr><td>光学分解レーザー光源</td><td>Continuum、米国</td><td>Surelite SLI-10</td><td></td></tr>顕微鏡<tr><td>TIRF</td><td>クロマ用フィルターキューブ、米国</td><td>z488bp</td><td></td></tr><tr>光学溶解<td>レーザー2000年用</td><td>顕微鏡フィルターキューブ</td>、英国<td>LPD01-532R-25</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>フィジー</td><td>のオープンソース</td><td></td><td>画像解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>バージョン 7.14 以降</td><td>画像解析ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

アドレス指定可能な液滴マイクロ アレイによる単一細胞におけるタンパク質をカウント

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

しばしば細胞挙動と細胞応答は多くの細胞の応答が複雑な人口の内で豊富な単一のセル動作をマスキング平均結果として一緒にプール、人口レベルで分析しました。単細胞タンパク質検出と定量化技術は、近年顕著な影響を与えたが。ここでアドレス指定可能な液滴マイクロ アレイに基づく実用的で柔軟な単一細胞解析プラットフォームをについて説明します。本研究では、ターゲット蛋白質の絶対コピー数が単一セルの解像度を測定する方法について説明します。腫瘍抑制因子 p53 は、非正常な p53 表現パターンを示す総癌の 50% 以上のひと癌の最も一般的変異遺伝子です。プロトコルでは、発現の変動を正確に判断する単一分子分解能 10 nL 液滴内 1 つのひと癌細胞は隔離され、p53 蛋白のコピー数の測定を作成する手順について説明します。メソッドは、任意のセル型主原料を含む興味の任意のターゲット蛋白質の絶対コピー数を決定するために適用可能性があります。

P53 の絶対根元タンパク質コピー数は、ひと大腸癌細胞株、ある細胞の単一セルの解像度が定められました。P53 桁違いに異なり、休憩する細胞集団内のセル サイズとタンパク質コピー数の間弱く肯定的な相関関係を示す方法を紹介しています。
アドレス指定可能な液滴マイクロ アレイは、水滴は抗体の場所にスポットで調剤され、オイルを頂いたときに形成されています。ここでは、水滴は敏感な p53 蛋白質の試金をサポートします。Coverslips は連絡先 microarrayer とピンを使用してキャプチャ抗体スポットで配列されます。抗 p53 キャプチャ抗体は、市販 ELISA テスト キットから取得されます。印刷の条件は、キャプチャ スポットがあたり 6.2 ± 0.5 × 105タンパク質の最大キャプチャ容量直径約 100 μ m など。32
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アドレス指定可能な液滴マイクロ アレイ (Adm)、単一セルの絶対蛋白質量を決定できる液滴アレイ ・ ベース メソッドをご紹介します。ひと癌細胞における癌抑制タンパク質 p53 の発現の多様性を特徴付けるための Adm の機能を紹介します。

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

この実験の全体的な目的は、標的タンパク質の絶対的なコピー数を単一細胞解像度で決定することです。単一細胞技術を用いることで、セントラルドグマに関連したタンパク質の挙動をより深く理解することができ、制御された遺伝子発現の正確な定量化に寄与します。単一細胞レベルでの解析は、従来の生化学的手法で起こる平均化によって失われてしまう、細胞集団の豊かな不均一性を捉えることができます。一般的に、この手法に不慣れな方は、単一細胞アッセイの感度や各細胞内のタンパク質量の少なさから、困難に直面することがあります。私たちは、後続の解析に向けて容易にサンプリング可能な単一細胞タンパク質アッセイを実施したいと考え、この手法を考案しました。まず、テキストプロトコルに従ってチップを作成し、抗体マイクロアレイをプリントすることから本手順を開始してください。装置を準備するために、内径150 µm、外径360 µmの溶融シリカチューブ（長さ100 mm）を、内径1 mm、外径1/16インチのPFAチューブ（長さ40 mm）に、2 mm分突き出るまで挿入します。これにより同心ノズルが形成されます。10 µLピペットチップの先端にシアノアクリレート系接着剤を薄く塗り、それを40 mmのPFAチューブに挿入します。必要に応じて、接着剤が硬化する前に、ノズル先端から2 mm突出するように溶融シリカチューブの位置を調整します。溶融シリカキャピラリーのもう一方の端を、内径0.014インチ、外径0.062インチ、長さ200 mmのPTFEチューブの端に挿入します。これを、リン酸緩衝生理食塩水に4%のウシ血清アルブミンを溶解した液で満たした100 µLのHamiltonシリンジに接続します。次に、内径1mm、外径2mm、長さ400mmのFEPチューブを、密閉されるまで200µLピペットチップに挿入します。別の200µLピペットチップにシアノアクリレート系接着剤を薄く塗布し、これを最初のチップに押し込んでチューブを固定します。その後、FEPチューブの開放端を、ミネラルオイルを満たした1mLハミルトンシリンジに接続します。200 µLピペットチップアセンブリを、同心ノズルの10 µLピペットチップに挿入します。次に、100 µLシリンジに4% PBSAブロッキング溶液を満たします。水系チューブを再接続し、ブロッキング溶液でフラッシュします。これを2回繰り返し、計3回のフラッシュを行います。次に、100 µLシリンジに4% PBSAで希釈した0.125 µg/Lの検出抗体を満たし、チューブを再接続します。検出抗体溶液を25 µL分注して、チューブ内のブロッキング溶液を置換します。すべてのチューブとノズルにオイルが行き渡るまで、ミネラルオイルでオイルチューブを洗浄します。次に、1 mLシリンジにミネラルオイルを再充填し

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

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ショウジョウバエ微生物叢に適用された96ウェルプレートフォーマットでの高速コロニー形成ユニットカウント

学ぶアドレス指定可能な液滴マイクロアレイを用いた単一細胞タンパク質定量法。p53発現異質性の解析により、がん細胞におけるタンパク質動態を解明し、細胞集団の個々の変動性を捉える革新的アプローチを理解する。

アドレス指定可能な液滴マイクロアレイによる単一細胞におけるタンパク質をカウント

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