Name: マウス肺切除術および義歯移植による内臓肺表面積の標準化法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 学ぶマウス肺切除術および義歯移植後の内臓肺表面積測定法。気管挿管、機械換気、固定処理を用いて正確に定量化し、肺再生メカニズムの評価と機能解析の再現性を向上させる。

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著者は北京生物科学研究所に支援を求めています。この研究は、北京市自然科学財団（No Z17110200040000）の支援を受けました。

このプロトコールで使用される全ての手順は、北京生物科学研究所の実験動物のケアおよび使用のためのガイドラインの推奨に従って行われた。実験が実施されるまで、8週齢のCD-1雄マウスを特定病原体不使用（SPF）施設に収容した。手術は、完全に麻酔したマウスを使用して行った（ すなわち 、つま先のつまみの反応なし）。手術後、マウスは、十分な食物および淡水を有する温かく湿った室内に置かれた。マウスを、腹腔内注射により送達された過剰の麻酔薬を用いて犠牲にした。 1.マウスPNX手術<ol><li>腹腔内（IP）注射によりナトリウムフェノバルビタール（120mg / kg体重）およびブプレノルフィン（0.1mg / kg体重）でマウスを完全に麻酔する。マウスがつま先へのピンチに反応しなくなったときに手術を行います。 </li><li>ケミカルデポを用いてマウスの左胸部の毛を除去する（約3×3cm 2面積）の治療を必要とする。 </li><li>各マウスを腹側を操作者に向けて挿管台に固定する（ 図1A ）。 </li><li>マウスの舌を引き出し、カテーテル18 （ 図1A ）を案内するノッチを含む小さな動物の喉頭鏡で声帯を照らす。 </li><li>呼吸中に声帯の動きを観察して声帯を区別します。静かに20Gの静脈内挿管カニューレを前角19で気管に挿入する。 </li><li>マウスを右横臥位に置き、カニューレを機械的人工呼吸器（ 例えば、圧力制御; 表の表を参照）に接続する。マウスの胸部の呼吸運動を観察して、カニューレの気管への挿入を確認します（ 図1B ）。 </li><li>吸息圧力を設定する換気装置を12 cmH 2 Oに設定し、呼吸速度を毎分120回の呼吸に設定します （ 図1B ）。 </li><li>ベタジンと70％エタノールで外科領域の皮膚を汚染除去する。 </li><li> Noyes Spring Scissors（刃先14 mm、先端直径0.275 mm）（ 図2B 、C ）を用いて、皮膚と筋肉を切断して、5 番目の肋間腔の空間に2〜3 cmの後外側開胸切開を行う。開胸手術に使用される手術器具は、使用前に滅菌される。 </li><li> 第 5肋間腔で1.5cmの切開を行い、左肺を露出させる（ 図2D 、E ）。操作中は、出血を止めるために高温焼灼器を​​使用してください。 </li><li>左肺葉の3分の1を鈍い先端鉗子で胸から持ち上げ（ 図2F ）、次に綿棒を使用して左全体を引き出す肺（ 図2G ）。 </li><li>左肺葉の肺動脈および気管支を特定する（ 図2G ）。 </li><li> hilumの気管支と血管を絹の外科用縫合糸でしっかりと結紮し、結紮から3〜4mmで左肺葉を切り取る（ 図2H 、I ）。 注：気胸（ すなわち 、胸部の空洞内の空気またはガス）を引き起こす可能性のある左丘の縫合結び目を切断しないように注意してください。 </li><li> 1つの縫合糸で胸壁を閉め、筋層と皮膚層を5〜6本の中断縫合糸を用いて縫い合わせる。各縫合糸の間に3〜4 mmの隙間を残す（ 図2M 、2N ）。 注：外科用縫合針を心臓から離してください。不慮の心臓穿刺は即座に死に至る。 </li><li>ポビドンヨードで手術部位を消毒する。 </li><li>アフト外科手術で38℃のサーマルパッドにマウスを置き、自発呼吸の動きが始まるまでマウスを人工呼吸器に接続します（ 図2O ）。 </li></ol> 2.プロテーゼインプラント<ol><li> PNX処置のステップ1.1〜1.13を実行します（つまり、マウスの左肺葉を取り除いた時点まで）。 </li><li>鈍い鉗子（ 図2J ）を使用して、シリコンプロテーゼの中心（顧客が作成した、長さ12mm、厚さ3mm、幅7mm、0.2g、楕円形）を締め付けます。シリコーンプロテーゼを挿入する前に滅菌する。 </li><li>胸腔を露出させるために片手で鉗子でリブを保持し、もう一方の手で左の空の胸腔にプロテーゼを挿入します。 注：挿入角度は、プロテーゼの前面と胸郭面との間で約45度です（ 図2K 、L）。プロテーゼを挿入するときは非常に優しい。過度の力は胸膜破裂をもたらす。 </li><li>鈍い鉗子でプロテーゼの向きを調整して、プロテーゼが左の空の胸腔を占めるようにします。 </li><li>マウスPNX手順のステップ1.14-1.16を実行します。 </li></ol> 3.ILVの測定<ol><li>使い捨ての血清学的ピペット（10 mL）から取り出したプランジャー、針アダプター、流量制御バルブ、および18 G針を備えた長さ40 cmのフレキシブルチューブからなるカスタムデバイス（「膨張チューブ」）を準備します。組み立て後、テープでボードにピペットを固定します （ 図3A ）。ピペットの上部と実験台との間の距離は、少なくとも30cmでなければならない。 </li><li> 55℃の水浴中で予め加熱した1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）500mLにPFA 20gを溶解し、手動で振とうして新鮮な4％パラホルムアルデヒド（PFA）固定液を調製する溶液が透明になるまで10分おきに静置する。室温に冷却した後、溶液を0.45μmフィルターで濾過する。 注意：PFAを取り扱うときは、適切な個人用保護具（PPE）を着用してください。 </li><li>マウスを麻酔薬の過剰投与（0.8％のフェノバルビタールナトリウム、1,000U / mLヘパリン）で犠牲にする。 </li><li>ポリスチレン解剖プレートに各マウスを固定し、70％アルコールを噴霧する。 </li><li>注意深くマウスの胸を開き、はさみを使用して胸骨を切り開いて肺葉を完全に露出させます。 </li><li>はさみを使用して過剰な組織を除去し、気管を露出させる。食道から気管を離してください。 </li><li>腹部大動脈を切断し、心臓の右心室に25ゲージの針を挿入する。この挿入の前に針を20 mLシリンジに接続してください。肺が白くなるまで、ゆっくりと1x PBSを心臓に押し込み、血球を除去します。典型的には、5~10mLのPBSが肺血管を浄化するために必要とされる。 </li><li>あなたを埋める4％の新鮮なPFAを含むカスタムビルドのインフレーションチューブを取り出し、インフレーションチューブからすべての泡を除去します。 </li><li>インフレーションチューブの18ゲージの針を気管に挿入し、液体漏れを防ぐために気管クリップで気管をクリップする。 </li><li> 25cmで一定経肺圧力/ H 2 O 2、20℃で4％PFAで肺を膨らませます。完全に拡張した肺を達成するために、肺を室温で2時間インキュベートする。この「予備固定」工程は、肺の形態を維持するために重要である。 <ol><li>膨張チューブを監視することにより、最初の4％PFA量の値を記録し、最終量を記録する。内部肺容積は、初期4％PFA容積から最終4％PFA容積を差し引いた容積に等しい。 </li></ol></li><li>気管をLigateし、はさみを使用して、周囲の結合組織から肺を静かに（肺をそのままに）解剖する。肺の損傷を避けるために、非常に穏やかにしてください。 </li><li>インコ4％PFAを満たした50 mLコニカルチューブで、4℃で12時間、シェーカー（50 rpm）で穏やかに振とうしながら肺を栓をする。組織の処理と染色に進む（セクション4を参照）。 </li></ol>組織埋め込み、切片化、およびヘマトキシリン＆エオシン（H＆E）染色<ol><li>固定後、Noyes Spring Scissorsを使用して、肺から心臓や過剰な結合組織を整えます。肺葉を気管に接続する気管支を切断することによって、個々の肺葉を静かに分離する。 </li><li>オービタルシェーカー（50 rpm）で50 mL 1x PBS（30分/洗浄）で3〜4回肺葉を広範囲に洗浄します。 </li><li>最後の洗浄後、組織が50mLコニカルチューブ（約12時間）の底に沈むまで4℃で30％ショ糖溶液（1×PBS）に浸すことによって肺葉を凍結保護する。 </li><li>組織を包埋して凍結切除する前に、鉗子で肺葉試料を管から取り出し、アクセスを保持する約30分間、最適切断温度（OCT）化合物を含有するペトリ皿に試料を完全に浸漬する。 </li><li>クライオホルムを使用して液体窒素中でOCTに埋め込まれたアクセサリーローブサンプルを凍結させる。ローブの最大表面積をモールドの底面に平行にします。 </li><li>組織学的分析のために凍結切片作製中に、各試料について合計3つの厚さ10μmの切片を調製する。最初の1mmの組織を捨て、10μmの厚さの部分を1枚集め、0.5mmの組織を捨て、別の部分を集め、0.5mmの組織を捨て、第3の（最終）部分を集める。 </li><li> H＆E染色を行う前に、セクションを1時間風乾します。 </li><li> H＆E染色を行う <ol><li>水道水の3〜4回の切替えで切片を洗浄し、新鮮なヘマトキシリン中の切片を2分間染色する。;実行中の水道水の下でセクションをすすぎます。切片を1％HCl-70％エタノール溶液に2回浸して過剰のヘマトキシリンを除去する。 </li><li>新鮮なエオシンの切片を3分間染色する。 95％エタノール中で2回連続して30秒洗浄し、100％エタノールで2回30秒洗浄することにより切片を脱水する;キシレン中の切片を30秒間透明にし、清澄化工程を新鮮なキシレン中で1回繰り返す;カバーガラスを使用してスライドをマウント媒体でマウントします。 </li></ol></li></ol> MLIの定量化<ol><li>明視野顕微鏡を用いて、H＆Eで染色されたアクセサリーローブ切片（20倍の倍率）のデジタル画像を取得する。 </li><li> MLIを定量化するには、3つのセクションからなる適切な領域（動脈および静脈、大気道および肺胞管なし）から無作為に合計15個の非重複ビュー（1,000μmx1,000μm）を選択します。 </li><li> 10個の均等に配分された垂直線と定義されたlenの均等に分布した水平線10個でグリッドを配置する選択された領域にルーラーツールを使用してgth（1,000μm）を表示します。したがって、各ラインは100μm離れて配置されている（ 図4B ）。 </li><li> 1つの切片の値を、2つの隣接する肺胞上皮の間の線形長さとして定義する。各1,000μmの長さのラインに沿ったすべての切片の値を測定する。 </li><li>各グリッドについて、10本の水平な1,000μmの長さのラインと10本の垂直な1,000μmの長さのラインの間のすべての切片の値を定量化する。 注：MLIは、アクセサリーローブのそれぞれについて用意された3つのセクションの中から分析された合計15個のグリッドからの切片長の平均値である。 </li></ol> ISAの計算<ol><li> 式1を使ってISAを計算します（ はじめにを参照）。 ILVの測定についてはセクション3を参照し、MLIの定量化についてはセクション5を参照してください。 </li></ol>

<ol><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK-Mediated+YAP+Activation+Controls+Mechanical-Tension-Induced+Pulmonary+Alveolar+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">MAPK-Mediated YAP Activation Controls Mechanical-Tension-Induced Pulmonary Alveolar Regeneration.</a> Cell Rep. 16 (7), 1810-1819 (2016).</li>
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</ol>

著者は何も開示することはない。

このプロトコールでは、マウス左肺PNXおよび人工器官移植後の肺パラメータの測定についての詳細な説明を提供する。 ISAは現在、多くの肺疾患および傷害誘発性肺胞再生における呼吸機能の評価のための重要なメトリックであると考えられている。しかし、肺研究の共同体はISAの有用性について有用な指標として合意されているが、ISAを計算するために使用されるILVとMLIの測定の標準化についてはほとんど考慮されていない。明らかに、測定と同様に、偏りのないデータを取得することが重要です。現在の研究努力の中心的な目標は、マウス肺研究共同体による使用のための標準化されたプロトコルを確立することである。 私たちは、このプロトコルを開発したときに、さまざまな方法で測定バイアスの原因を減らそうとしました。我々は、ILV測定値の変化が赤色であり得ることを見出した気管に挿入された針の寸法が寸法的に一致していることを保証することによって流体の漏れを防止することによって（18ゲージ針がマウス気管に密接に適合していることがわかった）また、PFAの膨張前にマウスの胸壁を完全に除去する必要があることも判明しました。これは、...

肺の基本的機能は、血管と大気との間の酸素と二酸化炭素の交換である。気管支肺胞形成異常（BPD）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、急性呼吸器感染症などの肺疾患は、ISA 2の減少をもたらす。肺疾患を研究研究者はMLI、ILV、ガス交換ユニットの数、ISA、および肺組織のコンプライアンス2、3などの肺の形態学的変化を評価するためにいくつかの定量的な方法を開発しました。 Weibel らによる先駆的研究4およびDuguid ら 5一緒にISAは、ヒト肺における肺のガス交換能力の直接の尺度として使用することができ、肺気腫の重症度を決定するための基準として使用することができることを確立しました。過去5年間に発表された多くの研究では、肺の形態学的パラメーター（ 例えば、 </e開発6中や傷害PNX 1、7から回復中のマウスの肺の形態学的および機能的変化を評価するために、M&gt; ISAとMLI）。 ISAは、 式（1）8,9用いて計算されます。 <img alt="式" src="/files/ftp_upload/56114/56114eq1.jpg" />ここで、ILVは、内部肺容積であり、MLIは、肺周辺空隙サイズ10を表す中間パラメータである。 PNX、一つ以上の肺葉の外科的切除は、広く人間11、マウス1、犬12、ラット13、およびウサギ14、15を含め、多くの種で、肺胞の再生を誘導することが報告されています。スタッドPNX後14日目にマウスの肺のyは、既存の肺胞の拡大と肺胞の新形成の両方が、残りの肺組織におけるISA、ILV、および肺胞の数の回復に寄与することを示した1 。我々と他の人は、スポンジ、ワックス、カスタム形状のプロテーゼなどの材料を空の胸腔にPNX（ すなわち人工器官の植え込み）後に挿入すると、肺胞の再生が損なわれることを示しています。今ではしっかりと肺胞の再生1、16、17を開始するための最も重要な要因の一つとして、その機械的な力の機能を確立しています。そのような研究は、肺胞再生を定量的に評価する基準として、PNX処置および人工器官埋め込み肺からのISA値を使用する有効性を強調している。 観察者バイアスは、測定されたvaに有意に影響を及ぼすことが知られている肺の形態学的パラメーター（ 例えば 、MILおよびILV）についてのルーツ。 ISAの計算に使用される2つのパラメータであるILVとMLIの両方を決定する際に、標準化されたプロトコルを使用してこのバイアスを回避することができます。ここでは、これらの肺パラメータを測定するための非常に詳細な、標準化されたプロトコルを提供します。重要なことに、ISAを正確に定量する能力は、損傷誘発性の肺胞再生モデルにおける肺機能の研究の信頼性および再現性を改善することを約束し、複数の肺疾患における機械的発見を促進するはずである。

<table><tbody><tr><td>低コストの焼灼キット</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>18010-00</td><td></td></tr><tr><td>Noyesはさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15012-12</td><td></td></tr><tr><td>標準パターン鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejoマイクロニードルホルダー</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>12060-01</td><td></td></tr><tr><td>容器クリップ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>18374-44</td><td></td></tr><tr><td>I.V.カニューレ-20ゲージ</td><td>Jinhuan Medical Product Co.、LTD。</td><td>29P0601</td><td></td></tr><tr><td>外科用縫合</td>糸<td>Jinhuan Medical Product Co.、LTD.</td><td>F602</td><td></td></tr><tr><td>マウス挿管プラットフォーム</td><td>ペンセンチュリー社</td><td>モデル MIP</td><td></td></tr><tr><td>小動物喉頭鏡</td><td>ペンセンチュリー社</td><td>モデル LS-2-M</td><td></td></tr><tr><td>TOPO 小動物用人工呼吸器</td><td>ケントサイエンティフィック</td><td>RSP1006-05L</td><td></td></tr><tr><td>サーマルパッド</td><td>スチュアート装置</td><td>SBH130D</td><td></td></tr><tr><td>ペントバルビタールナトリウム塩</td><td>シグマ</td><td>P3761</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム塩</td><td>ΣH3393</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン溶液</td><td></td><td>ΣGHS132</td><td></td></tr><tr><td>エオシンY液、アルコール</td><td>シグマ</td><td>HT110116</td><td></td></tr><tr><td>10 mL ピペット</td><td>Thermo Scientific</td><td>170356</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Σ</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>OCT Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>凍結切片マシン</td><td>ライカ</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てベース モールド</td><td>フィッシャー ヘルスケア</td><td>22-363-553</td><td></td></tr><tr><td>18 ゲージ 針</td><td>ベクトン ディキンソン</td><td>305199</td><td></td></tr><tr><td>ポビドン ヨウ素</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>19-027132</td><td></td></tr><tr><td>70% エタ</td><td>ノール フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>BP82011</td><td></td></tr><tr><td>シングル用 輸液セット</td><td>Weigao</td><td>SFDA 2012 3661704</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>テープ</td><td>3M スコッチ</td><td>8915</td><td></td></tr><tr><td>コットンパッド</td><td>Vinda</td><td>Dr.P</td><td></td></tr><tr><td>シリコーンプロテーゼ</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>明視野顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>VS120</td><td></td></tr><tr><td>定規ツール</td><td>Adobeフォトショップ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウス肺切除術および義歯移植による内臓肺表面積の標準化法

A Standardized Method for Measuring Internal Lung Surface Area via Mouse Pneumonectomy and Prosthesis Implantation

肺の形態、生理機能、および呼吸機能は、生理学的および病理学的状態の両方で変化します。肺のガス交換能力を表す肺の内部表面積(ISA)は、呼吸機能を評価するための重要な基準です。ただし、観察者のバイアスは、肺の形態学的パラメータの測定値に大きな影響を与える可能性があります。ここで説明するプロトコルは、ISA計算に使用される2つの形態学的パラメータ、すなわち内部肺活量(ILV)と平均線形切片(MLI)の測定中の変動を最小限に抑えます。肺摘出術(PNX)と人工装具移植マウスモデルの両方で肺胞再生の結果を決定するための形態測定的および機能的パラメータとしてISAを使用したところ、PNX治療後のISAの増加は、胸腔への補綴物の移植によって有意にブロックされることがわかった1。ISAを正確に定量する能力は、損傷誘発肺胞再生モデルにおける肺機能研究の信頼性と再現性を向上させるだけでなく、複数の肺疾患の機構的発見を促進することも期待されています。

<html>ここでは、PNX治療群と人工器官埋め込み（義肢植込み）群の実験を行った。これらのグループ分けは、研究グループ14の以前に発表された研究で使用されたグループ分けと同じです。 マウスPNXおよびプロテーゼ移植手順を図2に示す。 8週齢のCD-1雄マウスを手術および定量のために使用する。 PNX処置群とプロテーゼ注入群では、左肺は、両方が（ - 2I 図2A）を切除したローブ。左肺葉は（ - 2L 図2J）を除去した後のプロテーゼ注入群、左肺葉の大きさと形状を模倣プロテーゼに胸部に挿入しま...

内臓の肺表面積（ISA）は、肺疾患および傷害誘発性肺胞再生における肺の形態学および生理学を評価するための決定的な基準である。ここでは、肺の肺切除術とプロテーゼ移植マウスモデルの両方でISAの測定バイアスを最小限に抑える標準化された方法について説明します。

Pulmonary morphology, physiology, and respiratory functions change in both physiological and pathological conditions. Internal lung surface area (ISA), ...

この手順の全体的な目的は、肺切除および人工物植え込み後のマウス肺の内部表面積を正確に測定することです。この手法は、機械的力によって誘導される成体肺再生における肺の形態学的および生理学的機能を分析するのに役立ちます。この技術の主な利点は、肺の内部表面積を正確に定量化できることであり、これにより肺機能の状態における信頼性と再現性が向上することが期待されます。挿管プラットフォーム上でマウスの腹側が露出するように配置し、手術の準備を行います。次に、舌を引き出し、カテーテル誘導に対応した小動物用喉頭鏡を用いて声帯を確認します。その後、20ゲージの静脈内挿管カニューレを、内角をつけながら気管にゆっくりと挿入します。次に、マウスを右側臥位にし、カニューレを人工呼吸器に接続します。胸部の動きを観察して、カニューレが気管に挿入されているかを確認してください。吸入圧を 12 cmH₂O に、呼吸数を毎分 120 回に設定します。次に、露出した皮膚をBetadineと70%ethanolで交互に少なくとも3回洗浄します。その後、第5肋間に向けて2〜3cmの後外側開胸切開を行い、手術を開始します。Noyesスプリングシザーを用いて筋肉層を貫通させます。次に、左肺を露出させるため、1.5 centimeterの切開を行います。手術中、必要に応じて高温電気焼灼器を使用して止血します。その後、鈍端鉗子で左肺葉の1/3を胸腔から持ち上げ、綿棒を用いて左肺全体を摘出します。次に、左肺葉の肺動脈と気管支を特定し、肺門部の気管支と血管を浸した手術用縫合糸でしっかりと結紮します。続いて、結紮部から3～4 mm離れた位置で左肺葉を切り出します。この際、気胸の原因となるため、縫合糸を切断しないように注意してください。最後に、縫合糸1本で胸壁を閉じてください。次に、3〜4 mmの間隔で5〜6回の結節縫合を行い、筋層と皮膚層を順に縫合します。この際、手術用縫合針が心臓に触れないように注意してください。心穿刺は致死的となります。最後に、手術部位をポビドンヨードで消毒します。次に、マウスを38 °Cのサーマルパッドの上に置きます。自発呼吸が戻るまで、引き続き人工呼吸器を使用してください。前述の操作を行いますが、肺を摘出した直後に、プロテーゼを挿入する準備をします。鈍的鉗子を用いて、楕円体シリコンプロテーゼの中心を掴みます。次に、鉗子で肋骨を保持して胸腔を露出させながら、プロテーゼを非常にゆっくりと挿入します。人工物の前面と胸郭表面との間で45度の角度で挿入します。鈍的鉗子を使用して、人工物が左側の空の胸腔内に完全に収まっていることを確認してください。その後、前述の手順に従って胸部を閉鎖し、マウスを観察します。本手順では、10 milliliter セロロジカルピペットから取り出したプランジャー、ニードルアダプター付きの長さ 40 centimeter の柔軟性チューブ、流量制御バルブ、および 18 gauge ニードルで構成されるカスタム注入チューブを組み立てます。組み立て後、ピペットをテープでサイドボードに固定します。ピペットの上端からベンチまでの距離は、少なくとも 30 centimeters 確保してください。麻酔剤の注射によりマウスを安楽死させた後、滅菌済みのボードに固定し、慎重に胸部を開いて胸骨を切り出し、肺葉を露出させます。次に、気管を露出させます。続いて、インフレーションチューブに調製したばかりの 4%PFA を満たし、チューブ内からすべての気泡を取り除きます。次に、針を気管に挿入します。漏れを防ぐため、血管クリップで気管を固定します。その後、25 cm H₂Oの一定の経肺圧で、固定液を用いて肺を膨張させます。肺を室温で2時間インキュベートし、十分に膨張させます。膨張後、固定液の排除体積を記録します。次に、気管を結紮し、周囲の結合組織から肺を損傷させないよう注意深く切り出します。ハサミを使用し、非常に慎重に操作してください。次に、肺を4% PFAを満たした50 mLコニカルチューブに入れ、シェーカーを用いて穏やかに揺らしながら、4°Cで12時間インキュベートします。その後、テキストのプロトコルに従って処理および染色を行ってください。MLIを定量化するために、明視野で20倍の倍率で収集した、薬剤を用いた切片の画像を使用します。3つの異なる肺切片から、それぞれ約1平方ミリメートルの重複しない視野を合計15箇所ランダムに選択し、抽出します。動脈、静脈、主要気道、または肺胞管のない領域のみを使用してください。解析のため、定規ツールを用いて、選択した各領域に10×10のグリッドを引きます。これにより、グリッド線の間隔は約100 µmとなります。次に、隣接する2つの肺胞上皮間の長さを、線上の切片として計測します。例えば、両方向矢印は長さを表しています。各グリッド線に沿ってこれらの長さをすべてカウントし、その切片長の平均値がMLIとなります。記述したプロトコルを用いて、PNX処理マウスと人工装具を植え込んだマウスを比較しました。使用したマウスは8週齢のCD-1雄で、左肺葉を切除した。補綴物は左肺葉の大きさと形状を模倣したものであり、左肺葉の除去後に胸腔内に挿入した。手術から14日後、特製の送気チューブを用いて、残存する右肺の内部容積を測定した。PNX処理を施した5匹のマウスにおける右肺の平均容積は約1.4 millilitersであり、人工物を植え込んだ5匹のマウスの1.05 millilitersよりも有意に大きかった。残りの右肺におけるMLI値も同様に有意に大きかった。これらのパラメータを用いて肺の内部表面積を算出したところ、人工物を植え込んだマウスでは有意に小さいことがわかった。このビデオを視聴することで、機械的力誘発 alveolar 再生マウスモデルにおける肺内部表面積の算出方法について、十分に理解できるはずです。

a-standardized-method-for-measuring-internal-lung-surface-area-via

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

内皮グリコカリックス/内皮表面層は、理想的には生体顕微鏡を用いて研究されています。生体顕微鏡検査は、肺などの臓器に移動技術的に困難である。私たちは、同時明視野と蛍光顕微鏡を自由に移動させる際に内皮表面層の厚さを推定するために使用することができる方法を示してい...

マウス肺内皮表面層の in vivo測定における

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肺気腫とタバコ煙曝露マウスにおける末梢気道リモデリングの自動測定

マウス肺摘出術は、一般的に採用されている代償性肺成長モデルです。この手順は、系統追跡またはトランスジェニックマウスモデルと組み合わせて使用...

代償肺の成長のマウス肺モデル

ここでは、マウスの肺圧-体積曲線を簡単かつ確実に測定するためのプロトコルを提示し、それが2つの一般的な肺の病状、肺線維症と肺気腫の表現型実質変化を検出するのに十分な感度を持つことを示しています。この指標は、病状の進行に伴う肺の構造変化を定量化する手段を提供します。...

マウス肺における圧力 - 容積曲線の測定

本稿の目的は、大幅に肺癌または他の病状とのセットアップとマウスの肺の分析を支援する単純な方法を記述することです。我々は、簡単かつ確実に肺の点滴注入、固定、および肺容量の測定を行うために3プロトコルを提示します。...

マウス肺癌研究における有用な点滴や固定方法

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同所性同種肺がん細胞生着の効率を高めるブレオマイシンとマウスの気道をプレコンディショニング

ここでは、肺の高解像度の生体内イメージングを可能にするマウス胸郭用の永久に留置された光学窓の外科的移植のためのプロトコルを提示する。ウィンドウの永続性は、肺の動的細胞プロセス、特に播種された腫瘍細胞の転移進行など、ゆっくりと進化している細胞プロセスの研究に適しています。...

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この原稿は、同所注射された乳房腫瘍からの自然肺転移の確立および縦断的成長モニタリングの方法論を説明しており、転移カスケードのすべての段階での介入に適しています。...

インビボ 同所注射された乳房腫瘍細胞の自然肺転移を測定するためのイメージング

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肺がんの新しい治療法を開発する上の主な課題には、局所疾患が転移性疾患に進行する際の腫瘍微小環境のモデル化が含まれます。ここでは、肺がんの同所性同系モデルを確立する簡単な方法を説明し、経時的な疾患の in vivo...

肺癌の同系同所性マウスモデルを生成するための低侵襲法

学ぶマウス肺切除術および義歯移植後の内臓肺表面積測定法。気管挿管、機械換気、固定処理を用いて正確に定量化し、肺再生メカニズムの評価と機能解析の再現性を向上させる。

マウス肺切除術および義歯移植による内臓肺表面積の標準化法

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