2017年7月26日
内臓の肺表面積(ISA)は、肺疾患および傷害誘発性肺胞再生における肺の形態学および生理学を評価するための決定的な基準である。ここでは、肺の肺切除術とプロテーゼ移植マウスモデルの両方でISAの測定バイアスを最小限に抑える標準化された方法について説明します。
この手順の全体的な目標は、肺摘出術およびプロテーゼ移植後のマウス肺の内部表面積を正確に測定することです。この方法は、機械的な力によって誘発される成人の肺再生における肺の形態学的および生理学的機能を分析するのに役立ちます。この技術の主な利点は、肺の内部表面積を正確に定量化することであり、これにより肺機能状態の信頼性と再現性が向上することが期待されます。
腹側にアクセスできる挿管プラットフォームでマウスを手術の準備します。次に、舌を引き出し、ガイディングカテーテルと互換性のある小動物用喉頭鏡で声帯を検査します。次に、20ゲージの静脈内挿管カニューレを気管の内側の角度で静かに挿入します。
次に、マウスを右横臥位に置き、カニューレを機械式人工呼吸器に接続します。胸部を観察して、カニューレが気管に挿入されているかどうかを判断します。吸気圧を水深12センチメートルに設定し、呼吸数を毎分120回に設定します。
次に、露出した皮膚を少なくとも3回交互にベタジンと70%エタノールで洗浄します。次に、5番目の肋間腔に2〜3センチメートルの後外側開胸切開術で手術を開始します。Noyesスプリングハサミを使用して筋肉組織を貫通します。
次に、1.5センチの切開を行い、左肺を露出させます。手術中、必要に応じて、高温焼灼器を使用して出血を止めます。次に、先端が鈍い鉗子で左肺葉の1/3を胸から持ち上げ、綿棒を使用して左肺全体を引き出します。
次に、左肺葉の肺動脈と気管支を特定し、浸した外科的縫合糸で気管支と血管を門でしっかりと結紮します。次に、結紮から3〜4mm離れた左肺葉を切り取り、縫合糸が切れて気胸にならないように注意します。次に、1本の縫合糸で胸壁を閉じます。
次に、3〜4ミリメートルの隙間がある5〜6本の中断された縫合糸を使用して、筋肉層と皮膚層を順番に縫い合わせます。外科用縫合針は必ず心臓から遠ざけてください。心臓穿刺は致命的です。
最後に、手術部位をポビドンヨードで消毒します。次に、マウスを摂氏38度のサーマルパッドに置きます。自発呼吸が戻るまで人工呼吸器を使用し続けます。
前述の手術を行いますが、肺を切除した直後に、プロテーゼを挿入する準備をします。鈍い鉗子を使用して、楕円体シリコーンプロテーゼの中心をつかみます。次に、鉗子で肋骨を押さえて胸腔を露出させながら、プロテーゼを非常に優しく挿入します。
プロテーゼの前面と胸部表面との間に45度の角度で入ります。鈍い鉗子を使用して、プロテーゼが左の空の胸腔内に完全に収まっていることを確認します。次に、チェストを閉じて、前述のようにマウスを監視します。
この手順では、10ミリリットルの血清ピペットから取り外したプランジャー、ニードルアダプター付きの長さ40センチメートルのフレキシブルチューブ、流量制御バルブ、および18ゲージのニードルで構成されるカスタムインフレーションチューブを組み立てます。組み立てたら、ピペットをサイドボードにテープで固定します。ピペットの上部とベンチの間の距離は少なくとも30センチメートルでなければなりません。
麻酔注射でマウスを安楽死させた後、滅菌したボードに固定し、胸部を慎重に開いて胸骨を切り出し、肺葉を露出させます。次に、気管を露出させます。次に、インフレーションチューブに作りたての4%PFAを入れ、チューブからすべての気泡を取り除きます。
次に、針を気管に挿入します。漏れを防ぐために、血管クリップで気管をクリップします。次に、25センチメートルの水の一定の経肺圧で固定剤で肺を膨らませます。
肺を室温で2時間インキュベートし、完全に拡張します。膨張後、固定剤の体積変位に注意してください。次に、気管を結紮し、周囲の結合組織から無傷の肺を静かに解剖します。
ハサミを使って、とても優しくしてください。次に、4%PFAを充填した50ミリリットルの円錐管内で、シェーカーで穏やかに振とうしながら、摂氏4度で12時間肺をインキュベートします。その後、テキストプロトコルに記載されているように、処理と染色を進めます。
MLIを定量化するには、明視野下で20倍の倍率で収集された切片で使用された薬剤の画像を使用します。3つの異なる肺セクションから、重なり合わない合計15のビュー(それぞれが約1平方ミリメートル)をランダムに選択し、それらを排出します。動脈や静脈、主要な気道、または肺胞管のない領域のみを使用してください。
解析では、定規ツールを使用して、選択した各領域に 10 x 10 のグリッドを描画します。したがって、グリッド線は約100ミクロン離れています。次に、2つの隣接する歯槽上皮間の長さとして線に沿った切片を見つけます。
たとえば、両方向矢印は長さを示しています。各グリッド線に沿ってこれらすべての長さを数えると、MLIは切片の長さの平均値です。記載されたプロトコルを用いて、PNX治療マウスを人工移植マウスと比較した。
使用したマウスは生後8週齢のCD-1雄で、左肺葉を切除した。プロテーゼは左肺葉のサイズと形状を模倣しており、左肺葉が取り除かれた後に胸部に挿入されました。手術の14日後、カスタムメイドのインフレーションチューブを使用して、残りの右肺の内容積を測定しました。
PNXを投与した5匹のマウスの右肺の平均容積は約1.4ミリリットルで、これは5匹の人工装足マウスで1.05ミリリットルと有意に多かった。残りの右肺のMLI値も有意に高かった。これらのパラメータを用いて、肺の内部表面積を計算し、プロテーゼを移植したマウスでは有意に小さいことがわかった。
このビデオを見れば、機械的な力によって誘発される肺胞再生マウスモデルの肺の内部表面積を計算する方法について十分に理解できるはずです。
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この記事は、肺切除とプロテーゼ移植後のマウスモデルにおける内部肺表面積(ISA)を測定するための標準化された方法を提示しています。ISAの正確な定量化は、特に肺疾患と再生に関して、肺の形態と生理学を理解する上で不可欠です。
Accurate quantification of internal lung surface area (ISA) is critical for assessing respiratory function in pulmonary disease models and regeneration studies. This standardized method reduces observer bias in morphometric measurements, improving reliability and reproducibility in preclinical lung research. Enhanced measurement confidence supports mechanistic de-risking and predictive value in target validation for respiratory therapeutics.
The method integrates into discovery biology workflows by providing quantitative morphometric data that informs lead identification and preclinical advancement decisions in respiratory research.