蚊幼虫における遺伝子の機能解析の遺伝子配達ベクトルとして組換え蚊 Densovirus を使用

この手順の全体的な目的は、組換え蚊デンソウイルスを遺伝子導入手段として用い、蚊の幼虫の遺伝子機能を解析することです。この手法は、関連する細胞外および細胞内のバリアをどのように克服するかといった、ウイルスベースのデリバリーシステムにおける重要な疑問への回答に役立ちます。これらの技術の主な利点は、操作が容易であること、導入効率が高いこと、発現が長期的にわたって堅牢であること、そして生体内で持続的な効果を生み出せることです。

本研究では、開発したデンソウイルスデリバリーシステムを用いて、蚊の幼虫において特定の小型RNAまたは標的遺伝子を過剰発現またはノックダウンできることを実証しました。この手法は幼虫への導入が容易であるため、本手法で述べた発現戦略を蚊の生物学的研究へと応用することが可能です。本手順の実演は、当研究室の博士課程候補生であるPei-Wen Liuが行います。

付随するテキストプロトコルに記載されている通り、まず、前駆体miRNA、miRNAスポンジ、およびshRNAのフルレングスcDNA配列の化学合成を注文します。注文したDNAを受け取ったら、DNAブロックを含むチューブを遠心分離し、乾燥したDNAがすべてチューブの底にあることを確認します。次に、DNaseフリーの水でDNAを再懸濁し、最終濃度を10 nanograms per microliterにします。

XbaIを6 µL加え、プラスミドバックボーンとcDNA配列を消化し、反応液を37 °Cで1時間静置します。次に、製造者の指示に従い、牛腸アルカリホスファターゼを用いて線状化したプラスミドバックボーンの5'末端を脱リン酸化します。効率的なパッケージングのため、ゲノムサイズは野生型蚊デンスウイルスゲノムの長さの110%に相当する4,400 nucleotideを超えてはならないか、あるいは400 nucleotide以下のイントロン内microRNA発現をAedes aegyptiゲノムに導入する必要があります。

次に、65°Cで加熱してアルカリホスファターゼを不活性化します。その後、1%アガロースゲルでDNA電気泳動を行い、線状化したバックボーンを切り出します。メーカーの指示に従い、ゲル抽出キットを用いてゲルスライスからDNAを抽出します。

抽出後、T4 DNA ligaseを用いてDNA断片をバックボーンにライゲーションします。次に、ヒートショック法を用いて、ライゲーション反応産物をコンピテントなDH5-alpha E.coli細胞に形質転換します。形質転換した細菌を、100 micrograms per milliliterのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布します。

翌日、プレートから単一のコロニーをピックアップし、100 µg/mLのアンピシリンを含む3 mLの富栄養培地を用いてスターターカルチャーを作成します。最後に、メーカーの指示に従い、ミニプレップキットを使用して細菌培養液からプラスミドDNAを抽出します。抽出したDNAのサンプルをDNAシーケンシング会社に送り、確認を行います。

人工イントロン小分子RNA発現カセットで示した方法を用いて、pre-miRNAまたはshRNAをpUCAプラスミド骨格内のAaeDV NS1コード領域のHpaI部位にライゲートします。DH5-alpha細胞の代わりに、Stbl3コンピテントE.coli細胞にDNAを形質転換します。次に、形質転換した細胞を100 micrograms per milliliterのアンピシリンを含むLB寒天培地に播種し、陽性クローンからスターターカルチャーを調製します。その後、メーカーの指示に従い、maxiprepキットを用いて細菌細胞からrAaeDVプラスミドを抽出します。

0日目に、90～95%コンフルエントになったC6/36細胞のフラスコを1：2に分割し、10本のT-25培養フラスコに播種します。これらのフラスコを28°Cで18～20時間インキュベートし、再び90～95%コンフルエントになるまで培養します。

1日目に、作製したrAaeDVプラスミドを細胞にトランスフェクションします。そのためには、10 µgのDNAを600 µLのRPMI-1640培地で希釈し、溶液を穏やかに混ぜ合わせます。同時に、トランスフェクション1回につき、600 µLのRPMI-1640培地と25 µLのトランスフェクション試薬を用意します。

細胞をDNAとともに室温で5～10分間インキュベートします。次に、プラスミドDNA混合物にRPMI-1640トランスフェクション試薬混合物を625 µL加え、この混合物を室温で20～30分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞をRPMI-1640培地で2回洗浄し、各T-25培養フラスコにトランスフェクション混合物を添加します。

細胞をトランスフェクション混合液中で28 °Cで6時間インキュベートします。6時間後、トランスフェクション培地を除去し、5 mLのRPMI-1640培地で細胞を2回洗浄した後、10% FBSを含む新鮮なRPMI-1640培地を加えます。トランスフェクションの5日後、5 mLのガラスドロッパーを用いて、培養液でピペッティングを行い、ディッシュ内の細胞を剥離させて懸濁させます。

各フラスコから細胞懸濁液を、それぞれ個別の滅菌済み50 mLチューブに移します。高閾値依存性ウイルスを回収するには、トランスフェクション後5日間細胞を維持する必要があります。個々のチューブを-80 °Cで、またはドライアイス・エタノールバスで30分間凍結させます。

次に、37°Cで急速解凍し、細胞懸濁液を1分間ボルテックスします。続いて、遠心分離したサンプルの上清を回収し、ペレットを廃棄します。その後、上清を0.22 µmの使い捨てシリンジフィルターでろ過します。

最終精製したビリオンストックを分注し、-80 °Cで保存します。1齢のA. albopictus幼虫100匹を、脱イオン水を用いて3回洗浄します。その後、幼虫を95 mLの脱イオン水が入ったビーカーに移します。

rAaeDVストックを5 mL加え、幼虫を28 °Cで24時間インキュベートします。幼虫への感染を成功させ、高い感染率を確保するためには、幼虫を感染ウイルス粒子とともに24時間から36時間保持することが不可欠です。インキュベーション後、脱イオン水を用いて幼虫を3回洗浄し、幼虫をプレートに戻します。幼虫に定期的に餌を与えます。標準的な手法を用いて、定量PCRまたはウェスタンブロットにより、幼虫における標的遺伝子の発現レベルをモニターします。

この例では、過剰発現を示すaal-let-7発現カセットを含む組換えウイルスを感染させた後、100匹の1齢幼虫を用いて内因性miRNAの発現を分析しました。

anti-let-7コンストラクトの効率を右図に示す。ここでは、そのノックダウン能を強調している。rAaeDVベクターによるV-ATPase mRNAのノックダウン効率をモニタリングするため、計100匹の1齢幼虫に対し、幼虫の生息域の水体にウイルスを添加することで、異なる種類のrAaeDVを等量ずつ処理した。その結果、miRNA発現rAaeDVおよびイントロン性shRNA発現rAaeDVにより、V-ATPase mRNAレベルが大幅に減少した。

我々の結果は、ゲノム欠損を持つ蚊デンスウイルス（mosquito densovirus）の限界を克服し、外来遺伝子を蚊へ効率的に導入することを可能にする、新しいパラダイムとなるイントロン発現戦略を検証するものです。この手順を行う際は、400 nt以下のイントロン型microRNA発現カセットのみがAedes aegyptiデンスウイルスのゲノムに導入可能であることに留意することが重要です。この技術の開発により、microRNAや標的遺伝子を過剰発現またはダウンレギュレートさせることができ、蚊の遺伝子の機能解析を探索することが可能な、非欠損性組換え蚊デンスウイルスの作製に向けた研究の道が開かれました。

このビデオを視聴することで、開発された蚊デンソウイルス配送システムを用いて、蚊の幼虫における遺伝子機能を解析する方法について十分に理解することができます。