Name: 蚊幼虫における遺伝子の機能解析の遺伝子配達ベクトルとして組換え蚊 Densovirus を使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: 学ぶ 組換え蚊Densovirusを用いた遺伝子配達法で、蚊幼虫における遺伝子機能解析を行う方法です。高い導入効率と長期的な発現により、遺伝子の過発現やノックダウンが可能となり、蚊の生物学研究と媒介制御戦略の発展に貢献します。

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著者がキー研究と開発中国プログラムからの財政支援を認める (暁広陳に 2016YFC1200500)、国家自然科学基金、中国の (81672054 および 81371846)、自然の研究チームのプログラム広東省 (2014A030312016) の科学財団と広州 (201508020263) の科学的および技術的なプログラム。我々 は喜んで親切提供 pUCA と p7NS1 GFP プラスミドと批判的にこの原稿を読んで教授ジョナサン ・ カールソン (コロラド州立大学) を認めます。

のすべてのプロトコルは、倫理委員会の南方医科大学によって承認されました。
 1 人工イントロンを設計 注: この作業で使用する人工のイントロンは 65 bp の長さ、およびシーケンスは 5 &#39; - GTAAGAGTCGATCGACGCGTTACTAACTGGTACCTCTTCTTTTTTTTTTGATATCCTGCAG - 3 &#39;。。
<ol><li>Hpa を配置私だから、Hpa の人工イントロンの両端に制限サイト私消化はプラスミド ( 図 1 を参照) からイントロンを解放できます</li>。
	<li>2 つ Xba 私だから、Xba のイントロンで制限サイト私消化を使用と小さな RNA 式シーケンスを挿入できます</li>。
	<li>は、DNA の製造元から人工のイントロンのフルレングスの dna 塩基配列の化学合成を注文します。合成 DNA 作成標準 pUC19 プラスミドにクローニングからです 。
	注: 人工のイントロンの不可欠なコンポーネントを含める、5 を含むいくつかのコンセンサス塩基配列要素 &#39; ドナー スプライス部位 (DS)、GUAAGAGU、UACUAAC、ポリ ピリミジン順序で保存されているブランチ ポイント シーケンス (BPS) シーケンスシーケンスの UCUUC(U) 10 と、3 管 (PPT) &#39;-GAUAUCCUGCAG ( 図 1 A) シーケンスとアクセプタ スプライス サイト (AS)。2 Xba 私制限のサイトは DS と小さな RNA 式シーケンスを挿入する使用ことができます BPS の間導入されました。哺乳類と蚊の細胞からこの人工イントロンを効果的に接続する機能が以前確認された 14 されています</li>。
</ol> 2。設計、人工イントロン小さな RNA 発現カセット 注: 過剰発現または内因性マイクロ Rna のノックダウンは、DS と BPS 間 miRNA 前駆体や miRNA スポンジを符号化するシーケンスに挿入されました。例として、miRNA 発現とノックダウンの組換えウイルスベクターを構築する ヒトスジシマカ Ae。 aal-せ-7 から内因性前駆体 miRNA が選ばれました。アンチ let 7 スポンジは、上記の方法 15 に従って設計されました。幼虫における標的遺伝子をノックダウンするには、特定人工 miRNA (amiRNA) またはオンライン ソフトウェア 16 , 17 を使用して短いヘアピン RNA (shRNA) シーケンスを考案例、V ATPase のサブユニットとして、mRNA (加盟なし。本研究ではターゲット遺伝子として AY864912) が選ばれました。AmiRNA に以下 amiVTP として参照されます。プレ-マイクロ Rna、スポンジ、amiRNA、shRNA のすべてのシーケンスの詳細 補足表 1 で説明します。
<ol><li>前駆体 Mirna、miRNA スポンジと Xba の shRNA の完全長 cdna の化学合成を注文私 DNA メーカーから両端に制限のサイト</li>。
	<li>チューブの下部にすべて乾燥 DNA であることを確認する 1 分 g は、順序付けられた DNA スピン 10,000-14,000 x で DNA ブロックを含むチューブを受信した後です</li>。
	<li>乾燥 DNA を DNase 自由水に 10 ng/μ L の最終的な集中を達成するために再懸濁します</li>。
	<li>ダイジェスト プラスミド バックボーンと DNA Xba 私 37 ° C 1 時間の配列しし、dephosphorylate、5 &#39; 牛小腸アルカリホスファターゼ (CIAP)、メーカーによると、線形プラスミッド バックボーンの両端 &#39; s プロトコル.</li>
	<li>65 で 60 分間の加熱で不活性化 CIAP ° C</li>
	<li>は 1.0% の agarose のゲルを実行し、線形のバックボーンをカットします。製造元、次ゲル抽出キットを使用してゲルのスライスから DNA を抽出 &#39; の指示</li>。
	<li>Ligate 1 h. 22 ° C で backboneby T4 DNA リガーゼ (5 U/μ L) に DNA のフラグメント</li>
	<li>ステップ 2.7 有能な エシェリヒア属大腸菌 (E. 大腸菌) にセルおよび (濃度 100 μ G/ml) にアンピシリンを含むホストゲノム スープ (LB) 寒天プレート上にプレートから ligation の反作用の製品を変換します。
	<ol><li>熱衝撃法 18、適切な エシェリヒア属大腸菌 を使用して変換を実行するひずみ。たとえば、熱ショック変換の 大腸菌 の菌株 DH5α を使用します</li>。
	</ol></li> <li>ピックから単一コロニー 2.8 をステップ、3 mL の文化に豊か (100 μ g/mL の濃度) で中含まれているアンピシリン</li>。
	<li>次のメーカー小型準備キットを使用して細菌文化からのプラスミド DNA の抽出 &#39; の指示。DNA シーケンスの会社にサンプルを送る 。
	注: 過剰発現または内因性マイクロ Rna のノックダウン、miRNA 前駆体や miRNA スポンジを符号化するシーケンスは 2 つの間挿入された Xba 私のサイトします。MiRNA 発現またはスポンジの構造をすべてを 400 未満にする必要がありますウイルス 19 包装制限のため bp (ウイルスのゲノムの長さの 10%).</li>
</ol> 3。プラスミドのバックボーンに miRNA や shRNA 発現カセットを複製することによって rAeaDV のコンス トラクターを生成する 注: pUCA pUCA プラスミド AaeDV のゲノムを含んでいるから成る感染性クローン (3,981 nt) 19、教授ジョナサン ・ カールソンによって提供された親切と以前詳細 11 に記載されています。p7NS1 した DsRed 非構造蛋白質 1 (NS1) を表現-p7 プロモーターからの赤色けい光たんぱく質 (下流) 融合タンパク質とされている 14 の他の場所の詳細について。人間固有のミール-941-1 前駆体 20 そのスポンジ、スクランブル shRNA (CGACGACTATCGTGCAATTTCAAGAG AATTGCACGATAGTCGTCG) がまた subcloned ネガティブ コントロールとして AaeDV に。
<ol><li>私はサイト Hpa にプレ-マイクロ Rna、スポンジ、shRNA や、amiVTP 式カセットを縛る pUCA プラスミド バックボーン プロトコル手順 2.7 に 2.4 で説明されているように AaeDV NS1 コーディング領域</li>。
	<li>DNA に変換 Stbl3 有能な エシェリヒア属大腸菌 細胞し、2.8 に 2.10 の手順で説明するよう肯定的なクローンを選択します</li>。
	<li>次の製造元マキシ準備キットを使用して細菌の細胞から rAaeDV プラスミドを抽出、これに続く &#39; の指示 。
	注: Stbl3 または Stbl4 エシェリヒア属大腸菌 のセルは rAaeDV DNA 変換不要 ITR 再結合を最小限に抑えるために活用されなければなりません。マキシ準備を使用すると、抽出 rAaeDV プラスミド DNA の大規模な量を取得する必要があります (&#62; 100 μ g)。RAaeDV プラスミド性シーケンスは、ウイルスを生成する前に、DNA シーケンシング 21 によって常に分析必要があります</li>。
</ol> 4。RAaeDV プラスミドを持つ株 c6/36 細胞 <ol><li>文化 C6/36 セル ロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 1640 培 10% 牛胎児血清 (FBS) と 28 ° C の定温器で 1% ペニシリン/ストレプトマイシン</li>。
	<li>0 日プレート 10 25 cm 2 培養フラスコで細胞遺伝子導入の 90-95 %1: 2 の希釈で合流するセルを分割する前に 18-20 h. 
	注: 1 日目で細胞達するべきである 90-95% 合流</li>。
	<li>1 日 transfect rAaeDV プラスミド 22 のシリーズを持つセル。
	<ol><li>600 μ L の微量遠心チューブに RPMI 1640 媒体での 10 μ g の DNA を希釈、軽く混ぜます。一方、準備 RPMI 1640 媒体の 600 μ L とトランスフェクションごとのトランスフェクション試薬を 25 μ l 添加します</li>。
		<li>室温 (RT) で 5-10 分間加温。1640 トランスフェクション試薬の混合物の 625 μ L を 1640 プラスミド DNA の混合物に追加します</li>。
		<li>加温室温 20-30 分のこの混合物トランスフェクション効率を促進する前に RPMI 1640 媒体の 2 mL で 2 回セルを洗浄しています</li>。
		<li>インキュベーション後、RT (ステップ 4.3.3) 25 cm 2 フラスコに the1640 トランスフェクション試薬 DNA プラスミドの混合物を追加し、28 で 6 h 間インキュベート ° C</li>
		<li>約 6 h 後トランスフェクションを削除トランスフェクション メディア RPMI 1640 培地 5 mL で 2 回洗浄し、10% RPMI 1640 媒体を追加 FBS 。
		注: rAaeDV Ae。 ヒトスジシマカ 幼虫の感染 (95%) の率を示しています; しかし、感染した幼虫のほぼ 50% に、我々 の経験で感染が主な感染部位 (例えば、肛門乳頭と毛細胞) なしに制限普及 23。したがって、複数組織の幼虫に感染する必要がある、蛍光蛋白を発現する欠陥組換えウイルスが感染感染部位の可視化を有効にするのにする必要があります。たとえば、表現した DsRed 欠陥組換えウイルスを生成するは、p7NS1 した DsRed を上記の手順に従って c6/36 細胞にヘルパー プラスミド cotransfected にする必要があります (失うか濃度の比は 2:1 にする必要があります).</li>
	</ol></li></ol> 5。トランスフェクション c6/36 細胞からの rAaeDV 粒子を収穫 <ol><li>収穫細胞トランスフェクション後 5 日。取り除くし、培養液中で上下ピペット 5 mL ガラスのスポイトで料理の細胞を中断します。すべての細胞懸濁液を滅菌 15 mL チューブに転送します</li>。
	<li>-80 ° c またはドライアイス ・ エタノールお風呂 30 分間での凍結し、37 で解凍 1 分 ° c. の渦は、フリーズとフリーズ解除手順を繰り返します 3 回</li>。
	<li>4 °C.Collect 上澄みで 20 分の 4,800 x g でサンプルを遠心し、ペレットを破棄します。その後、0.22 μ m シリンジ フィルターを上澄みを通過します。最終精製ウイルス粒子の-80 で在庫の因数とストア ° C 
	メモ: は、凍結融解の繰り返しをしないでください</li>。
</ol> 6。RAaeDV の定量化 <ol><li>DNA の準備標準。Hpa とすべての rAaeDV プラスミドをリニア化、ゲル抽出キット 24 消化の製品を浄化して</li>。
	<li>絶対定量標準曲線を構築し、上記の方法 25 によるとウイルスの力価を測定します</li>。
</ol> 7。蚊伝達 <ol><li>洗浄 100 1 st Ae。 ヒトスジシマカ 幼虫 3 回脱イオン水、してその後、幼虫を 95 mL の脱イオン水を入れたビーカーに転送します。RAaeDV 株 (1.00 コピー 10 10/mL の x の最終濃度) 5 mL を追加します</li>。
	<li>インキュベート 24 28 ° c、h 3 幼虫を脱イオン水を使用する洗うし、その幼虫をプレートに転送し、定期的にフィードします</li>。
	<li>は、qPCR または西部のしみ (結果を 図 3、4 に示す代表) と幼虫のターゲット遺伝子発現のレベルを監視します 。
	注: 蛍光信号の検出法より正確に感染した幼虫を分離する使用できます。たとえば、幼虫が下流を発現する組換えウイルスに感染してから蛍光信号を検出する幼虫凹面スライド上に配置でき感染 2 日後まですべての 8 h 倒立蛍光顕微鏡下で観察されました。蛍光の幼虫が検出されると、以降連続観測を許可する個々 のプラスチック テスト カップに分離する必要があります。幼虫感染した複数の組織では、このメソッドを使用して識別できます</li>。
</ol>

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</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

2 つの rAaeDV の建設を制限する重要な障壁を克服するために重要です。最初の欠陥組換えウイルスの生産です。MDV を適切に表現するベクトル スコーピオン昆虫固有 neurotoxins20 と GFP タンパク質などの外国の遺伝子のサイズとして使用できることが報告されています。ただし、建設方法に関係なく MDV の Orf を挿入または外因性の遺伝子を交換したらウイルス粒子を形成できません独自ヘルパー プラスミドは行方不明の不可欠なウイルス蛋白質を供給する cotransfected しない限り。不良のウイルスが生体内で欠損ゲノムと蚊の発生する二次伝達に従事することができます。我々 の結果は、蚊に外来遺伝子の効率的な配信を有効にする欠陥ゲノム MDVs の限界を克服することができます新しいパラダイムを提供するイントロン式戦略を検証します。
2 番目は、カプシドのサイズによって課された組換えウイルスのゲノムの要求の長さの制限です。効率的なパッケージングは、ゲノムのサイズは 4,400 ヌクレオチド (wt MDVs ゲノムの長さの 110%) を超えることはで...

マラリア、デング熱、ジカ熱、黄熱などの蚊媒介性疾患は、グローバル感染症負担1,2のかなりの割合を考慮して引き続き主要な国際的な公衆衛生の問題です。ベクトルへの応答で使用されている、従来の殺虫剤は、蚊媒介性疾患の予防のための持続可能な統合された蚊コントロール戦略の主要なコンポーネントです。しかし、このような戦略は、比較的非効果的な蚊個体群3,4の耐性の進化と同様に、関連付けられた否定的な環境影響のため望ましくないか証明しています。これらの理由から、制御及び滅菌雄蚊を生産する遺伝子組換え方法蚊の代替方法を緊急の必要性があるし、病原体耐性蚊のリリースは、有望な新しい制御戦略として生じています。効果的な新しいコントロールのメソッドなど生体内で遺伝子デリバリー、蚊の遺伝子機能の包括的な分析のための安全かつ効果的なアプローチが必要を開発します。
直接マイクロインジェクション プラスミド DNA の二重鎖 RNA (dsRNA) または小さい干渉の RNA (siRNA) は蚊の遺伝子生体内で最も一般的に使用される配送方法。実際には、蚊のトランスジェニック系統の生産は、まだ胚マイクロインジェクション5,6、7のプロセスに依存します。ただし、インジェクションには、いくつか制限があります。まず、この方法は技術的に難しく、複雑な手順が含まれます。第二に、注入は胚、幼虫、蛹、大人は、対象生物の生存に直接影響する物理的な侮辱を発生します。第三に、ほとんど水生生息地に住んでいるし、うごめく運動特性を所有しているので蚊族幼虫のマイクロインジェクションを固定化することは困難です。第四に、1st-2nd幼虫のサイズは 10 〜 20 倍より小さい 4thよりも前者のキューティクルと古い幼虫齢より繊細です。これらの機能で、1st-2nd幼虫に比べて古い段階のものを操作することが難しくなっています。組み合わせることで、これらの要因は、大人8と比較して幼虫 (約 5%) の減少の投与後生存率に貢献します。ウイルス ベースの配信システムは、関連付けられている細胞外および細胞内の障壁を克服するために開発されています。これらのシステムは、簡単操作、高伝達効率、式の長期的かつ堅牢なレベルおよび生体内で永続的な効果を生成する能力の利点を持っています。したがって、レトロ ウイルス、レンチ、およびアデノ ウイルスを利用した配信システムが広くされている遺伝子は、哺乳細胞およびモデル種を使用しました。シンドビス ウイルス発現システムは、大人の蚊; で遺伝子機能を解析する以前使用されていたしかし、バイオ セーフティの懸念のほか、注射はウイルス感染9のための必要なプロセスではまだです。DsRNA ソリューションで幼虫を浸漬による口頭配達は可能な配信方法として以前報告されていますが、小さな RNA 機能解析10に適してはないです。だから、効果的なウイルスの配信方法は、蚊のまだ開発されなければなりません。
蚊濃 (MDVs) は、 ParvoviridaeとBrevidensovirus11の属内のすべてが 1 つの秋のDensovirinae亜科の一部です。MDV ウイルス粒子はエンベロープを持たないとから成っている単一座礁させた DNA ゲノムと正二十面体のキャプシド (20 nm の直径)。ウイルスのゲノムは約 4 kb のサイズを宿主細胞の核内でレプリケートされます。MDVs 環境で比較的安定しているし、蚊の高い特異性と宿主範囲を表示します。これらのウイルスは広がり、蚊個体群の自然を保持する可能性があるし、ほとんどすべての臓器や腸、キイロショウジョウバエマルピギー細管、体脂肪、筋肉、ニューロンと唾液腺12を含むこれらの昆虫の組織に侵入することができます。
そのまま MDV ゲノムはプラスミドを用いた感染性クローン; を生成するプラスミッドのベクトルに subcloned できます。これらのクローンは、蚊のセルに配信されると、ウイルスのゲノムはプラスミッドのベクトルから抽出され、感染性ウイルス粒子が生成されます。MDV は小さな一本鎖 Dna ゲノムがあるため感染性クローンが簡単に構築されているし、ウイルスのゲノムは、簡単操作で11,13をすることができます。これらの特性は、MDV 蚊生物を調べるため貴重なエージェントを作る。しかし、ほぼすべてのウイルスのゲノムはウイルス増殖に不可欠な外来遺伝子の挿入または交換組換えウイルス作成の損失が発生ウイルスの包装および/またはレプリケーションの能力を作成する、遺伝子配達ベクトルとして MDVs の開発のための障壁。ここで、報告するシステムを開発する良品 rAaeDV生体内RNA 配信簡単プラスミド構築の利点と作り出すことができる機能的なウイルスのメンテナンスがある人工のイントロン小さな RNA 発現戦略を使用して野生型のウイルスを必要とせずホスト細胞の長期かつ安定的発現。また、この方法は、幼虫の簡単な伝達のできます。
本研究では次の手順でプロトコルの記述: 1) rAaeDVs イントロンの小さな RNA 発現カセット、2) C6/36 パッケージング細胞を用いた組換えウイルス粒子の生産をエンコーディングのデザイン ライン、3) 細胞の定量的解析rAaeDV ゲノム コピー番号、および 4) 幼虫の生息地の水の体にウイルスの直接導入によるAe。 ヒトスジシマカ幼虫の感染症。全体的にみて、この作品は、特定の Rna または標的遺伝子過剰発現したり開発 MDV の配信システムを使用して蚊の幼虫でノックダウンを示した。

<table><tbody><tr><td>遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004260</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離システム</td><td>ベックマン・コールター</td><td>363118</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET ゲル抽出キット</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0691</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A. プラスミド ミディキット</td><td>Omega Biotech</td><td>D6904</td><td></td></tr><tr><td>精製寒天</td><td>OXOID</td><td>LP0028A</td><td></td></tr><tr><td>FastAP感温性アルカリホスファターゼ(1 U/&micro;L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest HpaI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD1034</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest XbaI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0684</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase (5 U/&micro;L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>TransStbl3 Chemically Competent Cell</td><td>Beijing Transgen Biotech</td><td>CD521-01</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin&nbsp;</td><td>北京天源バイオテック</td><td>RT501</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼK</td><td>プロメガ</td><td>MC5008</td><td></td></tr><tr><td>スーパーリアルプレミックスプラス(SYBRグリーン)</td><td>北京天源バイオテック</td><td>FP205</td><td></td></tr></tbody></table>

蚊幼虫における遺伝子の機能解析の遺伝子配達ベクトルとして組換え蚊 densovirus を使用

Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae

体内のインジェクションは、個体の遺伝子の機能を解析するための最も一般的に使用される遺伝子転写法です。ただし、このメソッドはより操作を技術的に厳しいが必要ですし、小型、比較的薄く、壊れやすいキューティクル ・高い死亡率は、そのアプリケーションを制限するために幼虫に使用される場合は特に、複雑な手続きが含まれます。対照的に、遺伝子ウイルスベクターは、細胞外と細胞内の障壁を克服するため開発されています。これらのシステムは、簡単な操作、高い遺伝子導入効率、遺伝子発現、長期的な保守、生体内で永続的な効果を生成する能力の利点を持っています。蚊濃 (MDVs) が蚊に固有の小型の単一座礁させた DNA のウイルスを蚊細胞に外国の核酸を効率的に配信できます。ただし、交換または遺伝子組換えウイルスを通常作成する配信ベクトルとしてこれらのウイルスの開発への障壁である包装やレプリケーションの能力の損失が発生します。
症例人工イントロン小さな RNA 発現戦略を使用して良品組換えネッタイシマカdensovirus (AaeDV)生体内での配信システムを開発します。建設、包装、rAaeDV ベクトルの定量的解析と幼虫の感染症のための詳細な手順を示します。
本研究に留まらず、初めて、良品組換え MDV マイクロ RNA (miRNA) 式システムを開発、蚊の遺伝子の機能解析のための強力なツールを提供するのための基礎を確立、ウイルス paratransgenesis 蚊媒介疾患を制御するためのアプリケーションです。我々 は、ヒトスジシマカ1st幼虫が簡単かつ効果的に感染するサイト、幼虫の水体にウイルスを導入してとノザンまたは倒すため開発 rAaeDVs が実証、幼虫は、蚊の機能解析のツールを提供する遺伝子の特定のターゲット遺伝子の表現。

RAaeDV 建設のための戦略 蚊幼虫における下流遺伝子を表現する欠陥 rAaeDV ベクトルが生成されました。結果のプラスミドは、VP 蛋白質を削除 (図 1A) と NS1 した DsRed 融合タンパク質カセットを含まれています。miRNA の発現コンストラクトを含む rAaeDV プラスミド、miRNA スポンジ、shRNA および amiRNA は (図 1Bに示すように) 設計されていた。たとえば、rAaeDV ベクターはノザン aal-せ-7 蚊類幼虫に生成されました。結果のプラスミドには、ウイルス NS1 エクソン (図 1B) イントロンの pre-aal-せ-7 カセットが含まれています。蚊類幼虫 (<strong class="xfi...

良品組換えネッタイシマカdensovirus (AaeDV)生体内での配信システムを開発する、人工イントロン小 RNA 発現戦略を使用して報告します。建設、パッケージング、および幼虫の感染に関しては同様に rAaeDV のベクトルの定量分析のための詳細な手順を説明します。

蚊幼虫における遺伝子の機能解析の遺伝子配達ベクトルとして組換え蚊 Densovirus を使用

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method ...

この手順の全体的な目的は、組換え蚊デンソウイルスを遺伝子導入手段として用い、蚊の幼虫の遺伝子機能を解析することです。この手法は、関連する細胞外および細胞内のバリアをどのように克服するかといった、ウイルスベースのデリバリーシステムにおける重要な疑問への回答に役立ちます。これらの技術の主な利点は、操作が容易であること、導入効率が高いこと、発現が長期的にわたって堅牢であること、そして生体内で持続的な効果を生み出せることです。本研究では、開発したデンソウイルスデリバリーシステムを用いて、蚊の幼虫において特定の小型RNAまたは標的遺伝子を過剰発現またはノックダウンできることを実証しました。この手法は幼虫への導入が容易であるため、本手法で述べた発現戦略を蚊の生物学的研究へと応用することが可能です。本手順の実演は、当研究室の博士課程候補生であるPei-Wen Liuが行います。付随するテキストプロトコルに記載されている通り、まず、前駆体miRNA、miRNAスポンジ、およびshRNAのフルレングスcDNA配列の化学合成を注文します。注文したDNAを受け取ったら、DNAブロックを含むチューブを遠心分離し、乾燥したDNAがすべてチューブの底にあることを確認します。次に、DNaseフリーの水でDNAを再懸濁し、最終濃度を10 nanograms per microliterにします。XbaIを6 µL加え、プラスミドバックボーンとcDNA配列を消化し、反応液を37 °Cで1時間静置します。次に、製造者の指示に従い、牛腸アルカリホスファターゼを用いて線状化したプラスミドバックボーンの5'末端を脱リン酸化します。効率的なパッケージングのため、ゲノムサイズは野生型蚊デンスウイルスゲノムの長さの110%に相当する4,400 nucleotideを超えてはならないか、あるいは400 nucleotide以下のイントロン内microRNA発現をAedes aegyptiゲノムに導入する必要があります。次に、65°Cで加熱してアルカリホスファターゼを不活性化します。その後、1%アガロースゲルでDNA電気泳動を行い、線状化したバックボーンを切り出します。メーカーの指示に従い、ゲル抽出キットを用いてゲルスライスからDNAを抽出します。抽出後、T4 DNA ligaseを用いてDNA断片をバックボーンにライゲーションします。次に、ヒートショック法を用いて、ライゲーション反応産物をコンピテントなDH5-alpha E.coli細胞に形質転換します。形質転換した細菌を、100 micrograms per milliliterのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布します。翌日、プレートから単一のコロニーをピックアップし、100 µg/mLのアンピシリンを含む3 mLの富栄養培地を用いてスターターカルチャーを作成します。最後に、メーカーの指示に従い、ミニプレップキットを使用して細菌培養液からプラスミドDNAを抽出します。抽出したDNAのサンプルをDNAシーケンシング会社に送り、確認を行います。人工イントロン小分子RNA発現カセットで示した方法を用いて、pre-miRNAまたはshRNAをpUCAプラスミド骨格内のAaeDV NS1コード領域のHpaI部位にライゲートします。DH5-alpha細胞の代わりに、Stbl3コンピテントE.coli細胞にDNAを形質転換します。次に、形質転換した細胞を100 micrograms per milliliterのアンピシリンを含むLB寒天培地に播種し、陽性クローンからスターターカルチャーを調製します。その後、メーカーの指示に従い、maxiprepキットを用いて細菌細胞からrAaeDVプラスミドを抽出します。0日目に、90～95%コンフルエントになったC6/36細胞のフラスコを1：2に分割し、10本のT-25培養フラスコに播種します。これらのフラスコを28°Cで18～20時間インキュベートし、再び90～95%コンフルエントになるまで培養します。1日目に、作製したrAaeDVプラスミドを細胞にトランスフェクションします。そのためには、10 µgのDNAを600 µLのRPMI-1640培地で希釈し、溶液を穏やかに混ぜ合わせます。同時に、トランスフェクション1回につき、600 µLのRPMI-1640培地と25 µLのトランスフェクション試薬を用意します。細胞をDNAとともに室温で5～10分間インキュベートします。次に、プラスミドDNA混合物にRPMI-1640トランスフェクション試薬混合物を625 µL加え、この混合物を室温で20～30分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞をRPMI-1640培地で2回洗浄し、各T-25培養フラスコにトランスフェクション混合物を添加します。細胞をトランスフェクション混合液中で28 °Cで6時間インキュベートします。6時間後、トランスフェクション培地を除去し、5 mLのRPMI-1640培地で細胞を2回洗浄した後、10% FBSを含む新鮮なRPMI-1640培地を加えます。トランスフェクションの5日後、5 mLのガラスドロッパーを用いて、培養液でピペッティングを行い、ディッシュ内の細胞を剥離させて懸濁させます。各フラスコから細胞懸濁液を、それぞれ個別の滅菌済み50 mLチューブに移します。高閾値依存性ウイルスを回収するには、トランスフェクション後5日間細胞を維持する必要があります。個々のチューブを-80 °Cで、またはドライアイス・エタノールバスで30分間凍結させます。次に、37°Cで急速解凍し、細胞懸濁液を1分間ボルテックスします。続いて、遠心分離したサンプルの上清を回収し、ペレットを廃棄します。その後、上清を0.22 µmの使い捨てシリンジフィルターでろ過します。最終精製したビリオンストックを分注し、-80 °Cで保存します。1齢のA. albopictus幼虫100匹を、脱イオン水を用いて3回洗浄します。その後、幼虫を95 mLの脱イオン水が入ったビーカーに移します。rAaeDVストックを5 mL加え、幼虫を28 °Cで24時間インキュベートします。幼虫への感染を成功させ、高い感染率を確保するためには、幼虫を感染ウイルス粒子とともに24時間から36時間保持することが不可欠です。インキュベーション後、脱イオン水を用いて幼虫を3回洗浄し、幼虫をプレートに戻します。幼虫に定期的に餌を与えます。標準的な手法を用いて、定量PCRまたはウェスタンブロットにより、幼虫における標的遺伝子の発現レベルをモニターします。この例では、過剰発現を示すaal-let-7発現カセットを含む組換えウイルスを感染させた後、100匹の1齢幼虫を用いて内因性miRNAの発現を分析しました。anti-let-7コンストラクトの効率を右図に示す。ここでは、そのノックダウン能を強調している。rAaeDVベクターによるV-ATPase mRNAのノックダウン効率をモニタリングするため、計100匹の1齢幼虫に対し、幼虫の生息域の水体にウイルスを添加することで、異なる種類のrAaeDVを等量ずつ処理した。その結果、miRNA発現rAaeDVおよびイントロン性shRNA発現rAaeDVにより、V-ATPase mRNAレベルが大幅に減少した。我々の結果は、ゲノム欠損を持つ蚊デンスウイルス（mosquito densovirus）の限界を克服し、外来遺伝子を蚊へ効率的に導入することを可能にする、新しいパラダイムとなるイントロン発現戦略を検証するものです。この手順を行う際は、400 nt以下のイントロン型microRNA発現カセットのみがAedes aegyptiデンスウイルスのゲノムに導入可能であることに留意することが重要です。この技術の開発により、microRNAや標的遺伝子を過剰発現またはダウンレギュレートさせることができ、蚊の遺伝子の機能解析を探索することが可能な、非欠損性組換え蚊デンスウイルスの作製に向けた研究の道が開かれました。このビデオを視聴することで、開発された蚊デンソウイルス配送システムを用いて、蚊の幼虫における遺伝子機能を解析する方法について十分に理解することができます。

use-recombinant-mosquito-densovirus-as-gene-delivery-vector-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

逆遺伝学的アプローチは、蚊のベクトルの病原体にどの遺伝子が基礎となる抵抗を決定するための非常に有用であることが証明されている。このビデオプロトコルは、デング熱ウイルスを抱いている女性A.ネッタイシマカ蚊、にdsRNAを注入するジェームズラボで使用される方法を示しています。...

女性A.ネッタイシマカのモスキートへのdsRNAの注射

逆遺伝学的アプローチは、蚊のベクトルの病原体にどの遺伝子が基礎となる抵抗を決定するための非常に有用であることが証明されている。このビデオプロトコルは、マラリア原虫を抱いているハマダラカ蚊、にdsRNAを注入するDimopoulosラボで使用される方法を示しています。インジェクションのセットアップを操作し、胸部にdsRNAを注入する手法が示されている。...

成虫（A. gambiae）におけるRNAiのアッセイのためのプロトコル

このインタビューで、ジョージDimopoulosは熱帯熱マラリア原虫やデング熱ウイルス感染に対抗するために蚊によって使用される生理学的メカニズムに焦点を当てています。説明がどのようにキー耐火遺伝子に付与される、ベクトルの病原体に対する耐性を与えるそれらの遺伝子は、蚊で識別され、どのようにこの知識は、マラリア原虫やデング熱ウイルスを運ぶことができないトランスジェニック蚊を生成するために使用することができます。...

より良い蚊の構築：A. gambiaeとA.ネッタイシマカ蚊のマラリアとデング熱の抵抗を使用可能にする遺伝子を特定

オリゴヌクレオチドは、特に両方でトランスフェクトされた標的遺伝子の一塩基の置換サイトに使用することができます...

ロックされた核酸修飾オリゴヌクレオチドによるトランスフェクションおよび蚊細胞における標的遺伝子の変異

このプロトコルでは、とRNAiによる遺伝子サイレンシングを組み合わせる...

RNAiによる遺伝子ノックダウンと<emインビボで&gt;</em大人の女性の&gt;利尿アッセイ<em&gt;ネッタイシマカ</em&gt;蚊

Source: Liu, P., et al. Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the process of isolating recombinant Aedes aegypti densovirus (rAaeDV) from infected mosquito-derived epithelial cells. The infected cells are collected and exposed to repeated freeze-thaw cycles for lysis. Lysate is centrifuged, and the supernatant containing viral particles is filtered, aliquoted, and...

Harvesting Recombinant Aedes aegypti Densovirus from Infected Cells

このビデオでは、胚マイクロインジェクション技術を通じて、ハマダラカの蚊の胚への遺伝子ドライブ構築物の送達を実演します。この手順により、相同組換えを通じて送達されたDNAコンストラクトを生殖細胞に統合し、形質転換された蚊の集団を生成することができます。...

蚊胚マイクロインジェクション:ハマダラカの胚卵黄に外因性DNAを送達して生殖細胞変異を生成する技術

ここでは、幼虫により摂取されたキトサン/干渉RNAナノ粒子の使用を通じて疾病媒介蚊で遺伝子機能を阻害するための手順を記述している。...

病気のベクトル蚊幼虫におけるキトサン/干渉RNAナノ粒子媒介遺伝子サイレンシング

RNA干渉（RNAi）は、遺伝子の機能を明らかにするための非常に貴重なツールです。しかし、成人前の段階でRNAiを使用して遺伝子を標的とする能力は、主要なヒトマラリアベクターであるAnopheles...

RNAiのトリガ配信へ<em&gt;ハマダラカ</em&gt;蛹

このプロトコルでは、標準化し、蚊とハエの体液に直接核酸の特定の量を提供する数年間使用したマイクロインジェクションの方法論について説明します。このプロトコルは、最小限の注入の死亡率の結果し、多産の相関の線量測定が可能します。...

再現可能な dsRNA のインジェクションと蚊とハエの産卵生物検定

アノフェレスガンビアにおける機能遺伝学のGAL4-UASシステムの使用

学ぶ 組換え蚊Densovirusを用いた遺伝子配達法で、蚊幼虫における遺伝子機能解析を行う方法です。高い導入効率と長期的な発現により、遺伝子の過発現やノックダウンが可能となり、蚊の生物学研究と媒介制御戦略の発展に貢献します。

蚊幼虫における遺伝子の機能解析の遺伝子配達ベクトルとして組換え蚊 Densovirus を使用

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