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DOI: 10.3791/56128-v
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
This study presents a cost-effective method for inducing mechanical injury to segmental nerves in Drosophila larvae, allowing for visualization and quantification of neurodegeneration at the neuromuscular junction (NMJ). By utilizing this approach, researchers can investigate the cellular events associated with neurodegeneration, providing crucial insights into the underlying mechanisms of neuronal injury.
ここでは、3齢幼虫の神経筋接合部(NMJ)における運動ニューロンの神経変性を視覚化および定量化するために、 ショウジョウバエ幼虫における分節神経を傷つける簡単かつ広くアクセス可能な方法について説明する。
この手順の全体的な目標は、ショウジョウバエの幼虫の運動ニューロンの機械的損傷を誘発することです。この方法は、神経変性につながる細胞イベントの時間的シーケンスなど、神経変性研究の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、安価であり、ほとんどのショウジョウバエの研究室がすでに持っている機器を使用していることです。
この技術の意味は、神経変性を引き起こす分子メカニズムの理解にまで及びます。プロトコールを開始するには、摂氏25度で培養されたさまよう第3の幼虫を含むショウジョウバエのバイアルまたはボトルから10の2番目または3番目の幼虫を選択します。鉗子を使用して、個々の幼虫を圧縮せずに鉗子または絵筆で慎重に拾います。
10匹の幼虫を冷たい1x PBSが入ったガラス皿に直接入れて、食物の破片を取り除き、幼虫の運動性を減速させます。第3幼虫は前枝気門で識別し、第2幼虫はサイズが小さくてクラブ状の前気門で識別します。各幼虫をCO2麻酔装置に置きます。
解剖顕微鏡下で、各幼虫を慎重に背側に転がして、キューティクル全体の分節神経を視覚化します。損傷する前にキューティクルを通る分節神経を視覚化するために、各幼虫を慎重に背側に転がすことが不可欠です。マウスフックから始めて、サイズ5の鉗子を幼虫の長さの約半分から3分の2
の位置に配置します。位置が決まったら、分節神経を含む腹側キューティクルの約3分の1を、サイズ5の前頭筋でつまみます。幼虫の分節神経が損傷することを確実にするために、分節神経を押しつぶすのに十分な力を加えますが、キューティクルはそのままにしておきます。正しい力の量を決定するには、10匹の幼虫を粉砕し、5時間後の死亡率が50%未満であることを保証します 傷害後、幼虫を約0.5グラムのイーストペーストを含むフルーツジュース寒天プレートに慎重に移します。
各幼虫を、その前端がイーストペーストの上にくるように配置して、継続的に給餌します。イーストペーストと10匹の負傷した幼虫が入った寒天プレートを、空の100 x 15ミリメートルのペトリ皿の底に置きます。ペトリ皿を湿らせたペーパータオルで覆い、ペーパータオルが幼虫や寒天プレートに触れないようにします。
次に、ペトリ皿を室温の密閉容器に入れます。最後に、損傷後指定された期間後に解剖のために幼虫を回収します。損傷に先立って、野生型神経筋接合部(NMJ)は、NMJ全体を通じてシナプス後マーカーDlgに同位するシナプス前活性ゾーンマーカーBrpを示します。
分節神経の機械的損傷は、中等度から重度の神経変性を誘発する可能性があり、Dlgで染色されたブトンにはシナプス前活性ゾーンタンパク質Brpが欠如しています。その開発後、この技術は、ショウジョウバエの神経筋接合部での神経変性につながる細胞イベントの時間的順序を探求するために、ニューロン損傷を研究する研究者への道を開きました。
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