Name: 研究のための単純な神経細胞学的損傷法ショウジョウバエ運動ニューロン変性 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 18 s
Description: 学ぶショウジョウバエ幼虫の運動ニューロン機械的損傷法。神経筋接合部での神経変性を可視化・定量化し、神経変性の細胞イベントと分子メカニズムを解明する低コストで標準機器を使用する実験手法です。

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私たちはQuinnipiac UniversityのKellerとMagie Labsのメンバー全員に有益な提案をいただき、ありがとうございます。特に、Keller Lab内でこの損傷アッセイを開発したBarron L. Lincoln IIに感謝したいと思います。 LC Kellerに授与されたQuinnipiac University of Arts and Science Grant-In-Aidにも感謝したいと思います。

1.試薬および装置の準備<ol><li> 1X解離緩衝液を調製する（70のNaCl、5mMのKCl、0.02mMのCaCl 2を、20mMのMgCl 2を 、10mMのNaHCO 3を、115 mMスクロース、5 mMのトレハロース、5mMのHEPES、pHは7.2）。 </li><li> 1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を調製する。 </li><li> 0.01％Triton X-100を含む1x PBSを使用して1x PBTを調製します。 </li><li>フルーツジュース寒天プレートを準備する。 14簡潔には、H 2 O 700mLおよびオートクレーブ中で寒天30gを混合する。メチルパラベン0.5gをエタノール10mLに溶解し、果汁濃縮物（ブドウまたはリンゴ）300mLに添加する。濃縮物をオートクレーブ寒天溶液に混合し、10mm×35mmペトリ皿の蓋に注ぐ。 注：ブドウ寒天培地プレミックスは、さまざまな企業から購入することもできます（ 材料表を参照）。 </li><li>幼虫を機械的に傷つけることを可能にするサイズ5の鉗子を得る。 </li><li>標準的なショウジョウバエの CO 2を使用する</s麻酔に基づく麻酔装置。 </li></ol> 2. ショウジョウバエの幼虫の選択<ol><li> 25℃で培養した放浪している3齢幼虫を含むショウジョウバエのバイアルまたはボトルを取る。 </li><li>外観に基づいて10個の個々の2 番目または3 番目の幼虫を選択する。第3齢幼虫は、前枝の奇形の出現によって識別することができ、第2齢幼虫はより小さく、よりクラブ様の前棘を有する。 注：幼虫の段階は、タイミングによっても識別することができます。 25℃で、第2齢幼虫は孵化後約48時間後に現れ、第3齢幼虫は約24時間後に脱皮する。 NMJで神経変性を調べることに興味がある場合、第2齢の幼虫を傷つける必要がある。 </li></ol> 3.機械的損傷のためのショウジョウバエ幼虫の準備<ol><li>慎重に個々の幼虫を鉗子や絵筆で慎重に選んでください。とにかくそれを圧縮しないでください。 </li><li>冷たい1X PBSまたは解剖緩衝液を含むガラス皿に直接10匹の幼虫を置き、食物残骸を除去し、幼虫運動性を減速させる。 </li></ol> 4. ショウジョウバエ幼虫の機械的損傷および処置<ol><li>個々の幼虫をCO 2麻酔装置に置きます。 </li><li>切開顕微鏡下で、キュービクルを通して分節神経を視覚化するために、各幼虫をその背側に注意深く転がす。 </li><li> 位置の大きさ5の鉗子は、口のフックから始まる幼虫の長さのおよそ1/2から2/3の距離を下っています。いったん配置されると、サイズ5の鉗子で分節神経を含む腹側キューティクルの約1/3が挟まれる。 <ol><li>幼虫の分節神経が傷ついていることを確認するには、分節神経を粉砕するのに十分な力をかけてください。正確な力量を決定するには、10匹の幼虫を粉砕し、5時間後の死亡率は50％未満である。 </li></ol></li><li>傷害後、約0.5gの酵母ペーストを含む果汁寒天プレートに幼虫を注意深く移す。その前端が酵母ペースト上にあるように、各幼虫を置いてください。 注：幼虫の分節神経が損傷したことを確実にするために、寒天プレートに移した後、幼虫の運動性が崩壊することがあります。負傷した幼虫は、損傷の部位の後ろで効果的に麻痺するが、口のフックと餌をまだ動かすことができる。損傷後の動物の高い死亡率は一般的であるため、実験に必要な量よりも20〜50％多い動物を傷つけることが最善である。 </li><li>空の100×15mmペトリ皿の底に、酵母ペーストと10匹の傷害した幼虫を含む寒天プレートを置く。湿ったペーパータオルで寒天プレート上の負傷した幼虫を含むこのペトリ皿を覆い、ペーパータオルが幼虫または寒天プレートに触れないようにします。これを置くペトリ皿を室温でより大きな気密容器に入れる。 </li><li>傷害後の特定の期間（6,12、または24時間）後に解剖のために幼虫を回収する。 注：軸索細胞骨格に対する損傷の即時の影響を調べるために、幼虫を損傷後に直接解剖することができる。軸索輸送欠陥を調べるために、幼虫を損傷の約6時間後に解剖することができる。損傷の約12時間後に、ユビキチン化タンパク質の蓄積が観察され、損傷の24時間後に、NMJにおける運動ニューロンの変性が観察され得る。 </li></ol> NMJでの神経変性の解析<ol><li>前述のようにショウジョウバエの幼虫NMJを解剖する。 15、16背側表面に沿って切断したシルガードプレート上に簡単に説明すると、ピン幼虫、及び体壁筋肉組織を露出させる解剖緩衝液滴のピンとフィレット。 4％パラホルムアルデヒド（PFA）またはBouin&#39;s Solutionのいずれかで幼虫を抗ニューロンと筋肉を視覚化するために使用されるボディ。 注意：Bouin固定液があまりにも過酷な場合があるため、緑色蛍光タンパク質（GFP）などの蛍光タンパク質タグを視覚化する場合は、PFA固定を使用する必要があります。 </li><li> 11、13、16は 、同時にシナプス前運動ニューロンと隣接シナプス後（SSR）筋襞をマークするために、以前に記載された免疫蛍光を行います。蛍光共役型西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）（1：300） 17でシナプス前膜および軸索を視覚化し、活性部位を抗Bruchpilot（Brp）抗体（nc82; 1：100; Developmental Studies Hybridoma Bank）を用いて染色することができる。抗Dicsラージ（Dlg）抗体（1：10,000）でシナプス後の筋肉を同時に標識する。 18 </li><li>以前に記載されているように、NMJでの神経変性を定量化するための確立されたアッセイを実施する。 8 </suP&gt;、9、10、11、12、13、14簡単に説明すると、同時に前およびシナプス後コンパートメントの両方のために個々のNMJを可視化します。シナプス後のマーカーで標識されているがシナプス前のマーカーではないブトンは、神経変性の部位を示す（ 図1 ）。 NMJあたりの平均ブトン数および動物あたりのNMJの平均数を定量化することができる。 </li></ol>

<ol><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophilia%2C+the+golden+bug%2C+emerges+as+a+tool+for+human+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).</li>
<li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).</li>
<li>McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+an+in+vivo+model+for+human+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease.</a> Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).</li>
<li>Shin, J. E., Cho, Y., Beirowski, B., Milbrandt, J., Cavalli, V., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+leucine+zipper+kinase+is+required+for+retrograde+injury+signaling+and+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration.</a> Neuron. 74 (6), 1015-1022 (2012).</li>
<li>Xiong, X., Wang, X., Ewanek, R., Bhat, P., Diantonio, A., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+turnover+of+the+Wallenda%2FDLK+kinase+regulates+a+retrograde+response+to+axonal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury.</a> J Cell Biol. 191 (1), 211-223 (2010).</li>
<li>Xiong, X., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditioning+lesion+protects+axons+from+degeneration+via+the+Wallenda%2FDLK+MAP+kinase+signaling+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade.</a> J Neurosci. 32 (2), 610-615 (2012).</li>
<li>Mishra, B., Ghannad-Rezaie, M., Li, J., Wang, X., Hao, Y., Ye, B., Chronis, N., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microfluidics+chips+for+live+imaging+and+study+of+injury+responses+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. (84), e50998(2014).</li>
<li>Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynactic+is+necessary+for+synapse+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dynactic is necessary for synapse stabilization.</a> Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).</li>
<li>Eaton, B. A., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIM+Kinase1+controls+synaptic+stability+downstream+of+the+type+II+BMP+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LIM Kinase1 controls synaptic stability downstream of the type II BMP receptor.</a> Neuron. 47 (5), 695-708 (2005).</li>
<li>Pielage, J., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+spectrin+is+essential+for+synapse+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic spectrin is essential for synapse stabilization.</a> Curr Biol. 15 (10), 918-928 (2005).</li>
<li>Pielage, J., Cheng, L., Fetter, R. D., Carlton, P. M., Sedat, J. W., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+presynaptic+giant+Ankyrin+stabilizes+the+NMJ+through+regulation+or+presynaptic+microtubules+and+transsynaptic+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A presynaptic giant Ankyrin stabilizes the NMJ through regulation or presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion.</a> Neuron. 58 (2), 195-209 (2008).</li>
<li>Massaro, C. M., Pielage, J., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+that+enhance+synapse+stability+despite+persistent+disruption+of+the+spectrin%2Fankryin%2Fmicrotubule+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms that enhance synapse stability despite persistent disruption of the spectrin/ankryin/microtubule cytoskeleton.</a> J Cell Biol. 187 (1), 101-117 (2009).</li>
<li>Lincoln, B. L. 2nd, Alabsi, S. H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuronal+injury+follows+a+temporal+sequence+of+cellular+events+leading+to+degeneration+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction.</a> J Exp Neurosci. 9, Suppl 2. 1-9 (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/9/pdb.rec065672.short">Drosophila apple juice-agar plates.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2011).</li>
<li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19329927">Drosophila larval NMJ immunohistochemistry.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Smith, R., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+imaging+of+active+zones+in+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection and imaging of active zones in the Drosophila neuromuscular junction.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li>
<li>Jan, L., Jan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+horseradish+peroxidase+as+specific+neuronal+markers+in+Drosophila+and+in+grasshopper+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (8), 2700-2704 (1982).</li>
<li>Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+tumor+suppressor+gene+dlg+is+required+for+normal+synaptic+bouton+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure.</a> Neuron. 13 (4), 823-835 (1994).</li>
</ol>

著者は何も開示することはない。

以前に記載され、ここに示されたニューロンの機械的損傷は、 ショウジョウバエの幼虫の分節神経における損傷/ストレスを誘発するために使用され得る。 4、5、6、14この実験的手法は、神経変性を導く事象の時系列を分析するために、ならびに損傷後の運動ニューロンの細胞体における転写の変化を調べるために以前に使用されてきました。 5、14また、この技術は、観察し、 ショウジョウバエの幼虫における軸索変性と再生を研究するために、マイクロ流体チップと併せて記載されています。この技術の7つの制限事項は、けがの導入時にキューティクルの穿刺による幼虫の死亡が含まれます。しかし、大量の幼虫は、shで粉砕するこ...

ニューロンの変性は、正常な発達中に起こり、自然な老化過程、傷害、ストレス、または病状によって引き起こされうる。 ショウジョウバエのmelanogasterは、一般的なフルーツフライは、ニューロンの変性を駆動する分子メカニズムの顕著な類似性のため、神経変性を研究するためのシンプルで強力なモデル生物を提供します。これらの類似性は、疾患関連ヒト遺伝子の約70％がショウジョウバエ相同体を有するという事実によって強調される。 1はまた、数多くのアッセイおよび人間の神経変性疾患を研究するための技術のツールは、ショウジョウバエで開発され、利用されています。 ショウジョウバエ内で2、3、神経筋接合部（NMJ）は、両方の細胞および電気生理学的特性の解析を可能にし、可視nに神経筋疾患を研究するための重要なシステムであることが証明されましたユーロン - 筋肉の接続。 図2は、本研究では、分節神経の再現性の傷害を可能にし、ショウジョウバエの幼虫におけるin vivo神経細胞傷害アッセイを説明します。この運動ニューロン損傷は、損傷後24時間のNMJにおいて神経変性を生じる細胞事象の一時的な配列を生じる。神経変性を生じる運動ニューロンを再現可能に傷つける能力は、変性過程に必要とされる特定の遺伝子の同定、ニューロン損傷に対する転写応答の解剖および保護シグナル伝達カスケードの分析などの多様な用途を有する。 図4、 図5、 図6は、この方法は、生きている動物における神経変性および再生を研究するために、マイクロ流体と組み合わせて使用されてきました。 7 我々は、確立された定量アッセイを利用して、運動ニューロン変性イオンが機械的損傷後にショウジョウバエ NMJで検出される。このアッセイは、シナプス前膜およびタンパク質の損失が、シナプス後の筋膜の折畳みによって特徴付けられる潜在網状赤血球（SSR）の分解に先行するという事実に基づいている。 8、9、10、11、12、13このアッセイは、シナプス前ニューロンが隣接シナプス後筋肉への接続を失った「シナプス足跡」の定量化を可能にします。変性工程は、幼虫の発育12を通じて進行性であることが示されており、変更されたシナプスの発達又は発芽によって説明することができません。 8、9、10、11、12広告既存の突然変異よりも機械的損傷を使用することの利点は、それが、NMJでの神経変性に至る細胞事象の時間的順序の解剖を可能にすることである。 13

<table><tbody><tr><td>マイクロ解剖はさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #3 鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11231-30</td><td>サイズ3を好む人もいれば、サイズ5を好む人もいます</td></tr><tr><td>デュモン#5鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11251-30</td><td>サイズ3を好む人もいれば、サイズ5を好む</td></tr>人もいます <tr><td>CO2 Air Tank</td><td>Tech Air</td><td>UN 1013</td><td>様々なタンクサイズが購入可能</td></tr><tr><td>CO2 麻酔器具</td><td>ジェネシー・サイエンティフィック</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>ステンレス製ピン、サイズ0.1</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>シルガード 184 シリコーンエラストマー、ベース、硬化剤</td><td>ダウ・コーニング</td><td>3097358-1004</td><td>解剖板を注ぐため</td></tr><tr><td>ブインの溶液</td><td>シグマ</td><td>HT 10132-1L</td><td>抗体は、</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中のBouin'sおよびPFA 4%パラホルムアルデヒド(PFA)</td>での効率についてテストする必要があります<td>Affymetrix</td><td>FLY-8030-20</td><td>抗体は、Bouin'sおよびPFA</td></tr><tr><td>解剖ステレオマイクロスコープ</td><td>AmScope</td><td>SM-1BZ</td><td></td></tr><tr><td>光源</td><td>AmScope</td><td>HL150-AY-220V</td><td></td></tr><tr><td>抗NC82抗体でその効率をテストする必要があります</td><td>開発研究 ハイブリドーマバンク</td><td>nc82-s</td><td></td></tr><tr><td>抗椎間板 大型抗体</td><td>開発研究 ハイブリドーマバンク</td><td>AF3</td><td></td></tr><tr><td>アレクサフルオ 抗西洋ワサビペルオキシダーゼ</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>123-545-021; 123-585-021; 123-605-021</td><td>1つは、アレクサフルオール&reg; 488、594または647</td></tr>フライ<tr><td>スタッフグレープジュース寒天プレミックス</td><td>ジェネシーサイエンティフィック</td><td>47-102</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>ジェネシー・サイエンティフィック</td><td>29-101</td><td></td></tr><tr><td>ガラス・カバースリップ</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>12-545-87</td><td></td></tr><tr><td>サーモ・サイエンティフィック ナルゲン・ユーティリティ・ボックス</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>03-484C</td><td>幼虫の回復のための湿潤チャンバーの作成に使用</td></tr></tbody></table>

研究のための単純な神経細胞学的損傷法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;運動ニューロン変性

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

ニューロンの変性は、正常な発達中、および傷害、ストレス、および疾患に応答して起こる。ニューロン変性の細胞の特徴は、ヒトおよび無脊椎動物において、これらの過程を駆動する分子メカニズムと同様に著しく類似している。 ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster ）は、神経変性疾患の細胞の複雑さを研究するための強力で単純な遺伝モデル生物を提供する。実際には、疾患関連ヒト遺伝子の約70％がショウジョウバエ相同体を有し、ヒト神経変性疾患を研究するためにハエを用いて多数のツールおよびアッセイが記載されている。より具体的には、 ショウジョウバエの神経筋接合部（NMJ）は、神経細胞と筋肉との間の構造的結合を解析する能力のために、神経筋疾患を研究するための有効なシステムであることが証明されている。ここでは、 ショウジョウバエの in vivo運動ニューロン損傷アッセイについて報告する。24時間までにNMJにおいて神経変性を再現可能に誘発する。この方法論を用いて、運動ニューロン変性をもたらす細胞事象の時間的順序を記載した。傷害方法は多様な用途を有し、神経変性に必要な特定の遺伝子を同定し、神経損傷に対する転写応答を解剖するために利用されている。

ここに示した手順を使用して、我々は、機械的な神経損傷が神経変性事象の時間的解剖を可能にすることを実証した。 14、イベントのシーケンスが以前に特徴付けられ、軸索トラフィッキング欠陥続いて細胞骨格の即時中断、ユビキチン化タンパク質の蓄積、およびそれに続く神経変性の24時間後に傷害で始まるされている18。傷害の前に、WT NMJsは、シナプス前マーカーであるBrpを、NMJ全体にわたるシナプス後マーカーDlgに付随して示す （ 図1A ）。分節神経の機械的損傷は中程度から重度の神経変性を誘導することができ、Dlgで染色されたブトンは今やシナプス前活性ゾーンタンパク質Brpを欠いている（ 図1B ）。 Dlgで染色されているがBrp染色が欠けているブトンはいずれも &quot;syn&...

ここでは、3齢幼虫の神経筋接合部（NMJ）における運動ニューロンの神経変性を視覚化および定量化するために、 ショウジョウバエ幼虫における分節神経を傷つける簡単かつ広くアクセス可能な方法について説明する。

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

この手順の全体的な目的は、ショウジョウバエ幼虫の運動ニューロンに機械的な損傷を誘発することです。この手法は、神経変性に至る細胞イベントの時間的順序など、神経変性研究分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法の主な利点は、費用が安く、ほとんどのショウジョウバエ研究室が既に保有している設備で実施できることです。この手法の意義は、神経変性を促進する分子メカニズムの解明にまで及びます。プロトコルを開始するために、25°Cで培養し、徘徊期の3齢幼虫が含まれているDrosophilaのバイアルまたはボトルから、2齢または3齢幼虫を10匹選び出します。ピンセットまたは絵筆を用い、幼虫を圧迫しないように注意しながら、個々の幼虫を慎重に拾い上げてください。10匹の幼虫を、冷えた1x PBSを含むガラスシャーレに直接投入し、餌の残渣を除去して幼虫の運動性を低下させます。前方の分枝気門によって3齢幼虫を、より小さいサイズと棍棒状の前方気門によって2齢幼虫を識別します。各幼虫をCO2麻酔装置の上に配置します。解剖顕微鏡下で、各幼虫を慎重に背側へ転がし、クチクラを通して分節神経を可視化させます。損傷を与える前に、クチクラ越しに分節神経を確認するためには、各幼虫を慎重に背側へ転がすことが不可欠です。口鉤から始めて、サイズ5のピンセットを幼虫の全長のおよそ2分の1から3分の2のあたりに配置します。位置を決めた後、分節神経を含む腹側クチクラの約3分の1をサイズ5のピンセットでつまみます。幼虫の分節神経を確実に損傷させるため、クチクラを損なわずに分節神経を圧砕するのに十分な力を加えます。適切な加圧量を決定するために、10匹の幼虫を圧砕し、5時間後の死亡率が50%未満であることを確認してください。損傷後、幼虫を約0.5gの酵母ペーストを含むフルーツジュースアガープレートに慎重に移動させます。各幼虫の前端が酵母ペースト上にくるように配置し、給餌を継続させます。酵母ペーストと10匹の損傷した幼虫を含むアガープレートを、空の100×15 mmペトリ皿の底に置きます。ペトリ皿を湿らせたペーパータオルで覆い、その際、ペーパータオルが幼虫やアガープレートに触れないようにしてください。その後、ペトリ皿を室温の密閉容器に入れます。最後に、損傷後、指定した時間が経過した後に幼虫を回収し、解剖を行います。損傷前、野生型の神経筋接合部（NMJ）では、NMJ全体にわたって、シナプス前膜の活性帯マーカーであるBrpが、シナプス後膜のマーカーであるDlgに隣接して見られます。分節神経の機械的損傷は、Dlgで染色されたボタンからシナプス前活性帯タンパク質Brpが消失するという、中等度から重度の神経変性を誘発します。この手法の開発により、神経損傷を研究する研究者は、ショウジョウバエ（Drosophila）の神経筋接合部における神経変性に至る細胞イベントの時間的経過を探索することが可能となりました。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

ショウジョウバエ神経筋接合部(NMJ)は、シナプスの形態と機能を研究するためのモデルとして使用されます。このビデオでは、研究者がNMJを特徴付けるために定量化する重要な特徴について説明します。このプロトコル例は、定量を自動的に実行できるソフトウェアを示しています。...

ショウジョウバエ神経筋接合部(NMJ)の定量化:シナプスの形態と機能を評価する方法

2光子レーザーによる神経損傷:ショウジョウバエ幼虫の軸索変性と再生の観察法

このビデオは、ショウジョウバエの幼虫の分節神経に機械的損傷を介して神経変性を誘発する方法を示しています。麻酔をかけた幼虫の腹側キューティクルを鉗子でつまんで、分節神経に損傷を与えます。負傷した幼虫は食物で維持されるため、損傷によって神経の運動ニューロンが変性し、神経筋接合部(NMJ)が破壊される可能性があります。...

ショウジョウバエの幼虫を機械的に傷つけ、神経分節神経を誘発する。

このビデオは、ショウジョウバエの背側縦筋の神経筋接合部の構造的完全性を評価するためのプロトコルを示しています。この手順では、ニューロンと筋肉を2つの異なる抗体で染色し、突然変異型と野生型のハエの蛍光パターンを比較します。突然変異型ハエのニューロン染色の減少は、神経変性を示していますが、筋肉構造は無傷のままです。...

ショウジョウバエの背側縦筋神経筋接合部の構造的完全性の評価

中枢神経系の再生および修復を調査するために、ショウジョウバエの幼虫腹神経索を用いた傷害のパラダイムが記載されている。意図的に開発されたソフトウェアと遺伝との定量的な分析と組み合わせタイムラプスおよび固定標本でレーザー走査共焦点顕微鏡法、続いて刺すことは中枢神経系の再生および修復の分子メカニズムを解明するために使用されます。...

中枢神経系の修復を調査するために傷害パラダイム<em&gt;ショウジョウバエ</em

ショウジョウバエの幼虫は、その半透明のキューティクルと強力な遺伝学へのライブイメージングのための魅力的なモデル系である。このプロトコルは、単層のPDMSデバイスを活用する方法について説明し、 第3齢ショウジョウバエの幼虫の神経細胞内で細胞過程のライブイメージングのための「幼虫チップ」と呼ばれる。...

における損傷応答のライブイメージングや研究のためのマイクロ流体チップを使用<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

ここでは、としてショウジョウバエ感覚ニューロンの樹状分枝 (da) ニューロン損傷モデルは、体内を組み合わせたライブ イメージング、2...

再生に関する末梢および中枢神経系を研究するため生体内でショウジョウバエ損傷モデル

親油性蛍光色素を用いたショウジョウバエ胚性運動ニューロンの逆行トレース方法について説明する。...

親油性蛍光色素を用いたショウジョウバエ胚性運動ニューロンの逆行トレーシング

ここでは、ショウジョウバエメラノガスターで3つの単純な傷害誘発軸索変性(軸索死)アッセイを行い、切断された軸索とそのシナプスの形態学的および機能的保存を評価するプロトコルを提供する。...

ショウジョウバエメラノガスターにおける軸索死における軸索とそのシナプスの形態学的および機能的評価

神経変性と関連した成人 ショウジョウバエ におけるシナプス変性の可視化

神経筋接合のアーキテクチャを維持し、成人 ショウジョウバエ 脚の運動ニューロンの詳細な免疫細胞化学的研究を可能にする解剖技術について述べています。...

認識された運動ニューロンの神経筋接合部における変化を検出する ショウジョウバエ 成脚の解剖と免疫染色

学ぶショウジョウバエ幼虫の運動ニューロン機械的損傷法。神経筋接合部での神経変性を可視化・定量化し、神経変性の細胞イベントと分子メカニズムを解明する低コストで標準機器を使用する実験手法です。

研究のための単純な神経細胞学的損傷法

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