その場でMHC テトラマー染色と場所、豊富と組織における抗原特異的 cd8 陽性 T 細胞の表現型を決定するための定量解析

この手順の全体的な目標は、目的の組織内の抗原特異的CD8陽性T細胞の位置、存在量、および表現型を決定することです。この方法は、ほぼすべての抗原特異的CD8 T細胞および任意の組織を位置特定、定量化、表現型決定する手段を提供することにより、CD8 T細胞に関する迅速な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、抗原特異的CD8陽性T細胞の空間分布を、関心のある組織内の他の細胞や構造と比較して決定できることです。

Shengbin Liとの手順のデモンストレーションは、Gwantwa Mwakalundwaです。施術当日はメスを使って、新鮮な組織を約0.5×0.5cmの大きさに切ります。ここでは、アカゲザルの脾臓組織を示しています。

各組織片をプランジャーの上部の中央に別々に接着し、PBS中の温かい4%低融点アガロースの3〜5ミリリットルにサンプルを埋め込みます。プランジャーに関連する組織情報にラベルを付けます。次に、サンプルを氷のバケツの冷やしたホルダーに入れます。

寒天が固まったら、ミクロトームをONにし、厚さ設定を200マイクロメートルに設定します。新しいカミソリの刃を取り付けた後、プランジャーをミクロトームバスに挿入します。ミクロトームバスに100〜200ミリリットルの新しく準備したPBS-Hを入れ、PBS-Hアイスキューブを追加して温度を摂氏0〜2度に保ちます。

200 μm の切片を取得した後、ペイントブラシを使用して各切片を囲む寒天を取り除き、1 ミリリットルの冷却 PBS-H を含む 24 ウェル組織培養プレートの個々のウェル内の個々の組織チャンバーにサンプルを移します。すべてのサンプルを取得したら、組織切片をMHCクラス1四量体を充填した1ミリリットルの適合標識ペプチドで一晩インキュベートし、PBS-Hで希釈し、2%正常ヤギ血清を4°Cでロッキングします。翌朝、各ティッシュチャンバーを、1ミリリットルの新鮮な冷やしたPBS-Hを含む新しい24ウェルプレートの個々のウェルに20分間移します。

2回目の洗浄後、切片を新鮮な4%パラホルムアルデヒド1ミリリットルに室温で2時間固定します。その後、冷たいPBS-Hで5分間の洗浄を2回行います。切片を0.01モル尿素を含む新しい24ウェルプレートに移し、尿素が沸騰するまで毎回約10秒間、切片を3回電子レンジで加熱します。

サンプルを透過処理してブロッキングするには、0.3%トリトンx100界面活性剤と2%ノーマルヤギ血清を添加したPBS-Hを含むブロッキング溶液中の切片をロッカー上で4°Cで1時間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、ウサギ抗FITC 抗体、マウス抗ヒト CD 抗体、およびラット抗ヒト CD3 抗体を含む 1 ミリリットルの溶液を含む新しい 24 ウェルプレートの個々のウェルに組織チャンバーを移します。サンプルを4°Cで一晩インキュベートし、ロッキングします。

3日目には、新鮮なPBS-Hで4°Cの新鮮なPBS-Hで3回、1回の洗浄につき少なくとも20分間洗浄し、適切な蛍光標識二次抗体と最大3日間、光から保護した最終インキュベーションを行います。三次抗体インキュベーションの最後に、新鮮なPBS-Hで20分間の洗浄を3回行い、サンプルをすすぎ、ペイントブラシを使用して各組織チャンバーからサンプルをガラス顕微鏡スライドに移します。各切片に蛍光色素防腐剤を添加した封入剤をコーティングし、サンプルをカバースリップで覆います。

次に、スライドを光で保護されたスライドコンテナに摂氏20度で保管します。イメージング当日は、最初のスライドを共焦点顕微鏡のステージに置き、組織サンプルの標識に使用する各蛍光色素に適したレーザーとフィルターを選択します。20倍対物レンズを使用して、複数の800 x 800ピクセルフィールドにおいて、各蛍光色素チャネルで3ミクロン間隔でzシリーズを連続して取得します。

次に、収集したフィールドのモンタージュを作成し、各モンタージュ画像を対応する組織サンプルに基づく名前で保存します。これらの代表的な画像では、SIVペプチドをロードしたMHCクラス1テトラマーで染色した切片を、無関係なペプチドをロードしたMHCクラス1テトラマーで染色した同じ組織から分離した切片と比較し、テトラマー染色の特異性を示しています。これらの画像では、SIVペプチドをロードしたMHCクラス1四量体で染色したウイルス特異的T細胞、B細胞上に発現する細胞表面タンパク質であるCD20ではなくT細胞サブセットマーカーであるCD8の共染色

このモンタージュは、リンパ節上の特定の表現型と異なる解剖学的コンパートメントを持つ四量体で染色された細胞の定量に使用された複数の共焦点zシリーズフィールド用に作成されました。この拡大画像は、IGM 染色によって描かれた B 細胞卵胞を含むモンタージュリンパ節の領域を強調しています。MHCクラス1テトラマー染色細胞は、その一部がT細胞活性化および増殖マーカーであるKI67を共発現し、B細胞卵胞の内外で検出できます。

この染色の組み合わせにより、SIV特異的CD8陽性T細胞の活性化および増殖状態、ならびに二次リンパ組織内でのそれらの局在を決定できます。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば約5日で完了することができます。この手順を試みる際には、染色を成功させるためには新鮮な組織が重要であることを覚えておくことが重要です。

採取後24時間以内にサンプルを処理し、固着するまで冷やしておきます。このビデオを見た後、目的の組織における抗原特異的CD8陽性T細胞の位置、存在量、表現型を決定するためのテトラマー染色と免疫組織化学の実施方法を十分に理解しているはずです。感染性病原体の取り扱いは非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には、適切な個人用保護具の着用や鋭利物の使用の制限など、曝露を防ぐための予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。