Name: その場でMHC テトラマー染色と場所、豊富と組織における抗原特異的 cd8 陽性 T 細胞の表現型を決定するための定量解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学ぶその場でMHCテトラマー染色と免疫組織化学を組み合わせた手法により、組織内の抗原特異的CD8陽性T細胞の位置、豊富さ、表現型を定量的に解析する方法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作業によって支えられた公衆衛生サービスを健康の国民の協会 (T32 DA007097、R01AI096966、andUM1AI26617) から付与します。

1 です。 一日 1: 新鮮なティッシュの区分と主なインキュベーション <ol><li>使用メス小 (約 0.5 センチ幅 0.5 cm 背の高い) 部分に新しいティッシュをカットします。別にプランジャーを各組織を接着し、4% 低溶解アガロースの 3-5 mL の PBS に埋め込みます。ステッカーを使用して組織情報にプランジャーをラベルします。固めるため氷バケットにチルド ホルダーに入れています</li>。
	<li>ミクロトームとインストール ミクロトームと挿入ピストンにかみそりの刃は、200 μ m にセクションの厚さはティッシュ ミクロトーム風呂でマウント セットを有効にします</li>。
	<li>は、RNA を維持するために、潜在的なっぽいアプリケーション下流を許可する pbs 100 μ g/mL または 18.7 U/mL のヘパリンを追加してリン酸緩衝生理食塩水 (PBS H) とを準備します。埋め込まれた組織は、チルド、滅菌 PBS H の 100-120 mL をカバー、ミクロトーム風呂します。0 - で温度を維持するためにお風呂に PBS H アイス キューブを追加 2 ° c. の開始ミクロトームとカット 200 μ m のセクションに組織します 。
	注: 組織内で細胞の活動を最小限に抑えるため氷の上冷蔵組織を維持することが重要だ、新鮮な組織は、冷やされてセクションに簡単に。下流 ISH のための計画がない場合に単独で PBS を使用できます</li>。
	<li>(例えば 腸と肺)、ミクロトームでうまく切れない組織として細い短冊状に組織を切断するメスや剃刀の刃を使用して、または、200 μ m まで可能な限り近い</li>。
	<li>実験的サンプル情報 24 ウェル培養プレートの蓋のラベルし、対応する井戸における組織室を配置します。セクションを組織の商工会議所に転送するペイント ブラシ セット 1 mL を含む 24 ウェル培養プレートの井戸に使う冷蔵 PBS H. 
	注: 再利用可能な組織のチャンバーは染色を開始する前にすべきであります。組織 14 mL ポリプロピレン製丸底スナップ キャップ チューブを使用して行うことができ、ワイヤー メッシュ。14 mL ポリプロピレン製丸底スナップ キャップ チューブの下部を切断するのに鋭いかみそりの刃を使用します。管の下部にある穴に合わせて輪にワイヤー メッシュをカットします。熱赤熱するまでにブンゼン バーナーを使ってワイヤ メッシュ サークル。非常に迅速にワイヤー メッシュ丸を設定し、メッシュにチューブをプッシュします。ワイヤー メッシュをチューブの底にしっかりと接続するか、慎重に鋭いかみそりの刃を使用して、3 mL マーク チューブの上部を切断し、確認してください。各組織の商工会議所または最大 1 cm 2 あたりも組織の組織切片を最大 3 を置きます。交差汚染を避けるために異なる抗体併用井戸間少なくとも 1 つの空井戸を維持します</li>。
	プライマリ <li>進む四量体と抗体の組織の部屋にすべてカット セクションの転送を終えた後すぐに染色します。浸漬し、すべての回で 1 ml の PBS H 冷蔵セクションを維持します</li>。
	<li>インキュベート 0.5 μ G/ml の FITC 結合、ペプチド負荷の MHC と一晩ティッシュ セクション-私テトラマー 2% ヤギ血清 (NGS) で H PBS で希釈します。マウスまたはウサギ以外がこの培養に興味の細胞外の抗原に抗体が含まれます (例えば ラット抗 CD8 抗体希釈 2% PBS H でレバレッジ NGS)。各ウェルに 1 mL の希釈した抗体を配置します 。
	注: いくつかを強化することができ、T 細胞受容体 4 , 21 にバインド MHC テトラマーを抑制することがいくつか CD8 抗体を選択するときは、注意をすべき。ここで説明したラット抗 CD8 抗体は不安定なので、場合によってはやや弱い染色結果します。それは唯一の非-ウサギ、マウス非 CD8 抗体テストそのステンド グラス アカゲザル マカクザル CD8 T 細胞をラベル付けトリプル使用します</li>。
	<li>一次抗体とそれ以降のすべての孵化、ウェルあたり溶液 1 mL を使用し、このそのロッキング プラットフォーム上のプレートの 4 ° C ですべての後続孵化します 。
	注: 組織は、商工会議所で自由にフロートする必要があります</li>。
</ol> 2。2 日目: 固定および二次培養 <ol><li>主なインキュベーション後洗って 1 mL で 2 回 20 分冷やした PBS H 部各洗浄。組織の部屋を対応する井戸で冷やした PBS H の 1 mL を含む異なる 24 ウェル培養プレートに転送することによってこれを行うにします 。
	注: 組織の部屋間を移動するとき別のものに 1 つの実験試料から内容を流れないように気をつけてください。すべての後続の孵化および洗浄、同様に組織のチャンバーを適切なソリューションを含むきれいなプレートに転送します。節に立ち往生が組織の部屋の側面にしていないことを確認する手順の中に組織の部屋でセクションを監視しなければなりません。彼らは戻ってソリューションにそれらをプッシュ、場合</li>。
	<li>は、室温で 2 時間の新鮮な PBS バッファー 4% パラホルムアルデヒドの ml の 1 セクションを修正 (過剰修正しない)。5 分間 2 回冷 PBS h 洗浄 
	注意: パラホルムアルデヒドは有毒である;適切な保護具を着用します 。
	注: 抗原検索、透過は、細胞内の抗原を検出する必要がある場合抗原によって取得できますパラホルムアルデヒドの固定後 0.01 mol の尿素のセクションを沸騰します</li>。
	<li>は 0.01 mol の尿素を含む 24 ウェル培養皿にセクションを転送し、電子レンジでこれらのプレートを配置します。3 回約 10 のセクションを沸騰 s ごとに、合計 30 s. 
	注: 非常に注意して、沸騰としてソリューションは井戸の断面を強制的ことができます。このような場合かをプッシュするセクション組織チャンバーの側面からプレートの蓋から戻って適切な組織チャンバーの底に絵筆を使用します</li>。
	二次抗体の孵化する前に <li>を permeabilize し、ブロッキング溶液 2%、0.3% 洗剤 (PBS H T) PBS H にそれらをインキュベートしティッシュ セクションをブロック 4 ° C とその後抗体の孵化を実行で 1 時間ロッカーに NGSPBS-H-T/2% NGS</li>。
	<li>二次培養組織チャンバー内のセクションを PBS-H-T/2% NGS でウサギ抗 FITC 抗体希釈 1: 10,000 を含んでいる井戸に転送します。一晩インキュベートします</li>。
	<li>実行 counterstaining を用いたマウス抗 CD20 抗体希釈 1: 200 PBS-H-T/2% NGS で。必要なら、このオプションのエピトープを取得、細胞に浸透、前述のようにこの培養する前にブロックします</li>。
</ol> 3。3 日目: 第三紀インキュベーション <li>2 番目の培養後 3 回、少なくとも 20 分のための 4 ° C で PBS H 内のセクションを洗う</li> <ol>
	<li>は、蛍光標識抗体 (例えば ヤギ抗うさぎ共役の緑がかった黄色、ヤギ抗ラット共役遠赤色染料、およびヤギ抗マウス共役緑色素抗体希釈 1:5, 000、適切な最終的なインキュベーションを実行します。1:5, 000 と 1:2, 000 PBS-H-T/2% NGS でそれぞれ)。一晩インキュベートします 。
	注: この時点で、孵化の延長が可能 3 日間必要な場合。このインキュ中にスズ箔のプレートをラップすることによって光から保護されたセクションを維持します。マリファナのステップとその後、光消光 fluorophores</li>。
</ol> 4。4 日目: マウント セクション <ol><li>洗浄セクション 3 回で少なくとも 20 分 PBS h 
	注: 下流っぽい 19 の計画、テトラマーと場所で抗体を確保し 5 分 PBS H で二回セクションを洗う 1 h の 4% のパラホルムアルデヒドのセクションを修正します 。
	注意: パラホルムアルデヒドは有毒である;適切な保護具を着用します</li>。
	<li>は、顕微鏡のスライドにセクションを転送するのに絵筆を使用します。あまりにも多くの組織を突くをつけてください。グリセリン/ゼラチン 4 mg/mL n-プロピルガ レートまたは fluorophore 防腐剤が含まれている別のマウント媒体含むで各セクションをコートします。観察でカバーします</li>。
	<li>-20 の光保護スライド容器でスライドを保存する ° c. 組織培養プレートを洗浄し、アルコールを使用して蓋のラベルを削除します 。
	注: プレートは再利用することができます</li>。
</ol> 5。共焦点顕微鏡画像の取得 <ol><li>( 図 1 a と B) 各 fluorophore の適切なレーザーとフィルターを使用して、共焦点顕微鏡を用いた高解像度画像をキャプチャします 。
	注: この例では、共焦点顕微鏡が使用された (材料の表 を参照してください)。画像は、緑がかった黄色標識抗原特異的 T 細胞、グリーン ラベルの CD20 を表現する B 細胞の 10% の電力で 488 nm レーザーまで赤札 CD8 T 細胞の 15% の電力で 640 nm レーザーの 20% の電力で 561 nm のレーザーを使用して収集されました。客観的かつ開口 0.8 X 20 が使用された</li>。
	<li>は、順番に複数の 800 x 800 ピクセル フィールドで 3 つのチャンネルで z-シリーズ 3 μ m (または他の) 間隔を収集します。収集されたフィールドのモンタージュを作成 ( 図 1 -E)。対応するスライドの情報に基づいて各モンタージュ画像を名前を付けて解析します</li>。
	<li>それぞれの共焦点顕微鏡分析・数量化ソフトウェアを使用してまたは ImageJ を用いた定量的画像解析を実行します</li>。
</ol> 6。定量的画像解析 注: 共焦点の顕微鏡分析・数量化ソフトウェアを使用して、定量的画像解析を行うことができますまたは ImageJ ソフトウェアを使用しています。ここでは、ImageJ は例として使用された。
ImageJ の] ウィンドウ ( 図 2 a) にドラッグすることによって <ol><li>オープン共にモンタージュ 。
	注: ImageJ 直接多くの異なる共焦点顕微鏡によって収集されたモンタージュを開くことができます。モンタージュは、ImageJ で直接開くことができません、それを開くには TIFF ファイルとしてエクスポートして選択した z スキャン</li>
	<li>分析のため選択した z スキャンを複製 (&#34; 画像 &#34;-&#62; &#34; を複製する &#34;) ( 図 2 b).</li>
	<li>別のチャンネルに分割 (&#34; 画像 &#34;-&#62; &#34; 色 &#34;-&#62; &#34; チャンネルの分割 &#34;) ( 図 2).</li>
	<li>と押すことによって ROI マネージャーに追加対応するチャネルでの定量分析のための投資収益率の描画 &#34; T &#34; キーボード上。面積を測定します 。
	注: ImageJ の ROI マネージャー μ m 2 ( 図 2 D) の領域を示しています</li>。
	<li>蛍光明るさと分析するチャンネルのコントラスト調整 (&#34; 画像 &#34;-&#62; &#34; 調整 &#34;-&#62; &#34; 明るさ/コントラスト &#34;) ( 図 2 e).</li>
	<li>画像の ROI を平らにする (&#34; ROI マネージャー &#34;-&#62; &#34; フラット &#34;) ( 図 2 f).</li>
	<li>画像で陽性細胞を定量化、&#34; 多点 &#34; ツール ( 図 2).</li>
</ol>

<ol><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li>
<li>Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+Class+II+tetramers+identify+peptide-specific+human+CD4%28%2B%29+T+cells+proliferating+in+response+to+influenza+A+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">MHC Class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenza A antigen.</a> J Clin Invest. 104, R63-R67 (1999).</li>
<li>Steinert, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+memory+CD8+T+cells+reveals+regionalization+of+immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Quantifying memory CD8 T cells reveals regionalization of immunosurveillance.</a> Cell. 161 (4), 737-749 (2015).</li>
<li>Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+In+situ+tetramer+staining+of+antigen-specific+T+cells+in+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues.</a> J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).</li>
<li>Haanen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+virus-+and+tumor-specific+T-cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">In situ detection of virus- and tumor-specific T-cell immunity.</a> Nat Med. 6 (9), 1056-1060 (2000).</li>
<li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18432944">In situ tetramer staining using MHC class I tetramers.</a> J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).</li>
<li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+staining+using+MHC+class+I+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">In situ staining using MHC class I tetramers.</a> Curr Protoc Immunol. 17, 4.1-4.9 (2004).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+HLA-DR%2A08032%2FE7+and+HLA-DR%2A0818%2FE7+tetramers+in+tracking+of+epitope-specific+CD4%2B+T+cells+in+active+and+convalescent+tuberculosis+patients+compared+with+control+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Use of HLA-DR*08032/E7 and HLA-DR*0818/E7 tetramers in tracking of epitope-specific CD4+ T cells in active and convalescent tuberculosis patients compared with control donors.</a> Immunobiology. 216, 947-960 (2011).</li>
<li>Bischof, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+autoreactive+CD4+T+cells+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+after+primary+and+secondary+challenge+using+MHC+class+II+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of autoreactive CD4 T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis after primary and secondary challenge using MHC class II tetramers.</a> J Immunol. 172, 2878-2884 (2004).</li>
<li>Massilamany, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+staining+with+major+histocompatibility+complex+class+II+dextramers+permits+detection+of+antigen-specific%2C+autoreactive+CD4+T+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ.</a> PLoS ONE. 9, e87519(2014).</li>
<li>Massilamany, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+autoreactive+CD4+T+cells+in+brain+and+heart+using+major+histocompatibility+complex+class+II+dextramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In situ detection of autoreactive CD4 T cells in brain and heart using major histocompatibility complex class II dextramers.</a> J Vis Exp. (90), e51679(2014).</li>
<li>Dileepan, T., Kim, H. O., Cleary, P. P., Skinner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Peptide-MHC-II+Tetramer+Staining+of+Antigen-Specific+CD4%2B+T+Cells+in+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">In Situ Peptide-MHC-II Tetramer Staining of Antigen-Specific CD4+ T Cells in Tissues.</a> PLoS ONE. 10 (6), e0128862(2015).</li>
<li>Tjernlund, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+Gag-specific+CD8%2B+cells+in+the+GI+tract+of+SIV+infected+Rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">In situ detection of Gag-specific CD8+ cells in the GI tract of SIV infected Rhesus macaques.</a> Retrovirology. 7, 7-12 (2010).</li>
<li>Connick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTL+fail+to+accumulate+at+sites+of+HIV-1+replication+in+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CTL fail to accumulate at sites of HIV-1 replication in lymphoid tissue.</a> J Immunol. 178, 6975-6983 (2007).</li>
<li>Hong, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0004131">Localized Populations of CD8low/− MHC Class I Tetramer+ SIV-Specific T Cells in Lymphoid Follicles and Genital Epithelium.</a> PLoS ONE. 4 (1), e4131(2009).</li>
<li>Sasikala-Appukuttan, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+and+dynamics+of+the+immunodominant+CD8+T+cell+response+to+SIV%CE%94nef+immunization+and+SIVmac251+vaginal+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Location and dynamics of the immunodominant CD8 T cell response to SIVΔnef immunization and SIVmac251 vaginal challenge.</a> PLoS ONE. 8 (12), e81623(2013).</li>
<li>Connick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+simian+immunodeficiency+virus+replication+within+secondary+lymphoid+tissues+of+rhesus+macaques+is+linked+to+disease+stage+and+inversely+related+to+localization+of+virus-specific+CTL%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of simian immunodeficiency virus replication within secondary lymphoid tissues of rhesus macaques is linked to disease stage and inversely related to localization of virus-specific CTL.</a> J Immunol. 193, 5613-5625 (2014).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antigen-specific+and+infected+cells+in+situ+predicts+outcomes+in+early+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcomes in early viral infection.</a> Science. 323, 1726-1729 (2009).</li>
<li>Li, Q., Skinner, P. J., Duan, L., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+to+simultaneously+visualize+virus-specific+CD8%2B+T+cells+and+virus-infected+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A technique to simultaneously visualize virus-specific CD8+ T cells and virus-infected cells in situ.</a> J Vis Exp. (30), e1561(2009).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simian+immunodeficiency+virus-producing+cells+in+follicles+are+partially+suppressed+by+CD8%2B+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Simian immunodeficiency virus-producing cells in follicles are partially suppressed by CD8+ cells in vivo.</a> J Virol. 90, 11168-11180 (2016).</li>
<li>Daniels, M. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+CD8+in+T+cell+receptor+binding+and+activation+by+peptide%2Fmajor+histocompatibility+complex+multimers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers.</a> J Exp Med. 191, 335-346 (2000).</li>
<li>Lee, Y. J., Wang, H., Starrett, G. J., Phuong, V., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+specific+distribution+of+iNKT+cells+impacts+their+cytokine+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Tissue specific distribution of iNKT cells impacts their cytokine response.</a> Immunity. 43 (3), 566-578 (2015).</li>
<li>Abdelaal, H. M., Kim, H. O., Wagstaff, R., Sawahata, R., Southern, P. J., Skinner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Vibratome+and+Compresstome+sectioning+of+fresh+primate+lymphoid+and+genital+tissues+for+in+situ+MHC-tetramer+and+immunofluorescence+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">Comparison of Vibratome and Compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining.</a> Biol Proced Online. 17, (2015).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

IHC と組み合わせて IST は、検出、特性評価、および他の細胞や組織構造のコンテキストでネイティブ環境での抗原特異的 CD8 T 細胞の定量化のために不可欠なツールを提供します。ここでは、イストの IHC、定量的画像解析に続いての場所、豊富とアカゲザルからリンパ節における抗原特異的 CD8 T 細胞の表現型を決定するために結合用の詳細な手順を説明します。ヒトに応用マウス、またはどの MHC の他の種の組織同様染色することができます-私テトラマーがあります。さらに、ペプチッド MHC クラス II 四量体または dextramer 染色実行できる組織4,5,6,7,における抗原特異的 CD4 T 細胞のラベルに比較的似たような方法論を使用して8,9</su...

T 細胞の検出やウイルス感染細胞を排除すること、自己免疫疾患を防止する抗体と検出し、がん細胞を排除する B 細胞や形質細胞の生産の支援など、多くの免疫学的プロセスに重要です。ペプチド/MHC のクラス I のテトラマー CD8 T 細胞の抗原特異的染色1と MHC クラス II 四量体染色の CD4 T 細胞2のフローサイトメトリーによる最近の開発研究し、理解する当社の能力に革命をもたらしました、T 細胞の免疫生物学。量と抗原特異的 T 細胞の表現型を決定する非常に便利ですが、他の細胞や組織、現在構造に抗原特異的 T 細胞の空間定位の検出でフローサイトメトリーは、します。T 細胞を抽出する分解テクニック必要フローサイトメトリー限られている非リンパ系組織3で有効性。
私たちと他の人は私とクラス II 四量体や多量体試薬ペプチド負荷 MHC のクラスを使用して組織4,5,6,7,抗原特異的 CD8 および CD4 T 細胞を染色する方法を開発しました。8,9,10,11,12,13。 これら IST メソッドの場所、豊富、と組織における抗原特異的 CD8 と CD4 T 細胞の表現型の定量を可能にすると、他の細胞や組織の構造を基準にしてこれらの細胞を検出する手段を提供します。当社グループは、広く MHC を使用います-私四量体でひと免疫不全ウイルス (HIV) - とサル免疫不全ウイルス (SIV) - 染色 HIV と SIV の免疫病態の理解を得るためにリンパ、生殖器、直腸の組織における特定の CD8 T 細胞成功した予防接種戦略14,15,16,17の関連要因を識別します。さらに、組織と生体内でエフェクタ-ターゲット レベルを決定する我々 はもイストを組み合わせたものの in situハイブリダイゼーション (っぽい) をローカライズし、ウイルス特異的 cd8 陽性 T 細胞、ウイルス感染細胞を定量化する技術を開発しました。18,19。
ここでは、用いたペプチド負荷プロトコルについて述べる-私テトラマー IHC を使用して対比染色組織に新鮮な組織切片の抗原特異的 CD8 T 細胞を染色して特定の組織コンパートメントにおける特定の表現型と細胞を定量化します。これらの手順は、李ら、慢性 SIV 感染サル20時、場所、豊富とリンパ組織における SIV 特異的 T 細胞の表現型を決定私たちによる私たちの最近の出版物で使用されたと同じです。
この手順では、新鮮な組織を断面し、ペプチド負荷 MHC で夜通し孵化-私テトラマー共役フルオレセイン チオシアン酸分子 (FITC)。彼らは、パラホルムアルデヒドで固定されます。組織を固定した後は、ウサギ抗 FITC 抗体を使用し、さらにバインドされたテトラマーからの信号を増幅、蛍光タグの抗うさぎ IgG 抗体とインキュベート MHC テトラマーからの信号は増幅されます。IHC は、抗原特異的 T 細胞と周囲の細胞を特徴付ける IST と組み合わせて使用です。細胞外空間、細胞表面上のエピトープを認識する抗体は、テトラマーとプライマリの孵化に含まれます。細胞エピトープを認識する抗体染色前に細胞壁の透過性が必要です。染色組織切片を共焦点顕微鏡を用いたイメージングが行い共焦点ソフトウェアを使用しています。ラベル付きセルは、共焦点顕微鏡によるソフトウェアや ImageJ を用いた定量化しました。どの MHC の本質的に抗原特異的 CD8 T の任意のセルの任意の組織を染色する記述のプロトコルを使用できます-私テトラマーがあります。

<table><tbody><tr><td>MHC-Iモノマー</td><td>NIHテトラマーコア施設</td><td></td><td>MHCテトラマー調製用材料</td></tr><tr><td>ExtrAvidin-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2716</td><td>MHCテトラマー調製用材料</td></tr><tr><td>正常ヤギ血清</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>低融点アガロース</td><td>プロメガ</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>Sigma-アルドリッチ</td><td></td><td></td>SLBL6391V</tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6878</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>J.T.Baker</td><td>4204-05</td><td></td></tr><tr><td>グリセロールゼラチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBH2672V</td><td></td></tr><tr><td>n-propyl galate</td>, <td>Sigma-Aldrich</td><td>P3130</td><td></td></tr><tr><td>rat-a-h-CD8 (1:500)</td><td>Acris</td><td>0714</td><td>抗体 不安定、使い捨て 凍結分注</td></tr><tr><td>m-a-h-CD20 (1:500)</td><td>NOVOCASTRA</td><td>6026819</td><td></td></tr><tr><td>m-a-h-Ki67 (1:500)</td><td>ベクトル</td><td>6022201</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ-a-m-A488 (1:2,000)</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>124083</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ-a-rb-Cy3 (1:5,000)</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>106232</td><td></td></tr>ヤギ-<tr><td>a-ラット-Cy5 (1:5,000)</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>118088</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ-a-h-IgM-Dylight649 (1:5,000)</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>86579</td><td></td></tr><tr><td>圧縮: VF-300 ミクロトー</td><td>ム精密機器、LLC</td><td>1079</td><td></td></tr><tr><td>クイックセット インスタント接着剤</td><td>ロックタイト</td><td>46551</td><td></td></tr><tr><td>24ウェル平底組織培養プレート</td><td>ファルコン</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>Globe scienfitic Inc.</td><td>#1321</td><td></td></tr><tr><td>カミソリ&nbsp;刃</td><td>テッド・ペラ社</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>フェザー使い捨てメス</td><td>FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD.</td><td>No. 21</td><td></td></tr><tr><td>丸型絵筆 #2</td><td>PRINCETON ART &ブラシ(株)</td><td>4350R</td><td>カミソリ</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td>オ<td>リンパス</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>FV10-ASW_Viewer4.0</td><td>オリンパス</td><td></td><td></td></tr>で必要に応じてトリミングできます</tbody></table>

その場でmhc テトラマー染色と場所、豊富と組織における抗原特異的 cd8 陽性 t 細胞の表現型を決定するための定量解析

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

T 細胞の検出やウイルス感染細胞を排除すること、自己免疫疾患を防止する抗体と検出し、がん細胞を排除する B 細胞や形質細胞の生産の支援など、多くの免疫学的プロセスに重要です。フローサイトメトリーで分析した抗原特異的 T 細胞の MHC テトラマー染色の開発研究し、T 細胞の免疫生物学を理解する当社の能力をもたらしました。フローサイトメトリーは、抗原特異的 T 細胞を他の細胞や組織、および現在の分解技術の構造の空間定位を判断できない量と抗原特異的 T 細胞の表現型を決定する非常に便利ですが、T を抽出するセル必要とフローサイトメトリー限られている非リンパ系組織の有効性。その場でMHC テトラマー染色 (IST) は、組織の興味の抗原のために特定が T 細胞を可視化する手法です。免疫組織染色 (IHC) と組み合わせて、IST は、豊かさ、場所、および組織における抗原特異的 CD8 と CD4 T 細胞の表現型を決定できます。ここでは、染色し、特定の組織のコンパートメント内にある特定の表現型を持つ抗原特異的 CD8 T 細胞を列挙するプロトコルについて述べる.これらの手順は、李ら、権利によって我々 の最近の出版物で使用した同じ「卵胞は CD8 によって抑制されます部分的にサル免疫不全ウイルス産生細胞細胞の+ In Vivo。」説明する方法は、彼らは、表現型のローカライズに使用することができ、本質的に、抗原特異的 CD8 T 細胞 MHC テトラマーは任意の組織で利用可能なを定量化に広範に適用されます。

図 1は、共焦点顕微鏡を用いた共焦点画像を収集する方法を示します。図 2は、ImageJ を用いた定量的画像解析を示しています。図 3と4 SIV からリンパ節組織の画像感染アカゲザル MHC テトラマー、CD8 抗体、CD20 抗体で染色代表を示すし、MHC テトラマー染色の特異性を示すためになります。図 3比較 MHC テトラマーをクラス I MHC クラスに染まった私同じ組織からのセクションと比較して SIV からのペプチッドとロード テトラマーを装荷した無関係なペプチド。図 4は、mhc ー SIV テトラマー染色細胞は CD8 抗体が CD20 抗体、B 細胞を染色しない共同染色を示しています。図 5...

ここでは、免疫組織化学的局在、表現型、組織における抗原特異的 T 細胞の量を決定するとその場でMHC テトラマー染色を組み合わせた手法について述べる。このプロトコルは、他のセルの種類および組織の構造を基準にして抗原特異的 CD8 T 細胞の表現型特性を決定する使用です。

その場でMHC テトラマー染色と場所、豊富と組織における抗原特異的 cd8 陽性 T 細胞の表現型を決定するための定量解析

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

この手順の全般的な目的は、標的組織内における抗原特異的CD8陽性T細胞の局在、数、およびフェノタイプを決定することです。本手法は、ほぼあらゆる抗原特異的CD8 T細胞およびあらゆる組織において、その位置の特定、定量化、およびフェノタイプ解析を行う手段を提供することで、CD8 T細胞に関する疑問に迅速に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、標的組織内における他の細胞や構造に対する抗原特異的CD8陽性T細胞の空間的分布を決定できることです。Shengbin Liと共に手順を実演するのは、Gwantwa Mwakalundwaです。手順の1日目に、メスを使用して新鮮な組織を約0.5 x 0.5センチメートルの断片に切断します。ここでは、アカゲザルの脾臓組織を用いて示しています。各組織片をプランジャー上部の中心に個別に接着させ、PBSで調製した温かい4%低融点アガロース 3〜5 mLにサンプルを埋め込みます。プランジャーに該当する組織情報を記載してください。その後、サンプルを冷却ホルダーに入れ、アイスバケットで保管します。アガーが凝固したら、ミクロトームの電源を入れ、厚さを200 micrometersに設定します。新しいカミソリ刃を取り付けた後、プランジャーをミクロトームバスに挿入します。ミクロトームバスに、調製したばかりのPBS-Hを100から200 millilitersまで満たし、温度を0から2 °Cに維持するためにPBS-Hの氷片を加えます。200 µmの切片を得た後、絵筆を用いて各切片の周囲のアガールを除去し、1 mLの冷やしたPBS-Hを含む24ウェル組織培養プレートの各ウェル内の個別の組織チャンバーにサンプルを移します。すべてのサンプルを回収したら、2%通常ヤギ血清を添加したPBS-Hで希釈した、FIT結合ペプチド負荷MHCクラスIテトラマー1 mL中で、4 °Cで揺動させながら組織切片を一晩インキュベートします。翌朝、各組織チャンバーを、1 mLの新鮮で冷やしたPBS-Hを含む新しい24ウェルプレートの各ウェルに移し、20分間静置します。2回目の洗浄後、切片を1 mLの新鮮な4%パラホルムアルデヒドで室温にて2時間固定します。続いて、冷PBS-Hで5分間の洗浄を2回行います。切片を0.01 M尿素を含む新しい24ウェルプレートに移し、尿素が沸騰するまで、1回約10秒間、計3回電子レンジで加熱します。サンプルの透過処理およびブロッキングを行うため、PBS-Hに0.3% Triton X-100界面活性剤と2%正常ヤギ血清を添加したブロッキング溶液中で、切片をロッキングミキサーを用いて4°Cで1時間インキュベートします。インキュベーション終了後、組織チャンバーを、rabbit anti-FITC抗体、mouse anti-human CD抗体、およびrat anti-human CD3抗体を含む溶液1 mLを入れた新しい24ウェルプレートの各ウェルに転送します。サンプルをロッキングしながら4°Cで一晩インキュベートします。3日目に、切片を4°Cの新鮮なPBS-Hで3回（1回あたり少なくとも20分間）洗浄し、適切な蛍光標識二次抗体を用いて、遮光条件下で最大3日間最終インキュベーションを行います。二次抗体のインキュベーション終了後、新鮮なPBS-Hで20分間の洗浄を3回行い、絵筆を用いて各組織チャンバーからサンプルをガラス製顕微鏡スライドに転写します。各切片にフルオロフォア保存剤を添加した封入剤を塗布し、カバーガラスで封入します。その後、スライドを遮光性のスライド容器に入れ、20 °Cで保存します。イメージング当日、最初の一枚のスライドを共焦点顕微鏡のステージに設置し、組織サンプルの標識に使用した各蛍光標識に適したレーザーとフィルターを選択します。20倍対物レンズを使用し、各蛍光チャンネルにおいて、800 x 800ピクセルの複数の視野で、3 µm間隔のzシリーズを順次取得します。次に、収集した視野をモンタージュし、各モンタージュ画像を対応する組織サンプルの名前に基づいて保存します。これらの代表的な画像では、SIVペプチドをロードしたMHCクラスIテトラマーで染色した切片と、無関係なペプチドをロードしたMHCクラスIテトラマーで染色した同一組織の切片を比較しており、テトラマー染色の特異性が示されています。これらの画像において、SIVペプチドをロードしたMHCクラスIテトラマーで染色されたウイルス特異的T細胞は、T細胞サブセットマーカーであるCD8と共染色されていますが、B細胞に発現する細胞表面タンパク質であるCD20とは共染色されていません。このモンタージュは、リンパ節における特定の表現型を持つテトラマー染色細胞および異なる解剖学的区画の定量化に使用された、複数の共焦点zシリーズ視野から作成されました。この拡大画像は、IGM染色によって縁取られたB細胞濾胞を含むリンパ節モンタージュの領域を強調しています。MHCクラスIテトラマー染色細胞（その一部はT細胞活性化および増殖マーカーであるKI67を共発現している）が、B細胞濾胞の内部および外部で検出されます。この染色組み合わせにより、SIV特異的CD8陽性T細胞の活性化および増殖状態に加え、二次リンパ組織内における局在を決定することが可能です。この手法を習熟し、適切に実施すれば、約5日間で完了させることができます。本手順を行う際は、染色の成功には新鮮な組織が不可欠であることを念頭に置くことが重要です。採取後24時間以内にサンプルを処理し、固定まで冷却状態を維持してください。このビデオを視聴することで、目的の組織における抗原特異的CD8陽性T細胞の部位、量、および表現型を決定するためのテトラマー染色および免疫組織化学の手法について、十分な理解を得ることができます。感染性物質の取り扱いは非常に危険であるため、適切な個人用保護具の着用や鋭利物の使用制限など、曝露を防止するための予防策を常に講じて本手順を実施してください。

in-situ-mhc-tetramer-staining-quantitative-analysis-to-determine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

この手順では、精製および抗原特異的CD4 + MHCクラスIIテトラマーを用いて全末梢血とその可視化から、T細胞のin...

抗原特異的CD4 + T細胞はMHCクラスIIテトラマーを用いての可視化

その場テトラマー染色やin situハイブリダイゼーション（ISTH）で組み合わせる手法は可視化、マッピングおよび分析、そのウイルスに感染したターゲットへのウイルス特異的CD8 +...

同時にウイルス特異的CD8 + T細胞やウイルス感染細胞を可視化するテクニックその場で</em

エピトープ特異的T細胞の低周波の集団を区別し、フローサイトメトリーによって、それらを分析するためのMHCテトラマーと磁性マイクロビーズ：このプロトコルは、ペプチドの使用について説明します。この方法は、から対象の内因性T細胞集団の直接調査を可能に...

ペプチドエピトープ特異的T細胞のMHCテトラマーベースの濃縮

主要組織適合性複合体クラスII dextramersとの直接染色により脳及び心臓における自己反応性CD4 T細胞を検出するためのプロトコルは、このレポートに記載されている。総合的な分析のために、 その場での抗原特異的CD4 + T細胞の頻度を列挙するための信頼できる方法も考案されている。...

主要組織適合遺伝子複合体クラスII Dextramersを用いて脳および心臓において自己反応性CD4 T細胞のその場検出に

私たちは、ワクチン接種のマウスモデルにおいて、ナノ粒子による免疫に対する抗原特異的CD8+...

ナノ粒子ワクチン接種後の抗原特異的CD8 + T細胞応答の分析のための全動物イメージングとフローサイトメトリー技術

ここでは、エイズウイルスに対するアカゲザルCD8 + T細胞を列挙し、特徴づけるための最適化されたプロトコルを提示します。この記事では、HIV免疫学の分野にだけでなく、CD8 + T細胞応答が疾患の転帰に影響を与えることが知られている生物医学研究の他の分野のみならず便利です。...

サル免疫不全ウイルス特異的CD8の分析 +ペプチドMHC-I四量体染色によりアカゲザルにおけるT細胞

勉強がん微小環境は免疫療法への臨床応答の予後や予測バイオ マーカーを識別できます。こちらに掲載しては革新的な手法に基づいてその場で蛍光スペクトルを分析し、様々 な集団を自動的に CD8 をカウント+ T...

多重蛍光分析・数量化腫瘍 PD 1+ティム-3+ CD8 の+ T 細胞

ここでは、元のプロトコルを提案生体内抗原特異的 CD8 の定性的検出+ T 細胞。分析は、単一細胞懸濁液の臓器や血液量が少ないからで可能です。広範な研究には、細胞傷害性 T 細胞の反応 (予防接種・癌免疫療法研究)...

反ベクトルと反遺伝子特定 CD8 の同時定量+ T はマイク ウイルスベクターを用いたワクチン後染色テトラマー MHC を介して細胞

このプロトコルの使用を記述する単一のチェーンの MHC のクラス I 人間 cd8 陽性 T 細胞活性化の分子間相互作用を調査する錯体: 世代人工抗原提示単一のチェーンを表現する細胞の構築では、人間 cd8 陽性 T 細胞クローンの文化そして T...

人間 cd8 T 細胞活性化における Co 作動を調査する単一のチェーン MHC 技術の使用

本稿では、チラミドシグナル増幅(TSA)マルチプレックス免疫蛍光法(mIF)と画像解析および空間解析を組み合わせたプロトコルについて説明します。このプロトコルは、実験室で利用可能なスライドスキャナーに応じて、スライドごとに2〜6個の抗原を染色するために、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)セクションで使用できます。...

腫瘍微小環境の臨床的および生物学的評価のための空間画像解析と組み合わせたマルチプレックス免疫蛍光法

このプロトコルは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片におけるタンパク質イメージングマスサイトメトリーによるマルチプレックスmRNA検出の方法論を詳述しています。...

デュアルモダリティ分子地図作成:マルチプレックスmRNA検出とタンパク質イメージングマスサイトメトリーの統合

学ぶその場でMHCテトラマー染色と免疫組織化学を組み合わせた手法により、組織内の抗原特異的CD8陽性T細胞の位置、豊富さ、表現型を定量的に解析する方法です。

その場でMHC テトラマー染色と場所、豊富と組織における抗原特異的 cd8 陽性 T 細胞の表現型を決定するための定量解析

さらに動画を探す