その場でMHC テトラマー染色と場所、豊富と組織における抗原特異的 cd8 陽性 T 細胞の表現型を決定するための定量解析

この手順の全般的な目的は、標的組織内における抗原特異的CD8陽性T細胞の局在、数、およびフェノタイプを決定することです。本手法は、ほぼあらゆる抗原特異的CD8 T細胞およびあらゆる組織において、その位置の特定、定量化、およびフェノタイプ解析を行う手段を提供することで、CD8 T細胞に関する疑問に迅速に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、標的組織内における他の細胞や構造に対する抗原特異的CD8陽性T細胞の空間的分布を決定できることです。

Shengbin Liと共に手順を実演するのは、Gwantwa Mwakalundwaです。手順の1日目に、メスを使用して新鮮な組織を約0.5 x 0.5センチメートルの断片に切断します。ここでは、アカゲザルの脾臓組織を用いて示しています。

各組織片をプランジャー上部の中心に個別に接着させ、PBSで調製した温かい4%低融点アガロース 3〜5 mLにサンプルを埋め込みます。プランジャーに該当する組織情報を記載してください。その後、サンプルを冷却ホルダーに入れ、アイスバケットで保管します。

アガーが凝固したら、ミクロトームの電源を入れ、厚さを200 micrometersに設定します。新しいカミソリ刃を取り付けた後、プランジャーをミクロトームバスに挿入します。ミクロトームバスに、調製したばかりのPBS-Hを100から200 millilitersまで満たし、温度を0から2 °Cに維持するためにPBS-Hの氷片を加えます。

200 µmの切片を得た後、絵筆を用いて各切片の周囲のアガールを除去し、1 mLの冷やしたPBS-Hを含む24ウェル組織培養プレートの各ウェル内の個別の組織チャンバーにサンプルを移します。すべてのサンプルを回収したら、2%通常ヤギ血清を添加したPBS-Hで希釈した、FIT結合ペプチド負荷MHCクラスIテトラマー1 mL中で、4 °Cで揺動させながら組織切片を一晩インキュベートします。翌朝、各組織チャンバーを、1 mLの新鮮で冷やしたPBS-Hを含む新しい24ウェルプレートの各ウェルに移し、20分間静置します。

2回目の洗浄後、切片を1 mLの新鮮な4%パラホルムアルデヒドで室温にて2時間固定します。続いて、冷PBS-Hで5分間の洗浄を2回行います。切片を0.01 M尿素を含む新しい24ウェルプレートに移し、尿素が沸騰するまで、1回約10秒間、計3回電子レンジで加熱します。

サンプルの透過処理およびブロッキングを行うため、PBS-Hに0.3% Triton X-100界面活性剤と2%正常ヤギ血清を添加したブロッキング溶液中で、切片をロッキングミキサーを用いて4°Cで1時間インキュベートします。インキュベーション終了後、組織チャンバーを、rabbit anti-FITC抗体、mouse anti-human CD抗体、およびrat anti-human CD3抗体を含む溶液1 mLを入れた新しい24ウェルプレートの各ウェルに転送します。サンプルをロッキングしながら4°Cで一晩インキュベートします。

3日目に、切片を4°Cの新鮮なPBS-Hで3回（1回あたり少なくとも20分間）洗浄し、適切な蛍光標識二次抗体を用いて、遮光条件下で最大3日間最終インキュベーションを行います。二次抗体のインキュベーション終了後、新鮮なPBS-Hで20分間の洗浄を3回行い、絵筆を用いて各組織チャンバーからサンプルをガラス製顕微鏡スライドに転写します。各切片にフルオロフォア保存剤を添加した封入剤を塗布し、カバーガラスで封入します。

その後、スライドを遮光性のスライド容器に入れ、20 °Cで保存します。イメージング当日、最初の一枚のスライドを共焦点顕微鏡のステージに設置し、組織サンプルの標識に使用した各蛍光標識に適したレーザーとフィルターを選択します。20倍対物レンズを使用し、各蛍光チャンネルにおいて、800 x 800ピクセルの複数の視野で、3 µm間隔のzシリーズを順次取得します。

次に、収集した視野をモンタージュし、各モンタージュ画像を対応する組織サンプルの名前に基づいて保存します。これらの代表的な画像では、SIVペプチドをロードしたMHCクラスIテトラマーで染色した切片と、無関係なペプチドをロードしたMHCクラスIテトラマーで染色した同一組織の切片を比較しており、テトラマー染色の特異性が示されています。これらの画像において、SIVペプチドをロードしたMHCクラスIテトラマーで染色されたウイルス特異的T細胞は、T細胞サブセットマーカーであるCD8と共染色されていますが、B細胞に発現する細胞表面タンパク質であるCD20とは共染色されていません。

このモンタージュは、リンパ節における特定の表現型を持つテトラマー染色細胞および異なる解剖学的区画の定量化に使用された、複数の共焦点zシリーズ視野から作成されました。この拡大画像は、IGM染色によって縁取られたB細胞濾胞を含むリンパ節モンタージュの領域を強調しています。MHCクラスIテトラマー染色細胞（その一部はT細胞活性化および増殖マーカーであるKI67を共発現している）が、B細胞濾胞の内部および外部で検出されます。

この染色組み合わせにより、SIV特異的CD8陽性T細胞の活性化および増殖状態に加え、二次リンパ組織内における局在を決定することが可能です。この手法を習熟し、適切に実施すれば、約5日間で完了させることができます。本手順を行う際は、染色の成功には新鮮な組織が不可欠であることを念頭に置くことが重要です。

採取後24時間以内にサンプルを処理し、固定まで冷却状態を維持してください。このビデオを視聴することで、目的の組織における抗原特異的CD8陽性T細胞の部位、量、および表現型を決定するためのテトラマー染色および免疫組織化学の手法について、十分な理解を得ることができます。感染性物質の取り扱いは非常に危険であるため、適切な個人用保護具の着用や鋭利物の使用制限など、曝露を防止するための予防策を常に講じて本手順を実施してください。