水生動物使用グループ固有の rDNA プライマーの遺伝的腸内容分析の研究プロトコル

このプロトコルの全体的な目標は、特にフィールドサンプルからの栄養生態学の調査を改善することです。この方法は、侵入種が栄養相互作用に与える影響など、食物網生態学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。主な利点は、まったく同じ標本の栄養分析を統合することにより多くの時間を追加で適用できることと、事実上すべての生態学者が適用できることです。

このアプローチは、水生消費者の獲物の消費に関する洞察を提供するために確立されましたが、底生大型無脊椎動物サンプル内の種組成を決定するなど、他の目的にも適用できます。その手順を実演するのは、当研究室の技術者であるChristian Sodemannです。この実験を開始するには、以前に解剖した捕食者の胃腸管を、440マイクロリットルの塩抽出バッファーを含む2ミリリットルのセーフロック反応チューブに移します。

DNA抽出まで、サンプルを摂氏マイナス20度ですぐに凍結します。フリーザーからサンプルを取り出した後、鉗子を使用して各サンプルチューブに5ミリリットルのステンレス鋼ビーズを1つずつ追加してDNA抽出を開始し、サンプルを室温でベンチに置いて解凍します。ビーズミルを使用して、サンプルを15ヘルツで1分間均質化します。

サンプルをまもなくスピンダウンした後、90マイクロリットルの10%SDSと5マイクロリットルの10ミリグラム/ミリリットルのプロテイナーゼKをサンプルに加えます。次に、サンプルを十分にボルテックスし、ThermoMixerで400rpmで1時間絶えず振とうしながら、摂氏60度でインキュベートします。溶解をさらに促進するには、このインキュベーション中に10分ごとにサンプルをボルテックスします。

短い遠心分離スピンの後、350マイクロリットルの5モル塩化ナトリウムをサンプルにピペットで移します。30秒から1分間ボルテックスして、サンプルを完全に混合します。次いで、5°Cで16,200倍gを40分間遠心分離する。

したがって、遠心分離機からサンプルを取り出す際に最も重要なことの1つは、ビーズが移動して、ステップで除去する必要があるすべての粒子を含むペレットを乱さないようにすることです。次に、ペレットを乱さないようにしながら、約600マイクロリットルの上清を新しい1.5ミリリットルのチューブに慎重に移します。600マイクロリットルの氷冷イソプロパノールを追加し、チューブを数回慎重に反転させます。

マイナス20°Cで一晩保管してください。サンプルを冷凍庫から取り出した後、室温で16、200倍gで20分間遠心分離します。ペレットを失わないように注意しながら上澄みを捨て、ティッシュペーパーを使用してチューブを慎重に乾かします。

これらのDNA含有ペレットを200マイクロリットルの70%氷冷エタノールを加え、次いで室温で16,200倍gで10分間遠心分離することによって洗浄する。上清は注意して捨て、糸くずの出ないティッシュペーパーを使用してチューブを慎重に乾かします。最後に、8マイクロリットルに調整された10マイクロリットルのピペットを使用して、ペレットを乱さないように、残りの上澄みを慎重に取り除きます。

すべてのエタノールが蒸発するまでペレットを乾燥させます。次に、50〜100マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を加え、短時間渦巻き、摂氏4度で一晩放置してペレットを溶解します。ここで抽出したDNAサンプルの機能効率を検証するには、それぞれの食品源に適したユニバーサルプライマーセットを使用して、それぞれをPCRでテストします。

まず、プライマー、dNTPミックス、反応バッファー、Taq DNAポリメラーゼ、精製水を1.5または2.5ミリリットルの反応チューブに加え、標準反応混合物をボルテックスします。次に、各DNAサンプルについて、対応するDNA抽出物1マイクロリットルをPCRプレート内の標準反応混合物9マイクロリットルに移します。プレートを閉じ、サーモサイクラーに入れてPCRプログラムを開始します。

PCR反応が終了したら、ミニ遠心分離機のショートランオプションを使用してPCR産物をスピンダウンします。次に、各PCR産物の3マイクロリットルを、6回ローディング色素の1マイクロリットルと混合します。これらのサンプルを、あらかじめ調製したアガロースゲルのゲルスロットにロードします。

100塩基対のDNAラダー1.5マイクロリットルをゲルの1つのスロットにサイズ標準としてロードします。電気泳動ユニットの蓋を閉め、電源に接続し、ゲルを100ボルト/センチメートルで35分間泳動します。電気泳動の実行後、ゲルを取り出し、事前に調製した染色槽に約10分間入れます。

最後に、ゲルを染色槽から取り出し、ゲルドキュメンテーションシステムの上に置き、マニュアルに従って視覚化します。捕食者の腸内容物を分析するには、事前に調製したDNA抽出物の作業溶液を使用します。16種類の獲物群特異的プライマーセットのそれぞれについて、別々のPCR反応を行います。

それぞれの獲物グループに属する標本由来のDNAを用いたポジティブコントロール1つと、捕食者種由来のDNAを用いたネガティブコントロール1つを含めます。各PCRプレート内のサンプルの割り当てを正確に文書化することは、割り当てシーケンサーの検出のためにシーケンシングプレートにサンプルをロードする際に異なるサンプルをプールし、最終的に消費者に誤った結果を割り当てることを避けるために重要です。次に、前述したのと同じプロトコールを使用してPCR反応を実行し、使用する各プライマーセットの特定のアニーリング温度とサイクル数に調整します。

これらのPCR反応で増幅されたフラグメントを検出するには、AとBの2つのバッチで自動フラグメント分析を実行し、サンプルローディング溶液(SLS)を含む混合物と、各バッチのそれぞれのサイズ標準を調製します。次に、それぞれのバッチに属する8つのPCR反応液のうち、以前に凍結したPCR産物を解凍し、それらが暗所に保管されていることを確認します。ミニ遠心分離機のショートランオプションを使用して、それらをスピンダウンします。

シーケンシングプレート上に、分析するサンプルの数に対応するウェルの数だけ、各サンプルのそれぞれのSLSサイズの標準混合物の22マイクロリットルをロードします。次に、8つのPCR反応のそれぞれについて1マイクロリットルのPCR産物をプレートのそれぞれのウェルにロードします。次に、ミニプレート遠心分離機のショートランオプションを使用して、この混合物を慎重にスピンダウンします。

その後、各ウェルを1滴の鉱油で覆います。次に、バッファープレートの反応ウェルに250〜300マイクロリットルのDNA分離バッファーを充填します。キャピラリーシーケンサーソフトウェアを使用して、製造元の指示に従ってサンプルセットアップを作成します。

サンプルセットアップ内のサンプルの割り当てがシーケンシングプレートのサンプルの割り当てと一致していること、およびサンプルセットアップにそれぞれのバッチの処理に適したメソッドが含まれていることを確認してください。結果の解析では、各サンプルのエレクトロフェログラムを目視で再確認し、マーカープライマーセットごとに呼び出された各ピークを個別に確認/未確認し、マーカープライマーセットの基準に適合する未呼び出しのピークを手動で挿入したり、間違ったピークを削除したりすることが重要です。このプロトコルで実施されたPCR分析のために確立されたグループ特異的プライマーセットの有効性を決定するための摂食実験を行った後、捕食者の胃腸管からのDNAを使用したPCR結果を、アガロースゲル電気泳動および一本鎖立体立体多型(SSCP)を使用して分析しました。

アガロースゲル電気泳動により、研究対象とは異なる獲物種間で区別できなかった二本鎖DNAの単一バンドが明らかになりました。それとは対照的に、SSCP電気泳動は、腸内容物サンプルと参照サンプルを比較することにより、異なる獲物種を区別することに成功しました。摂食実験後にミズダニの腸から抽出したDNAを、獲物を摂取した後のさまざまな期間で配列決定しました。

摂食後1時間から50時間後までの間に、検出された獲物DNAの相対量は大幅に減少しました。侵襲性端脚類であるDikerogammarus villosus gutから抽出されたDNAは、このプロトコルに記載されている16のグループ特異的プライマーセットを使用して、大型無脊椎動物の獲物DNAについてテストされました。D.villosusの腸内含有量のうち、対象となった16の獲物分類群のいずれかに属するDNAが陽性であったのはわずか16%でした。

さらに、試験した12の獲物分類群のDNAが少なくとも1つのサンプルで検出されましたが、4つの分類群のDNAは検出されませんでした。この手順を試行する際は、使用するプライマーがシステム内の分類群に特異的であることを確認することを忘れないでください。このビデオを見た後、研究室内で日常的に使用されている方法を遺伝子解析で補完することにより、栄養相互作用に関する研究を拡大する方法を十分に理解できるはずです。