Name: 水生動物使用グループ固有の rDNA プライマーの遺伝的腸内容分析の研究プロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-05T12:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: 学ぶ遺伝的腸内容分析による水生動物の食性生態学調査法。Dikerogammarus villosusなどの捕食者胃腸管からDNA抽出し、群特異的rDNAプライマーで獲物を同定する。侵入種の生態影響評価に有用です。

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研究所からシルクはクラッセンは、生態系の解析と評価 (ガイアウッド)、このプロトコルで使用されるグループ特定のプライマー セットの確立で彼女の援助のため RWTH Aachen を感謝いたします。我々 はまたミズダニの実験でピーター ・ マーティンと協力のキール大学からローラ Schynawa をありがとうございます。スムーズに実行し、企業とのカタログ番号の登録の準備のラボの維持の技術研究室助手を感謝いたします。この作品は、ドイツ研究振興協会 (DFG; プロジェクト GE 2219/3-1) によって支えられました。

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ここでは、簡単かつコスト効率の高い PCR に基づく同じ標本の他の非分子分析と組み合わせることができます rDNA 領域のグループ固有プライマーを介してフィールド サンプルから捕食者-被食者相互作用の決定法を提案する.ただし、プロトコルの中でいくつかの重要な手順があります。まず、使用されるプライマーの特異性を保証することは不可欠です。第二に、それは胃腸管の準備、その後の DNA の抽出の間に汚染や腸のコンテンツの材料の損失を避けるために重要です。クロス サンプルの汚染は、獲物の DNA の誤検出につながることができます、腸の材料はほとんど行方不明につながる可能性がありますコンテンツの損失は餌種を消費しました。それぞれのサブユニットと解析 (プロトコルのセクション 2) 用のテンプレートの機能の効率に属する rDNA の存在の検証は、摂餌量に関する代表的な情報の収集に不可欠です。これは、特に消費者を餌になって捕食グループの DNA が検出された25,27できますない場合、非常に重要です。さらに、Pcr (ステップ 3.1、...

栄養相互作用と食物網動態の大半を占める捕食者-被食者の相互作用、物質と食物網内および生態学の主要な目標の 1 つである生態系間を通してエネルギーのフラックスを特徴付ける重要な側面1。 ソースの決意と炭素と栄養素の流れは生態系2間の生態的結合の理解を促進します。ただし、有機物および栄養素のフラックスも生物3の動きには、川などの流域の生態系はだけはリンクされません。したがって、これらのシステムをリンクしているリソースの流れを中断する生息地の変化強く変更できます両方生態系の食物網だけでなく直接、また、間接的捕食者-被食者コミュニティのそれぞれの構成を変更することによって。たとえば、単一の捕食者の種 (例えばニジマス)4の動きにリンクする食物網の変化が示されています。このような変更は潜在的生物多様性と水界生態系の機能を脅かします。したがって、フィールドにおける捕食者-被食者の相互作用の分析水生生態系のネイティブの生物多様性、水管理など、人為的な環境変化の影響を判断することが不可欠です。
栄養連携を追跡は複雑なシステムで難しいので、フィールド5の相互作用の評価を有効にするいくつかのアプローチを確立されています。従来、供給分野における相互作用の調査は切り裂かれた根性のままに獲物の視覚的な識別に基づいています、獲物の形態学的多様性に関する広範な知識を必要とします。視覚的腸内容分析は消費者 (例えばの季節変動ダイエット ロブスター6魚7,8または餌の好みのカイアシ類) のいくつかのグループのリソースの使用に洞察力を提供しています。ただし、消化の物理的なプロセスは visual 腸内容分析を困難、通常柔らかい bodied 獲物生物9をミスします。種の液体摂取によって餌または集中的に摂取、ヨコエビ類のような前に餌を comminute いくつかの無脊椎動物の消費者のため消化管内容物の餌種の視覚的な識別は不可能10です。これらの制限のための分子解析は、有望な代替手段を提供します。
分子解析は、消化管内容物の迅速かつ的確な獲物の検出を許可する一般的なツールとなっています。このような技術の範囲は多様な: モノクローナル抗体またはポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) に基づく戦略頻繁にされる、彼らの高い特異性と感度11のため。新しいモノクローナル抗体の開発は時間とコストがかかる、抗体が11を既に存在しない場合したがって、他の分子技術の応用はより便利です。デオキシリボ核酸 (DNA) のように普遍的なプライマーを使用して、ほとんどの種で現在の ribosomal リボ核酸 (RNA) 遺伝子の領域の増幅は12,13を設定する一般的な方法です。この手法を使用して、頻繁にしない DNA14の混在のソース内の餌生物の全範囲を特定することが可能です。このような欠点を避けるために効果的な方法は、グループ特定のプライマーを使用する遺伝的腸内容分析の設定です。特定のターゲット グループの DNA 領域だけを増幅し、すべて他種15,16を除外するように設計、グループ特定のプライマーはせず指定したグループの分類学的レベルの餌生物の同定を有効にします。時間とコストのかかる二次分析。ただし、すべての腸の内容分析のようなそのような分析は摂食行動のスナップショットのみを提供します。したがって、自然なトレーサーの時間統合 (例えば、安定同位体) の解析と分子腸内容分析を組み合わせると、有益な1,2と見なされます。
ここでは、PCR に基づく調査核リボソーム DNA (rDNA) 領域のグループ特定のプライマー セットを使用した同じ試料の安定同位体比分析と組み合わせること捕食者-被食者の相互作用の詳細な方法について述べる。Agarose のゲルの電気泳動で単一獲物グループの DNA の検出について述べる。また、プライマーの特異性より高い分類の解像度が必要なときに該当するようなグループ固有プライマーの PCR 産物のさらに下流解析のための機会を紹介します。単一鎖 DNA (ssDNA) フラグメント フォーム第三構造の一次配列17によって決定される、ためこのようなグループに固有のプライマーによって増幅断片の小さな変化は構造変化に します。このような変更は、ポリアクリルアミドゲル17,18, (種レベル) の摂餌生態のより正確な識別を有効にすると一本鎖コンフォメーション sscp 解析によって検出できます。
Agarose のゲルの電気泳動は DNA のフラグメントを視覚化し、おおよその長さ19、解像度を決定する一般的で安価なツールは DNA の量に依存し、染色染料使用20。通常、可視化はまっすぐ進む純粋な DNA のサンプルを使用する場合、獲物の少ない潜在的消費者の消化管内容物の DNA、agarose のゲルの電気泳動の結果の得点が複雑に。まだ、この検出方法は画面の 1 つのフィールドから消費者の標本数が少ないことは不可能またはいくつか獲物のグループが、得点の合併症なりますサンプル数が高いスクリーニング複数獲物イチイは非常に時間の集中的なとこの実行不可能。高感度の検出法は、さらにフラグメント21の正確な長さの定量を可能にするキャピラリー電気泳動によるフラグメントの自動分析です。ラベルとして異なった蛍光染料を使用して、検出および自動フラグメント解析22,23で対等な長さのさまざまな断片を判断をすることが可能があることいくつかのマイクロ サテライトによる研究を示した 24。したがって、また提案する複数の獲物から DNA の並列検出のための詳しいプロトコル ラベル グループ特定のプライマー セットと自動シーケンサーによる自動フラグメント解析による検出 PCR を使用してグループ。さらに、自動化されたフラグメント解析による獲物の DNA の検出がまた摂取した獲物の相対的な定量化を可能にするアプローチであることを示す事例から結果を報告する.

<table><tbody><tr><td>液体窒素</td><td>NA</td><td></td><td>大型無脊椎動物のフィールドサンプルを研究室に輸送するため。</td></tr><tr><td>1.5 ml反応チューブ - セーフロック</td><td>Any</td><td>NA</td><td>現場での消費者検体の採取とその後の液体窒素反応チューブの保存のために、必ずしもPCRクリーンである必要はありません。チューブの爆発を防ぐために、チューブの蓋に針で穴を開ける必要があります。</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>任意の</td><td>NA</td><td>倍率が関心のある消費者のサイズの胃腸管を準備するのに適していることを確認してください。</td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>任意の</td><td>NA</td><td>ステレオマイクロスコープの下で消費者標本の胃腸管を解剖します。</td></tr><tr><td>ステンレス製フォーセップ:デュモン鉗子No.7</td><td>バイオフォーム</td><td>B40d</td><td>この湾曲したステンレス製鉗子は、胃腸管に穴を開けることなく、湾曲した部分の間に固定された標本を保持するために非常にヘリフルな場合があります。</td></tr><tr><td>ステンレス製フォーセップ:デュモン鉗子 電子5号バイオ</td><td>フォーム</td><td>B40b</td><td>この微細なステンレス製鉗子は、消費者検体の胃腸管の調製に最適です。</td></tr><tr><td>DNA-ExitusPlus</td><td>AppliChem</td><td>A7409,1000RF</td><td>DNAおよびRNA汚染除去のための除染ソリューション</td></tr><tr><td>ファズフリーペーパータオル</td><td>任意の</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ラボスケール</td><td>任意の</td><td>NA</td><td>精度は少なくとも0.01gである必要があります。</td></tr><tr><td>マイクロリットルピペット(0.5-10 / 10-100 / 50-200 / 100-1000 &mu;L)</td><td>Any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Tubes 2.0 ml</td><td>VWR</td><td>211-2165</td><td>これらの反応チューブには、DNA、DNase、RNase、PCR阻害剤が含まれていないことが重要です(PCRクリーン)!</td></tr><tr><td>セーフロックチューブ 1.5ml</td><td>VWR</td><td>211-2164</td><td>これらの反応チューブには、DNA、DNase、RNase、PCR阻害剤が含まれていないことが重要です(PCRクリーン)!</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム &ge;99.5%, p.a., ACS, ISO</td><td>carlroth</td><td>3957.3</td><td>DNAの抽出に必要な塩抽出バッファー(SEB)および5M NaCl溶液用。</td></tr><tr><td>トリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン トリス</td><td>・カールロス</td><td>4855.2</td><td>塩抽出緩衝液(SEB)およびTBE緩衝液</td></tr><tr><td>マイクロリットルピペット(0.5-10/10-100/50-200/100-1000 &mu;L)</td><td>carlroth</td><td>8043.1</td><td>塩抽出バッファー (SEB) および TBE バッファー</td></tr><tr><td>用 ホウ酸 &ge;99.8 %、p.a.、ACS、ISO</td><td>carlroth</td><td>6943.2</td><td>TBEバッファ用。市販のTBEバッファーが得られた場合は不要です。</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)</td><td>carlroth</td><td>4360.1</td> DNA<td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼKlyophilの抽出用。</td><td>carlroth</td><td>7528.1</td><td>10 mg / mlを含む作業溶液を準備します。</td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>Quiagen</td><td>85300</td><td>サンプルの均質化のためのビーズミル。</td></tr><tr><td>ステンレス鋼ビーズ、5 mm</td><td>Quiagen</td><td>69989</td><td>サンプルの均質化用。</td></tr><tr><td>加熱サーモシェーカー</td><td>任意の</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>任意の</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>冷蔵遠心分離機:himac CT 15 RE</td><td>日立</td><td>NA</td><td>DNAの抽出中の遠心分離に使用される冷蔵遠心分離機(プロトコル1)。</td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>カールロス</td><td>6752.5</td><td></td></tr><tr><td>エタノール99.8%、p.a.</td><td>NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水 分子生物学グレード (ddH2O)</td><td>AppliChem</td><td>A7398,1000</td><td>ヌクレアーゼフリー (ストリーム滅菌およびDEPC処理済み) DNAの再懸濁に使用され、原稿内でddH2Oを参照する場合は常に、</td></tr><tr><td>未修飾オレゴヌクレオチド、</td><td>ユーロフィン、MWG、オペロン</td><td>NA</td><td>プライマー、非標識</td></tr><tr><td>、修飾オレゴヌクレオチド</td><td>Metabion International AG</td><td>NA</td><td>プライマー ラベル付き</td></tr><tr><td>peqGOLD Taq オールインクルーシブ</td><td>VWR Peqlab</td><td>01-1000</td><td>Taq オールインクルーシブ PCR 反応混合物 (反応バッファー Y および S、dNTP および MgCl2)</td></tr><tr><td>Primus 96 アドバンスドグラジエントサーモサイクラーまたは peqStar96x ユニバーサルグラジエント</td><td>Peqlab</td><td>NA</td><td>プライマーセットは、もともとPrimus 96アドバンスドグラジエントサーモサイクラーで確立されました。このサイクラーはかなり古いものだったので、peqSta96x(古いモデルをシミュレートすることも可能)を使用して、同じ条件下でプライマーセットが効率的で特異的であるかどうかを確認しました。しかし、テストでは、古いマシンのシミュレーションを使用せずに、プライマーが良好に機能し、依然として特異的であることが示されました(Koester et al.2013を参照)。</td></tr><tr><td>標準96ウェルPCRプレート</td><td>VWR Peqlab</td><td>732-2879</td><td>PCR反応に使用されます。</td></tr><tr><td>ロープロファイルチューブストライプ 0.15ml フラットキャップストライプ付き</td><td>VWR Peqlab</td><td>732-3223</td><td>PCRプレートを閉じるために使用されるキャップストライプ。</td></tr><tr><td>アガロース</td><td>Peqlab</td><td>35-1020</td><td>ゲル電気泳動に使用されます。</td></tr><tr><td>マイクロ波</td><td>任意の</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>コニカルフラスコ</td><td>任意の</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>測定シリンダー</td><td>任意の</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>水平電気泳動ユニットと歯付きそれぞれのコーム</td><td>任意の</td><td>NA</td><td>アガロースゲル電気泳動用。</td></tr><tr><td>電気泳動電源 PS3002</td><td>Life Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide solution 1 %</td><td>carlroth</td><td>2218.1</td><td>アガロースゲルの染色浴の調製に使用されます。</td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>カールロス</td><td>6749.1SSCP</td><td>分析用の変性バッファーに必要です。</td></tr><tr><td>ブロムフェノールブルー</td><td>AppliChem</td><td>A3640.0010</td><td>アガロースゲル電気泳動用のローディング色素に必要です。</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>カールロス</td><td>4621.1</td><td>アガロースゲル電気泳動用のローディング色素に必要です。</td></tr><tr><td>100 bp-DNA-Ladder extended</td><td>carlroth</td><td>T835.1</td><td>アガロースゲル電気泳動のサイズ標準として。</td></tr><tr><td>UVドキュメンテーションシステム</td><td>Any</td><td>NA</td><td>ゲル電気泳動の結果を可視化します。</td></tr><tr><td>ロチフォア NF-アクリルアミド/ビス溶液 40 % (29:1)</td> <td>carlroth</td><td>A121.1</td><td>ポリアクリルアミドゲルの調製用。</td></tr><tr><td>ペルオキシ二硫酸アンモ</td>ニウム <td>carlroth</td><td>9592.2</td><td>ポリアクリルアミドゲルの調製用。</td></tr><tr><td>フォールドバッククリップ(32mm)</td><td>任意の</td><td>NA</td><td>ポリアクリルアミドゲルの調製用。</td></tr><tr><td>正方形のプラスチックボックス(21 &times; 6.5 &times; 5 cm)</td><td>任意の</td><td>NA</td><td>ポリアクリルアミドゲルの調製用。</td></tr><tr><td>テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)</td><td>carlroth</td><td>23.67.1</td>ポリ<td>アクリルアミドゲルの調製用。</td></tr><tr><td>ビーカー</td><td>Any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>RC 10 デジタルチラー</td><td>VWR</td><td>462-0138</td><td>ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用したSSCP分析用。</td></tr><tr><td>縦型電気泳動ユニット P10DS (OWL Separation Systems)</td><td>VWR</td><td>700-2361</td><td>ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたSSCP分析用。</td></tr><tr><td>ノッチ付きガラスプレート</td><td>VWR</td><td>730-0261</td><td>ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたSSCP分析用。</td></tr><tr><td>ブランクガラスプレート</td><td>VWR</td><td>730-0260</td><td>ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたSSCP分析用。</td></tr><tr><td>スペーサー</td><td>VWR</td><td>730-0262</td><td>ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたSSCP分析用。</td></tr><tr><td>25歯のコーム</td><td>VWR</td><td>730-0294</td><td>ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたSSCP分析用。</td></tr><tr><td>振とうプラットフォーム</td><td>Any</td><td>NA</td><td>染色浴の絶え間ない振とうに。</td></tr><tr><td>GelStar核酸染色剤(ロンザ・ロックランド社)</td><td>Biozym</td><td>850535 (50535)</td><td>ポリアクリルアミドゲルの染色用。</td></tr><tr><td>GenomeLab DNAサイズ スタンダードキット 400bp</td><td>AB Sciex</td><td>608098</td><td>自動フラグメント解析用。バッチBのサイズ標準。</td></tr><tr><td>GenomeLab DNAサイズ スタンダードキット 600bp</td><td>AB Sciex</td><td>608095</td><td>自動フラグメント解析用。バッチAのサイズ標準。</td></tr><tr><td>サンプルローディングソリューション(SLS)</td><td>AB Sciex</td><td>608082</td><td>自動フラグメント分析用。</td></tr><tr><td>シークエンツィングプレート - 96ウェルポリプロピレンPCRマイクロプレート</td><td>Costar</td><td>6551</td><td>自動フラグメント分析用。</td></tr><tr><td>プレート式遠心分離機、PerfectSpin P</td><td>VWR Peqlab</td><td>NA</td><td>ミニプレート遠心分離機で、PCR産物のスピンダウンに使用されます。</td></tr><tr><td>バッファープレート - 96ウェル EIA/RIA 透明 平底ポリスチレン未処理 マイクロプレート</td><td>コーニング</td><td>9017</td><td>自動フラグメント分析用。</td></tr><tr><td>GenomeLab Seperation buffer</td><td>AB Sciex</td><td>608012</td><td>自動フラグメント解析用。</td></tr><tr><td>分離ゲル - LPAI</td><td>AB Sciex</td><td>608010</td><td>自動フラグメント分析用。</td></tr><tr><td>Sequenzer - CEQ8000 Genetic Analysis System</td><td>ベックマン・コールターNA</td><td></td><td>自動フラグメント解析用。</td></tr><tr><td>GeneMarker V1.95</td><td>Softgenetics</td><td>NA</td><td>自動フラグメント解析結果を解析します。</td></tr></tbody></table>

水生動物使用グループ固有の rdna プライマーの遺伝的腸内容分析の研究プロトコル

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

食物網の分析は、生態系の理解を深めるために不可欠です。たとえば、食物網の相互作用は、非在来種の侵入によって引き起こされる深刻な変更を受けることができます。ただし、フィールドの捕食者-被食者相互作用の正確な同定は多くの場合困難であります。これらの分析は、腸内容の視覚的評価や安定同位体比 (δ15N そして δ13C) の分析にしばしば基づいています。形態学上の多様性や捕食生物の正確な同定の障害につながる、個々 の餌生物から同位体署名このようなメソッドは、それぞれ、包括的な知識を必要です。浸軟、経口摂取と餌生物の消化によって特定の種の同定困難ため visual 腸内容分析は特に柔らかい bodied 餌生物を過小評価します。したがって、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) による戦略、たとえばグループ特定のプライマー セットを使用、食物網の相互作用の調査のための強力なツールを提供します。ここでは、核リボソーム デオキシリボ核酸 (rDNA) のグループ特定のプライマー セットを使用してフィールドから消費者を昆虫の消化管内容物を調査するための詳しいプロトコルについて述べる。DNA がすることができます (小分類) の場合全体の標本から抽出またはフィールドの標本の消化管内容物から。存在と DNA のテンプレートの機能の効率テスト個人から直接確認する必要がある普遍的なプライマーを用いた DNA のそれぞれのサブユニットをターゲットに設定します。また、ポリアクリルアミドのゲルを使用して後続の一本鎖コンフォメーション sscp 解析と変更されていないグループ固有のプライマーと PCR によって種レベルまでさらに組み合わせて消費獲物を定めることができることを示します。さらに、ラベルとして異なった蛍光染料の使用できる並列スクリーニング自動化されたフラグメント解析による複数の腸コンテンツ サンプルから別の獲物グループの DNA のフラグメントを示す.

正常に、このプロトコルの異なる研究内食事分析で説明されている手順を使用しました。このセクションでは、プロトコルのさまざまなセクションの適用を記述する例を示す.
例として、著者28と SSCP 解析による PCR 産物のさらに下流解析の可能性によって確立されたグループ特定のプライマー セットの有効性を示す、給餌実験が実施されました。Dikerogammarus villosusの捕食者と獲物としてCaenis属幼虫の個体はライン川、背水のカールスルーエ (ドイツ) の近くで捕獲されました。研究室では、捕食者と獲物のイチイは 20 ° C でフィルター処理された河川水で別々 に保管された、36 時間に飢えていた。実験のため端脚類標本は、フィルター選択されたストリーム水 (100 mL)、個別にうんざりして、30 分間 2 〜 3 Caenis幼虫と、液体窒...

動物の最も一般的な腸内容の分析は、視覚的な。餌生物の形態の多様性についての強烈な知識を必要とする、彼ら柔らかい bodied 獲物を逃すし、獲物の強力な粉砕により、ヨコエビ類を含むいくつかの生物はほぼ不可能。昆虫の詳細な斬新な遺伝的アプローチ獲物ヨコエビの国会で身分証明書を提供します。

水生動物使用グループ固有の rDNA プライマーの遺伝的腸内容分析の研究プロトコル

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

本プロトコルの全体的な目的は、特にフィールドサンプルを用いた栄養生態学的な調査を改善することです。この手法は、外来種が栄養相互作用に与える影響など、食物網生態学の分野における重要な疑問への回答に寄与します。主な利点は、全く同一の個体を用いて、より長い時間を統合した栄養分析に追加的に適用できること、そして事実上あらゆる生態学者が適用可能であることです。この手法は水生消費者の餌消費に関する知見を得るために確立されましたが、例えば底生大型無脊椎動物サンプルの種組成を決定するなど、他の目的にも適用可能です。本手順のデモンストレーションは、当研究室の技術者であるChristian Sodemannが行います。まず、あらかじめ摘出した捕食者の胃腸管を、440 µLの塩抽出バッファーを含む2 mLのセーフロック反応チューブに移します。DNA抽出まで、サンプルを直ちに-20°Cで冷凍保存します。フリーザーからサンプルを取り出した後、ピンセットを用いて各サンプルチューブに5mLのステンレス製ビーズを1個ずつ加え、室温のベンチ上で解凍します。ビーズミルを使用し、15 Hzで1分間サンプルを均質化します。サンプルを短時間遠心分離した後、10% SDSを90 µLと10 mg/mL proteinase Kを5 µL加え、サンプルを十分にボルテックスします。次に、ThermoMixerを用いて60 °Cで400 rpmの定速撹拌を行い、1時間インキュベートします。溶出をさらに促進するため、このインキュベーション中に10分ごとにサンプルをボルテックスします。短時間の遠心分離後、5 Mの塩化ナトリウムを350 µLずつサンプルにピペットで加えます。30秒から1分間ボルテックスし、サンプルを完全に混合させます。その後、5 °Cにて16,200 ×gで40分間遠心分離します。遠心分離機からサンプルを取り出す際に最も重要なことの一つは、ビーズが移動して、この工程で除去すべき粒子を含むペレットを乱さないようにすることです。次に、ペレットを乱さないように注意しながら、上清を約600 µL、新しい1.5 mLチューブに慎重に移します。氷冷したイソプロパノールを600 µL加え、チューブを数回慎重に転倒混和します。−20°Cで一晩保存します。サンプルをフリーザーから取り出した後、室温で16,200 ×gで20分間遠心分離します。ペレットを紛失しないように注意しながら上清を廃棄し、ティッシュペーパーを用いてチューブを慎重に拭き取ります。200 µLの70%氷冷エタノールを加え、室温で16,200 ×gで10分間遠心分離し、これらのDNA含有ペレットを洗浄します。上清を慎重に除去し、糸くずの出ないティッシュペーパーを用いてチューブを丁寧に乾燥させます。最後に、8 µLに設定した10 µLピペットを使用し、ペレットを乱さないように注意しながら、残っている上清を慎重に取り除きます。エタノールが完全に蒸発するまでペレットを乾燥させます。次に、nuclease-free waterを50〜100 µL加え、短時間ボルテックスし、4 °Cで一晩置いてペレットを溶解させます。ここで抽出したDNAサンプルの機能的効率を確認するため、それぞれの食品源に適したユニバーサルプライマーセットを用いて、PCRで各サンプルをテストしてください。まず、1.5または2.5ミリリットルの反応チューブにプライマー、dNTPミックス、反応バッファー、Taq DNAポリメラーゼ、および精製水を加え、標準反応混合物をボルテックスで撹拌します。次に、各DNAサンプルについて、対応するDNA抽出液1マイクロリットルを、PCRプレート内の標準反応混合物9マイクロリットルに分注します。プレートを閉じ、サーモサイクラーにセットしてPCRプログラムを開始します。PCR反応の終了後、卓上遠心機で短時間遠心し、PCR産物をチューブの底に集めます。次に、各PCR産物 3 µLに6倍濃度のローディングダイ 1 µLを混ぜ合わせます。これらのサンプルを、あらかじめ準備したアガロースゲルのウェルにアプライします。サイズ標準として、100 bpのDNAラダーを1.5 µL、ゲルの1つのウェルにロードします。電気泳動装置の蓋を閉じ、電源に接続し、100 V/cmで35分間泳動させます。泳動後、ゲルを取り出し、あらかじめ準備した染色液に約10分間浸します。最後に、染色液からゲルを取り出し、ゲルドキュメンテーションシステムにセットして、マニュアルに従って可視化します。捕食者の腸内内容物を分析するには、あらかじめ調製したDNA抽出液のワーキングソリューションを使用します。16種類の獲物グループ特異的プライマーセットについて、それぞれ個別にPCR反応を行います。それぞれの獲物群に属する検体のDNAを用いたポジティブコントロール1つと、捕食者の種のDNAを用いたネガティブコントロール1つを含めてください。アロットメントシーケンサーでの検出時に異なるサンプルを混同し、最終的に個体に対して誤った結果を割り当てることを避けるため、各PCRプレート内でのサンプルの配置を正確に記録することが極めて重要です。その後、使用する各プライマーセットの特定のアニーリング温度およびサイクル数に合わせて調整し、前述のプロトコルに従ってPCR反応を行ってください。これらのPCR反応で増幅されたフラグメントを検出するために、自動フラグメント解析をバッチAとBの2つのバッチで実施します。サンプルローディング溶液（SLS）と、各バッチに対応するサイズスタンダードを含む混合液を調製します。次に、それぞれのバッチに属する8つのPCR反応で得られた、 previously frozen（以前に凍結保存した）PCR産物を、遮光に注意しながら融解させます。ミニ遠心分離機のショートランオプションを使用して、スピンダウンしてください。シーケンシングプレートの、解析するサンプル数に対応するウェルに、各サンプルにつき22 µLのそれぞれ対応するSLSサイズ標準混合液を分注します。次に、8つのPCR反応のそれぞれから1 µLのPCR産物を、プレートの対応するウェルに分注します。続いて、ミニプレート遠心機のショートランオプションを使用して、この混合液を慎重にスピンダウンさせます。その後、各ウェルにミネラルオイルを1滴ずつ加えて覆います。次に、バッファープレートの反応ウェルにDNA分離バッファーを250〜300 µL満たします。キャピラリーシーケンサーのソフトウェアを使用し、製造元の指示に従ってサンプルセットアップを作成します。サンプルセットアップ内でのサンプルの割り当てが、シーケンシングプレートのサンプル割り当てと一致していること、およびサンプルセットアップに各バッチの処理に適したメソッドが含まれていることを確認してください。結果を解析する際は、各サンプルのエレクトロフェログラムを視覚的に再確認し、各マーカープライマーセットで検出された個々のピークを個別に確認または除外することが重要です。また、マーカープライマーセットの基準に適合するが検出されなかったピークを手動で挿入するか、誤ったピークを削除してください。本プロトコルで実施したPCR解析のために構築した群特異的プライマーセットの有効性を判定する摂食実験を行った後、捕食者の胃腸管由来のDNAを用いたPCR結果を、アガロースゲル電気泳動および単鎖高次構造多型（SSCP）を用いて解析しました。アガロースゲル電気泳動では、二本鎖DNAの単一のバンドが検出されましたが、解析した異なる餌種を区別することはできませんでした。対照的に、SSCP電気泳動では、消化管内容物のサンプルと参照サンプルを比較することで、異なる餌種を識別することに成功しました。摂食実験後の水ダニの消化管から抽出されたDNAについて、餌の摂取後、異なる時間経過における配列解析を行いました。給餌後1時間から50時間にかけて、検出された被食者のDNAの相対量は有意に減少しました。外来種の端脚類であるDikerogammarus villosusの腸管から抽出したDNAを用い、本プロトコルで記載した16組のグループ特異的プライマーセットを使用して、大型無脊椎動物の被食者DNAの検査を行いました。その結果、D. villosusの腸内容物のうち、標的とした16の被食者分類群のいずれかに属するDNAが陽性であったのはわずか16%でした。さらに、試験した12種の獲物タクサのDNAが少なくとも1つのサンプルから検出されましたが、4種のタクサのDNAは一度も検出されませんでした。この手順を行う際は、使用するプライマーが対象とするシステムのタクサに特異的であることを確認することが重要です。このビデオを視聴することで、研究室で日常的に用いられている手法に遺伝学的解析を補完し、栄養相互作用に関する研究を拡張する方法について十分な理解を得られたはずです。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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