外傷によって影響を受ける脳のレーザーキャプチャーマイクロダイ セクション定位アトラス誘導レーザー

このレーザーキャプチャマイクロダイセクションプロトコルの全体的な目標は、分子分析のために外傷性脳損傷の影響を受けた特定の脳領域から細胞を収集することです。私はヘレン・ヘルミッチ博士です。私の大学院助手であるHarris Weiszは、ここテキサス大学医学部のヒト病態生理学およびトランスレーショナル医学プログラムの学生であり、脳損傷の研究でレーザーキャプチャマイクロダイセクション法をどのように使用するかを実演する予定です。

この方法は、TBIが誘発する脳の離散的な領域、例えば、実行機能を制御する前頭皮質の変化のメカニズムと結果を解明するのに役立つ可能性がある。そして、記憶依存性のプロセスにとって重要な海馬。この手法の主な利点は、同じ脳の複数の個別の脳領域または個々の細胞タイプに対する疾患プロセスの影響を研究できることです。

転写解析を含むLCM手順の前に、RNace除去界面活性剤ですべての表面を洗浄し、汚染やRNA分解のリスクを軽減します。ストレージから脳組織を取り出します。そして、摂氏マイナス20度に冷却したサイロスタットに入れます。

脳をクライオスタットチャンバーの温度まで約10分間平衡化させます。脳を腹側を上にして、クライオスタットステージ上部のガーゼシートに置きます。きれいなRNAカミソリの刃で、小脳のすぐ吻側の後部と視交叉のすぐ前の部分を切り取ります。

最適な切削温度の媒体を少量、2つの別々のクライオ型に入れます。前頭葉連合皮質と側坐核コアを含む脳を、1つのクライオモールド内部を下にして配置します。組織を覆うのに十分なOCT培地を追加します。

海馬と視交叉上核を含む脳組織片でこの手順を繰り返します。OCT培地をクライオスタットで約20分間完全に凍結させます。組織とOCT培地が完全に凍結したら、少量のOTCをマウントヘッドに絞ります。

凍結したクライオモールドをマウントヘッドに押し付け、OCTを完全に凍結させて、組織を含むモールドがヘッドにしっかりと取り付けられるようにします。ヘッドアタッチメントをセクショニングマウントに固定し、ネジを締めます。調整レバーでクライオスタットブレードに対する切断角度を調整し、セクションが均等に切断されるようにします。

断面の厚さを 30 ミクロンに設定します。海馬とSENを含む組織ブロックを切片化する際には、視交叉がブレグマ0.48ミリメートルで平らになるまで切片化し、第3脳室が明らかになったとき。次に、切片化された組織の上に室温ポリエチレンナフタレート膜スライドを穏やかに置くことにより、このポイントからSEMの切片を収集します。

組織とOTCがスライド上に完全に溶けていることを確認することにより、スライドへの付着を視覚的に確認します。組織切片を含むすべてのスライドは、染色されるまでクライオスタットに保管します。視神経上剥離が始まると、ブレグマ0.72ミリメートルで収集セクションを停止します。

海馬の収集のために、顆粒細胞層歯状回の角がブレグマ3.00ミリメートルで見えるようになるまでのセクション。海馬CAサブフィールドがブレグマ4.78ミリメートルの冠状切片で融合するまでセクションを収集します。これにより、開頭術および損傷部位の下の海馬を完全に収集することができます。

染色する前に、すべての食器と染色領域をRNase除去洗剤で化学薬品ドラフトで洗浄します。クライオスタットからサイドのラックを取り出し、ドラフト内に置きます。スライドを30秒間温めます。

切片をクレシルバイオレットで染色し、生理食塩水で透明にします。汚れたスライドのラックを、ヒュームフード内で室温で10分以内に風乾させます。乾燥したら、すぐにLCMに進みます。

RNA分析のためのLCM手順を開始する前に、界面活性剤と100%エタノールを除去するRNAseで収集領域とデバイス周辺を拭き取ってください。顕微鏡ベースをオンにする前に赤外線レーザー発生ユニットの電源スイッチを切り替え、ソフトウェアをデスクトップから起動する前にシステムを初期化します。ソフトウェアが起動して実行されたら、初期化手順でソフトウェアのセットアップパネルを開き、現在のステージボタンを押します。

モジュラーステージは、LCMマクロキャップとスライドがロードおよびオフロードされる位置に移動します。つや消しの端を右に向けて、最大3つのペンメンブレンスライドをホルダーに配置します。それぞれのスライドの横にあるキャップとスライド処理領域を選択し、[MEM]チェックボックスをクリックして、メンブレンガラススライドがロードされたことをソフトウェアに通知します。

次に、最初にキャプチャする目的のスライドをクリックします。キャップ配置の組織の位置と向きのタイル画像をキャプチャするには、ツールバーで画像を選択し、概要を取得を選択します。タイル化された画像上の領域にカーソルを置き、右クリックして、[領域の中心にキャップを配置]を選択します。

ソフトウェアは、選択した位置にキャップを自動的に配置します。赤外線レーザーとUVレーザーを見つけたら、選択ツールパネルでフリーハンド描画オプションを選択します。タッチスクリーンのスタイラスを使用して、タッチスクリーンとスタイラスヘッドの間の接触を失わないようにしながら、関心領域の周囲を描きます。

始点と終点を必ず接続してください。海馬の収集のために、ブレグマ3.00ミリメートルから始まり、歯状回の完全に形成された顆粒層を使用して、CA1、CA2、およびCA3海馬サブフィールドをレーザーキャプチャします。採取後、LCMマクロキャップをQC位置に移動し、UVカット組織がメンブレンに付着していることを視覚的に確認して、組織が完全に付着しているかどうかを検査します。

UVレーザーが組織全体を切断することが不可欠です。そうしないと、LCMキャップへの組織の接着が不完全になります。次に、各キャップを、100マイクロリットルの細胞リサスバッファーを含むRNAseフリーの0.5ミリリットルの薄肉反応チューブにすばやく入れます。

サンプルを短時間ボルテックスして完全なリスを確保し、下流のゲノム解析を行う準備ができるまで摂氏マイナス80度で保存します。以下は、LCMシステム上で赤外線およびUVレーザー機能を使用して損傷部位の上端側から収集された組織切片の代表的な画像です。これは前頭葉連合皮質の領域です。

この画像は、収集後の同じ領域を示しています。そして、これが収集後のキャップの上のティッシュです。この画像は、歯状回のグラニュアル層の完全に形成された角の隣にある海馬のCA1、CA2、およびCA3パラミート層のコンポーネントを示しています。

CA2およびCA3領域が収集され、これらの細胞集団がキャップに見られます。ここでは、前交連に近位の側吾核の領域が標的とされた前方交連に忠実に再現されています。最後に、視交叉上への視交吻上核は、TBI後にLCMによって捕捉されました。

この手法を習得すると、約8時間で1つの脳を処理することができます。これには、組織処理、染色、LCMが含まれます。この手順に続いて、エピジェネティック分析などの他の方法を実行して、メチル化パターンやマイクロニック発現に関する質問に答えることができます。

このビデオを見た後、同じ脳の複数の脳領域でLCMを実行する方法についてよく理解しているはずです。