Name: 外傷によって影響を受ける脳のレーザーキャプチャーマイクロダイ セクション定位アトラス誘導レーザー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 学ぶレーザーキャプチャーマイクロダイセクション法を用いて、外傷性脳損傷の影響を受けるラットの前頭皮質や海馬など特定の脳領域から細胞を採取し、遺伝子発現と微小RNA解析を行う方法。神経科学研究に有用です。

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我々 は彼女の助けのこの原稿を編集エリザベス サムナーを認識したいと思います。このプロジェクトのための資金によって提供された一部ムーディーズ プロジェクト並進外傷性脳傷害研究と RO1NS052532 の。

注: すべての動物実験は、ケアとの使用のため国立の機関健康ガイドの指示に従って、機関動物ケアとテキサス メディカル支店、ガルベストン、テキサス州の大学の利用委員会によって承認されて。実験動物 (第 8 版、国立研究評議会).
 1 です。 組織の採取、領域の同定と押します <ol><li>件名大人、男性、ラット、約 6 週齢と実験的流動打楽器の傷害、島村らが説明したように、250-300 g。 4.</li> <li>イソフルラン濃度 4% まで深く麻酔の商工会議所にそれらを置くことによって実験的脳外傷後二十四時間人道的に安楽死させる動物。斬首で死を確保し、, 脳を切除、すぐに粉末状のドライアイスで凍結します。ストア-80 ° C のフリーザーで脳を断面まで凍結します</li>。
	転写解析が含まれる LCM プロシージャに <li>前は RNase は汚染および RNA の劣化のリスクを軽減するために洗剤を排除することですべての表面をきれいします 。
	注: この清掃、どこで組織の断面、クライオスタットの汚損のために使用される領域と LCM デバイス周辺が含まれます</li>。
	<li>-20 に冷却クライオスタットにストレージおよび場所から脳組織を取得 ° ~ 10 分クリオスタットチャンバーの温度平衡に C. 許可脳</li>
	<li>は、クライオスタット ステージ上にガーゼ シートを脳の腹側に配置します。きれいで、RNase フリーのかみそりの刃を切断後方部分だけ小脳に吻側 (保存または破棄することができますされる) と視交叉 (och) にちょうど前方部分</li>。
	<li>は、2 つの独立した cryomolds に最適な切削温度 (OCT) 媒体の少量を配置します。(を含む前頭連合野 (FrA) と側坐核コア (AcbC)) cryomolds の前面側にダウン脳を配置します。組織を被覆する十分な 10 月中に追加します。
	<ol><li>海馬 (Hp) と視交叉上核 (SCN) を含む脳組織でこの手順を繰り返します</li>。
		<li>クリオスタットで 〜 20 分間完全に凍結する 10 月媒体を許可します</li>。
	</ol></li> <li>10 月中小組織が完全に固定されている取付の頭の上に 10 月の小さな量を絞るし、取付の頭の上にティッシュを含む冷凍 cryomolds を押します。10 月、組織を含む金型は頭にしっかりと取り付けられている完全に凍結するを許可します</li>。
	<li>は断面マウント ヘッドの取付を確保し、ネジを締めます。セクションが均等にカットされますように調整レバーが付いたクライオスタット ブレードに関連して切削角度を調整します</li>。
	<li>は、30 μ m の切片厚を設定します。FrA と AcbC を含む組織ブロックを切断するときまず大脳皮質が明らかになるまでを区分としスタートを収集します</li>。
	<li>ラット脳アトラス 12、セクションおよび収集脳を参考に優しく二次運動皮質 (M2 までの FrA の室温ポリエチレン napthalate (ペン) 膜断面組織の上にスライドを配置することによってセクションします。) が前 5.16 ミリメートルに達する。
	<ol><li>の組織と OCT はスライドに溶けて完全に場合を検査して、スライドに視覚的に遵守します。染色まで、クライオスタットの組織切片を持つすべてのスライドを保存します</li>。
	</ol></li> <li>断面前交連 (aca) が見えるようになるし、今明らか側脳室 (LV) 前 1.80 mm で下に完全な交連 1 つに結合するまで続行します</li>。
	<li>前で aca と接続する LVs まで収集のセクションが表示されます 0.84 mm</li>。
	<li>FrA と AcbC の断面が完了したら、マウントされている組織のブロックを削除して HP と SCN を含むブロックに置き換えます</li>。
	<li>、Och は平坦化前で-0.480 ミリメートル、第三脳室 (3 v) が明らかになるときまでのセクションします</li>。
	前までこのポイントから-0.720 ミリメートル、索の交叉 (sox) 開始 SCN の <li>収集セクション 。
	注: SCN が簡単に渡されるとき、och 全体組織切片を収集が必要になる場合があります</li>。
	<li>HP コレクション、海馬歯状回 (GrDG) 層の顆粒細胞の角までのセクションは前に目に見えて明らか-3.000 mm</li>。
	<li>収集セクション海馬 CA サブフィールドが前のコロナ セクションの融合まで-4.780 mm。この詳細は、開頭手術やけがのサイトの下の海馬の完全なコレクション 。
	注: この演習から以前の出版物で示されるように最も傷つけられた細胞明らかであろうこの範囲内で、遺伝子やマイクロ Rna の発現解析に適したします</li>。
</ol> 2。プロトコルを汚す <ol><li>前に染色、洗浄は、すべて食器と RNase 除去洗剤の化学発煙のフードで染色領域。この準備は、汚染による RNA の劣化のリスクを軽減します</li>。
	<li>無料水、すべての染色試薬とヌクレアーゼのソリューションを準備します</li>。
	<li>を取るのクライオスタットと発煙のフードの場所に格納されているスライド ラック。汚損の解決 (ヌクレアーゼ フリー水を用いて調製) 時次のように 30 s. 場所を暖めるためのスライドを許可: 75% エタノール 1 分、ヌクレアーゼ フリー水を 1 分、1 分の 1% クレシル バイオレット、ヌクレアーゼ フリー水 30 s、ヌクレアーゼ フリー水 30 s、95% エタノール 30 s、100% エタノール 30 s、3 分間のキシレン キシレン 3 分</li>
	<li>は、ヒューム フードに室温で 10 分以上の風乾にラックを許可します。また、速い乾燥の Rnase フリー真空デシケータにラックを配置します。一度乾燥、すぐに LCM に進んでください</li>。
</ol> 3。定位アトラス ガイド レーザーキャプチャー LCM システム <ol><li>コレクション エリアと RNase 除去洗剤と 100% デバイス周辺を拭く RNA 解析のための任意の LCM 手順を開始する前にエタノール</li>。
	<li>基本、顕微鏡の電源を入れる前にユニットを生成する IR レーザーの電源スイッチを入れるし、システムがデスクトップからソフトウェアを起動する前に初期化できるようにします 。
	注意: この順序で完了していない場合、ソフトウェアが認識しない顕微鏡</li>。
	<li>ソフトウェアが起動し、その初期化の手順を実行する後を押して、&#34; 現在の段階 &#34; ソフトウェアでボタン &#34; セットアップ パネル &#34; モジュラー ステージは LCM マクロ キャップとスライドを、ロードとオフロードできることの位置に移動します。</li>。
	<li>フロスト エッジを右に向けて (最大 3 つずつ) ホルダーにペン膜スライドを配置します 。
	注: 場合は間違った方向でホルダーに配置、ソフトウェアできないことがあります希望 IR または UV カット ・ エリアを正しく認識できる</li>。
	<li>をクリックして、&#34; Mem &#34; のチェック ボックス、&#34; キャップとスライド処理領域 &#34; (すなわち A、B、または C) それぞれのスライドの横にあります。この手順では、スライドはスライド ガラス膜であるかどうかを示します。最初にキャプチャするのには、目的のスライドをクリックします</li>。
	組織の場所の並べて表示されたイメージとキャップのプレースメント、方向を撮るカメラを作るに <li>を選択 &#34; 画像 &#34; ツールバーおよび選択の &#34; 取得概要 &#34; 。
	注: ユーザーが収集されている組織に精通している場合、この手順を省略できます位置手動スクロール ボールを使用して、&#34; 地域センター &#34; コレクションです</li>。
	<li>タイル表示されるイメージ (またはタイル張りのイメージなしの相対的な位置) の領域にカーソルを置き、右クリックし、選択 &#34; 場所キャップ地域センター」下車 &#34; ソフトウェアは、選択した位置でキャップを自動的に配置します。</li>。
	<li>は、場所を選択します 。
	注: IR レーザーが正しく整列してソフトウェアによってスポットを横たえた領域のみをピックアップしますようにそれ置く必要があります続行する前に。
	<ol>
	<li>はキャップ内の組織が存在領域に移動しません。クリックして &#34; 私 &#34; で、&#34; Microdissect ツール ウィンドウ &#34; を選択し、&#34; IR 検索 &#34;] タブ。ペインで、火災撮影 IR レーザーは発射とスポットのサイズを評価する IR テストします</li>。
		<li>IR スポットと選択の途中でカーソルを右クリックし &#34; に位置する IR の場所 &#34; 。
		注: サイズ、赤外線ビームの強度変更できます手動で変更することにより、&#34; 電源、直径、または期間 &#34; 各スポット サイズ指定子またはダイアログ ボックスの下部でスライディング スケールを移動することによって。いくつかのテスト ショットは、適切なスポット径を確保するために解雇される必要があります。IR レーザーはキャップの変更またはスライドの位置を切り替えるたびに再配置する必要があります</li>。
		<li>の UV を選択して UV レーザーを検索、切断、&#34; UV を検索 &#34; ダイアログ ボックス タブ 。
		注: UV レーザーと IR レーザーを一斉に移動する、ので必要はありませんを継続的に位置が変わるたびに紫外線レーザーを再検索します</li>。
	</ol></li> <li>の選択、&#34; フリーハンド描画 &#34; のオプション、&#34; ツール ウィンドウの選択 &#34;。タッチ スクリーンとスタイラス ヘッドとの接触を失わないように確認しながら関心領域の周囲に描画タッチ スクリーン スタイラスを使用して、します。一緒に先頭とエンドポイントを接続することを確認します 。
	注: IR スポットが敷設する自動的にソフトウェアを介して、ユーザーは UV カットを実行した後、組織はキャップに付着を確保するための追加のスポットを下に置く指定可能性があります</li>。
	<li>FrA のコレクションは M2 皮質が前 5.16 ミリメートルで表示されるときまで皮質組織の総レーザー キャプチャを実行します 。
	注: FrA または特定の細胞型の特定の部分のみを収集するようにこの詳細が改正することができます</li>。
	<li>の AcbC コレクション、近くの地域、aca に近接レーザー キャプチャします 。
	コアとシェル、AcbC の異なる機能を実行および生理学的に一意です。したがってできるだけ近い脳アトラスを従うことが重要です。過去の前の 2 つの 0.84 mm 以上から収集すること勧めサブ領域にも密接に互いに関連付けられてなる</li>。
	<li>Hp のコレクション、レーザー キャプチャ CA 1 形態識別のため物理的なランドマークとして完全に形成された GrDG を使用して開始前 3.00 mm 2、および 3 の海馬サブフィールド 。
	注: 本研究の目的のため収集しません前過去 Hp サブフィールドが融合、腹側をポイントとポイントとして視覚的に区画することができます-4.780 mm。この地域として選ばれた最も負傷したニューロンを傷害サイト 6 の下で直接発見できる</li>。
	<li>SCN コレクションは、och の背側に座るし、収集密集核最初識別する視覚的にします</li>。
	<li>(上記に記載) の領域のコレクションの後移動する LCM マクロ キャップ、&#34; QC 位置 &#34; 膜に視覚的に UV カット組織を確保することによって完全な組織付着を接続を検査。すぐにキャップ ontoan セル換散バッファーの 100 μ L を含む RNase フリー 0.5 mL 薄壁反応チューブを配置します</li>。
	<li>渦のサンプルに簡単に完全な換散を確保し、-80 ° C で保存この時点で、LCM を一時停止することができます、下流のゲノム解析 6 に使用されるまでにサンプルが格納されます</li>。
</ol>

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</ol>

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哺乳類の脳の分子研究は、LCM 必須の技術となっています。この記事は、LCM システムで IR と UV カット レーザーの組み合わせを使用して哺乳類の脳のあらゆる領域のゲノム変化をキャプチャすることができますを示しています。これらの地域を含むクレシル バイオレットまたはヘマトキシリンとエオシン等の従来の LCM と互換性のある汚れを特定。速度のレーザー ・ キャプチャ ・ プロセスおよびペン膜スライドの厚み 30 μ m セクションに LCM を実行する機能できますが、また、下流のすべてのタイプの適切な品質の LCM 試料からの RNA を隔離するだけでなく細胞サンプルの十分な量を得るゲノム解析;これらの分析は、マイクロ アレイ16、PCR アレイ17、定量的リアルタイム PCR18 をなど。
我々 のデータは、LCM 組織を利用した研究の根拠を提供します。我々 を見つけるそのミール 15 b は海馬と皮質 (図 4) で亢進側坐核でダウンレギュ レートと生物学的脳で TBI の差動効果の理解に関連します。以前の研究は、傷害に皮質神経の脆弱性の増加が否定的 Bcl 219などの生存遺伝子を調整するいくつかの Mirna の発現に起因を提案しました。ターゲット スキャン解析では、Bcl 2 ミール-15 b; によって規制されています従って、私達のデータ提案理由は機械論的説明、脳の特定の領域(すなわち、FCx) TBI に選択的に受けることがあります。ほとんどの遺伝子が複数の miRNAs によって規制されているし、特定のターゲット遺伝子に任意の 1 つの miRNA の変更を関連付けることは困難を覚えていることが重要です。また、これらのデータは、遺伝子とマイクロ Rna 発現の特定の変化が地域固有の脳損傷のマーカーとして使用されることを示します。確かに、我々 が現在使用してこれらのデータ研究にどのように新しい神経保護作用の抗うつ薬のプロパティを持つ薬剤化合物は特異的精神神経疾患にリンクされている脳領域における遺伝子とマイクロ Rna 発現を影響します。我々 の研究の 1 つの制限は、LCM のスライドの準備プロセスの複数のステップの間に RNA の整合性が損なわになる可能性があります。このプロトコルでは、RNA の劣化のリスクを軽減するために必要な手順について説明します。別の制限は、統計の計算に使用される比較的小さなサンプル サイズです。将来的に研究、サンプル サイズの増加は、個々 の動物の間で遺伝子および miRNA 発現の変異の影響を軽減する必要があります。
LCM の便益は、人間の病気や病変組織20,21,22,23のモデル動物を用いた並進のゲノム研究で実現されます。特定の細胞集団をキャプチャする機能、異なる脳の領域の転写プロファイルなければ多くの細胞タイプの不可知と解読のミックスです。脳損傷研究の LCM メソッドを使用すると、脳領域特定バイオ マーカーの線引きし、TBI の血漿中バイオ マーカーとの関連性を理解する、現在の取り組みにつながっています。

哺乳類の脳は非常に複雑な異種細胞のタイプ1の何千もの何百もの。確かに、人間研究を示しているが、前頭葉などの地域で構造の白と灰色で機能の違いがはっきりと発散の転写プロファイル2で反映されます。脳の多様性は、遺伝子発現データを解釈するための主要な障害をされているおよび脳損傷のフィールド。前臨床試験においてこのあいまいさは脳損傷3の治療の失敗の臨床試験の何百もをその後もたらした。
我々 は外傷性脳損傷 (TBI) を勉強するレーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) 方法を使用-ラット脳で4海馬、記憶・学習の5に不可欠な脳の領域に焦点を当てて遺伝子調節不全を誘発します。キャプチャをレーザーし、両方死ぬと神経細胞生存遺伝子発現を解析する能力は私たちに TBI6後結果 (ニューロン生存) を決定する遺伝子発現の確率の役割のより深い理解を与えます。LCM テクニックも若くて老化マウス7またはラット8を比較するとき、海馬ニューロンの TBI の効果を調査するのに役立ちます証明しています。
ラットと人間の TBI 患者エグゼクティブ関数 (すなわち前頭皮質9) と TBI 併存疾患; に関連付けられている地域を中心に、TBI によって悪影響を受けるラット脳の他の地域を調べた最近の研究でこれらの合併症は、うつ病 (すなわち核側坐10) と概日リズム障害 (視交叉上核11) に含まれます。前の調査、Huusko と Pitkanen12 Drexelら13は、視床と視床下部の遺伝子発現を調べるため、LCM を使用しました。我々 の研究に基づいて、これらの事前の観測とその他の 4 つの脳領域が含まれています。TBI 後誘導地域固有の分子レベルの変化を勉強するには、識別と LCM システムを使用してこれらの領域のセルの取得の専門知識を得るために必要だった。紫外線カット、赤外線 (IR) レーザーは、必要な脳の領域の正確な顕微解剖を許可します。ここでは、識別し、実験流体パーカッション脳損傷による特異的影響を受けるキャプチャ 4 ラット脳領域をレーザーに14ラットの脳アトラスの定位座標に導かれるこの LCM システムの使い方について述べる4。

<table><tbody><tr><td>Arcturus Laser Capture Microdissection System</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 6000 Pico Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus PEN Membrane Glass Slides&nbsp;</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>LCM0522</td><td></td></tr><tr><td>Capsure LCM caps</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>LCM0211/LCM0214</td><td></td></tr><tr><td>Cresyl Violet Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>Xylene (Histological grade)</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof (Histological grade)</td><td>UTMB Pharmacy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous micro- kit</td><td>Life Technologies (Ambion)</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Gene Expression Primer/Probes</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>Taqman microRNA Expression Primer/Probes</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>A25576</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 96 System</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

外傷によって影響を受ける脳のレーザーキャプチャーマイクロダイ セクション定位アトラス誘導レーザー

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

興味の特定の脳の領域を分離する機能は、空間的な配分を保持しない組織脱退の技術で妨げられますことができます。プロセス自体は、個々 の細胞における発現パターンを変更できますのでこのようなテクニックも潜在的遺伝子発現解析を傾斜します。ここで染色プロトコルとラットの脳アトラスの指導変更ニッスル (クレシル バイオレット) を用いた外傷性脳損傷 (TBI) によって影響を受ける特定の脳部位を選択的に収集するレーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) 手法について述べる。LCM では、ネイティブの位置と解剖学的ランドマークを使用して、それぞれの領域を識別するために能力の脳領域へのアクセスを提供します。このため、LCM は、TBI の脳領域特異的遺伝子発現を調べる以前使用されています。このプロトコルでは、同じ動物内の異なる脳領域における遺伝子とマイクロ Rna 発現の TBI 変化の検討ができます。この議定書の原則を改正し、他の病気および/または動物モデルにおけるゲノム発現を調べる研究の広い範囲に適用できます。

図 1に示す回路図は、特定の脳領域や潜在的なストリーム分析アプリケーションのガイド付きアトラス LCM の全体的なワークフローを示します。本研究は、TBI の病態と合併症の発展に関連する 4 つの脳領域に焦点を当て: FrA、AcbC、SCN、および Hp。特定の脳部位の LCM に制限は、図 2 (A, D, G, J)で見ることができる解剖学的位置が頻繁に定義された境界の欠如によって隠されることです。断面をガイドし、特定領域のキャプチャをレーザーの脳アトラスの使用は、ターゲット以外の脳領域のサンプル汚染の可能性を低減できます。ケア区分中およびニッスル染色後組織ランドマークに従う、LCM の技術は細胞、核、または地域の15の離散集団を取得の非常に一貫した手段を提供できます。これらの研究の長期的な目標は、遺伝子およびマイクロ Rna、代理として使用できる可能性のある脳領域特定損傷の非侵襲的なバイオ マーカーを同定します。このバイオ マーカー開発パイプラインの最初のステップは、実験的脳外傷後の組織特異的転写変化特性です。これらのデータは、傷害による生体の循環の変化に、関連付けることが。
提示された手順が量的なリアルタイム PCR (RT qPCR) 前に総 LCM RNA の逆転写によって RNA 分析を許可するために RNA の劣化のリスクを軽減するために最適化されました。(大小の RNA 種を含む) の総 RNA が個々 の脳領域からレーザー捕獲をした組織の列に基づく分離メソッドを使用して分離されました。分離のプロシージャの後、RNA の整合性、品質、および数量を評価するには、RNA サンプルが簡単に 70 ° C で変性しを RNA アナライザーで実行します。定性的な測定には、 (図 3)、全体的な劣化の代表をすることができます、18 s、28 s rRNA バンドのピーク振幅を分析し、「RNA 整合性番号」(鈴) を使用してが含まれています。丁寧な RNase フリー テクニックを使用している場合 RNA から分離された LCM サンプル通常 6 - 8 厘の結果。低りんは RNA の品質を意味することができ、遺伝子とマイクロ Rna の発現解析の正確さを減らすことができる可能性があります。逆に、高い凛は RNA 解析から生成された結果の妥当性に自信を向上できます。
RT qPCR は、個々 の遺伝子と (図 4) のマイクロ Rna のプライマー ・ プローブ セットを用いて行った。約 1 ng のトータル RNA の cDNA に逆転写され、qPCR 製造元のプロトコルに従って行われた前にあらかじめ増幅します。傷害関連遺伝子の研究ではこの評価には、 BCL2 関連付けられている X、アポトーシス レギュレータ(バックス)、 B 細胞 CLL/リンパ腫 2 (Bcl 2)カスパーゼ 3、Apoptosis-Related システイン ペプチダーゼ(Casp3) が含まれています。、脳由来神経栄養因子(Bdnf) とキャンプの応答要素結合蛋白質 1 (Creb)。ミール 15 b は、個々 の死にかけているニューロンの実験的脳外傷後に変更するのに示されているために選ばれました。それがまた検証実験と bioinformatically 予測生存関数 (未発表データ) を持つ遺伝子ターゲット。正規化された倍変化率は、それぞれ TBI 動物と素朴なコントロールは、正規化を内因性遺伝子 (Gapdh) または小さな RNA (U6) 遺伝子とマイクロ Rna の発現レベルを比較する ΔΔCt 法によって計算しました。1 上記フォールドの変更は遺伝子またはマイクロ Rna、全体的なアップレギュレーションを示し、逆に、倍変更 1、ダウンレギュレーションを示すより低い。統計分析ことを示した重要な変更 TBI、素朴な制御 (p ≤ 0.05) 間の遺伝子発現の脳の領域を依存していた。TBI と素朴なコントロール間ミール 15 b 式で大幅な変更が検出されなかったが、脳領域依存の方法で上位と下位の表現する傾向があった。そのさらに最適化はマイクロ Rna 発現の変化を評価する必要があるされました。また、サンプル サイズが小さすぎるために一部の式で自然な可変性のための統計的有意性を得ることが可能です。将来の研究は、その遺伝子をように sham 動物と TBI、手術の準備のためにないマイクロ Rna 発現変動に起因しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig1.jpg"> 
図 1。下流のゲノム解析のアトラス ガイド LCM のワークフロー 。(A ~ F)動物の準備から下流 qPCR 解析までの手続き: (A)成人、男性スプレイグ ラット (年齢と体重 300 g 〜 6 週間)、麻酔、流動打楽器、TBI を受けるし、人道的安楽死の外傷後 24 h。(B)新鮮な冷凍脳の切片 (30 μ m) は、Paxinos とワトソンのラット脳アトラスから特定の脳領域 (FrA、AcbC、Hp、SCN) の座標に基づいています。(C)セクション、固定、ニッスル染色 (1% クレシル バイオレット)、脱水、乾燥空気です。(D). LCM に対して LCM システムと脳領域を同定しました。(E) LCM マクロ キャップ セル換散バッファーの 100 μ L と RNase フリーの 0.5 mL チューブに転送し、下流のゲノム解析のための RNA の隔離まで-80 ° C で保存されています。RNA は、TBI の後および/または興味(F)の脳部位間ターゲット分子の発現を調べる遺伝子やマイクロ Rna の RT qPCR 解析のためのリバース転写をすることができます。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig2.jpg"> 
図 2。TBI の LCM に脳の領域が影響を受けます。ティッシュ セクションの収集した同側から IR と UV 損傷部位の代表的な画像レーザー LCM システム上の関数(A-私)。組織はクライオスタット (30 μ m) の断面、ペン膜スライド上で収集されました。セクションされたクレシル バイオレット (1%) とニッスル染色、固定し、Paxinos とワトソンのラット脳アトラスで参照される解剖学的ランドマークに基づいて特定の脳領域を識別するために水分を取り除かれます。(A ~ C)前頭連合野 (GrDG) 歯状回の顆粒層の完全に形成された角の横にある海馬 (Hp) の CA2、CA1、CA3 錐体層 (FrA) (D-F)コンポーネントの領域。(G-私)核側坐コロラド州の領域(AcbC) 再近位及び前交連 (aca) を。(J K)視交叉上核 (SCN) 索交叉 (och) を。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig3.jpg"> 
図 3。RNA の品質の代表スキャンします。代表エレクトロフェロ LCM から派生した RNA の関連付けられたゲル画像収集組織(A ~ D)。エレクトロフェロと関連付けられたゲル画像 18 s、28 s rRNA のピークとゲルのバンドの外観に基づいてそのまま RNA を示しています。この RNA はすべてのゲノムなどのダウン ストリーム アプリケーションおよびプロテオーム解析に適しています。(A)前頭連合野 (FrA) RNA。鈴 6.1。(B)海馬 (Hp) RNA。鈴 4.4。(C)側坐核はコア (AcbC) RNA です。鈴 7.3。(D)視交叉上核 (SCN) の RNA。鈴 7.6。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig4.jpg"> 
図 4。脳の地域固有の遺伝子とマイクロ Rna 発現を介してRt-qpcr のストリーム分析します。TBI 後捕獲レーザー脳領域に個々 Rt-qpcr (バックス、Bcl 2、Bdnf、Casp3、Creb) 興味の遺伝子に関心 (ミール-15 b) のマイクロ Rna を行った (Hp と AcbC n = 5、FrA n = 4) 無傷素朴な動物と比較して、(n = 4)。Hp、AcbC、FCx。 データは素朴なコントロール脳領域と比較して正規化された倍変化率として提示の TBI 病態に関連する遺伝子の解析を行った (ウェルチの補正 ± SEM; と対になっていない t 検定 * p ≤ 0.05) (A)。ミール-15 b 異なる脳部位での発現は素朴なコントロール (± SEM) と比較して正規化されたフォールドの変更として表示(B)。SCN からのデータ (n = 2) 含まれていません。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

我々 は遺伝子とマイクロ Rna 解析のための異なる脳の領域からの異なる細胞集団のサンプルを取得するマイクロダイゼクション キャプチャの使用について説明します。このテクニックにより、ラットの脳の特定の領域における外傷性脳損傷の影響の研究です。

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

このレーザーキャプチャマイクロダイセクションプロトコルの全体的な目標は、分子分析のために外傷性脳損傷の影響を受けた特定の脳領域から細胞を収集することです。私はヘレン・ヘルミッチ博士です。私の大学院助手であるHarris Weiszは、ここテキサス大学医学部のヒト病態生理学およびトランスレーショナル医学プログラムの学生であり、脳損傷の研究でレーザーキャプチャマイクロダイセクション法をどのように使用するかを実演する予定です。この方法は、TBIが誘発する脳の離散的な領域、例えば、実行機能を制御する前頭皮質の変化のメカニズムと結果を解明するのに役立つ可能性がある。そして、記憶依存性のプロセスにとって重要な海馬。この手法の主な利点は、同じ脳の複数の個別の脳領域または個々の細胞タイプに対する疾患プロセスの影響を研究できることです。転写解析を含むLCM手順の前に、RNace除去界面活性剤ですべての表面を洗浄し、汚染やRNA分解のリスクを軽減します。ストレージから脳組織を取り出します。そして、摂氏マイナス20度に冷却したサイロスタットに入れます。脳をクライオスタットチャンバーの温度まで約10分間平衡化させます。脳を腹側を上にして、クライオスタットステージ上部のガーゼシートに置きます。きれいなRNAカミソリの刃で、小脳のすぐ吻側の後部と視交叉のすぐ前の部分を切り取ります。最適な切削温度の媒体を少量、2つの別々のクライオ型に入れます。前頭葉連合皮質と側坐核コアを含む脳を、1つのクライオモールド内部を下にして配置します。組織を覆うのに十分なOCT培地を追加します。海馬と視交叉上核を含む脳組織片でこの手順を繰り返します。OCT培地をクライオスタットで約20分間完全に凍結させます。組織とOCT培地が完全に凍結したら、少量のOTCをマウントヘッドに絞ります。凍結したクライオモールドをマウントヘッドに押し付け、OCTを完全に凍結させて、組織を含むモールドがヘッドにしっかりと取り付けられるようにします。ヘッドアタッチメントをセクショニングマウントに固定し、ネジを締めます。調整レバーでクライオスタットブレードに対する切断角度を調整し、セクションが均等に切断されるようにします。断面の厚さを 30 ミクロンに設定します。海馬とSENを含む組織ブロックを切片化する際には、視交叉がブレグマ0.48ミリメートルで平らになるまで切片化し、第3脳室が明らかになったとき。次に、切片化された組織の上に室温ポリエチレンナフタレート膜スライドを穏やかに置くことにより、このポイントからSEMの切片を収集します。組織とOTCがスライド上に完全に溶けていることを確認することにより、スライドへの付着を視覚的に確認します。組織切片を含むすべてのスライドは、染色されるまでクライオスタットに保管します。視神経上剥離が始まると、ブレグマ0.72ミリメートルで収集セクションを停止します。海馬の収集のために、顆粒細胞層歯状回の角がブレグマ3.00ミリメートルで見えるようになるまでのセクション。海馬CAサブフィールドがブレグマ4.78ミリメートルの冠状切片で融合するまでセクションを収集します。これにより、開頭術および損傷部位の下の海馬を完全に収集することができます。染色する前に、すべての食器と染色領域をRNase除去洗剤で化学薬品ドラフトで洗浄します。クライオスタットからサイドのラックを取り出し、ドラフト内に置きます。スライドを30秒間温めます。切片をクレシルバイオレットで染色し、生理食塩水で透明にします。汚れたスライドのラックを、ヒュームフード内で室温で10分以内に風乾させます。乾燥したら、すぐにLCMに進みます。RNA分析のためのLCM手順を開始する前に、界面活性剤と100%エタノールを除去するRNAseで収集領域とデバイス周辺を拭き取ってください。顕微鏡ベースをオンにする前に赤外線レーザー発生ユニットの電源スイッチを切り替え、ソフトウェアをデスクトップから起動する前にシステムを初期化します。ソフトウェアが起動して実行されたら、初期化手順でソフトウェアのセットアップパネルを開き、現在のステージボタンを押します。モジュラーステージは、LCMマクロキャップとスライドがロードおよびオフロードされる位置に移動します。つや消しの端を右に向けて、最大3つのペンメンブレンスライドをホルダーに配置します。それぞれのスライドの横にあるキャップとスライド処理領域を選択し、[MEM]チェックボックスをクリックして、メンブレンガラススライドがロードされたことをソフトウェアに通知します。次に、最初にキャプチャする目的のスライドをクリックします。キャップ配置の組織の位置と向きのタイル画像をキャプチャするには、ツールバーで画像を選択し、概要を取得を選択します。タイル化された画像上の領域にカーソルを置き、右クリックして、[領域の中心にキャップを配置]を選択します。ソフトウェアは、選択した位置にキャップを自動的に配置します。赤外線レーザーとUVレーザーを見つけたら、選択ツールパネルでフリーハンド描画オプションを選択します。タッチスクリーンのスタイラスを使用して、タッチスクリーンとスタイラスヘッドの間の接触を失わないようにしながら、関心領域の周囲を描きます。始点と終点を必ず接続してください。海馬の収集のために、ブレグマ3.00ミリメートルから始まり、歯状回の完全に形成された顆粒層を使用して、CA1、CA2、およびCA3海馬サブフィールドをレーザーキャプチャします。採取後、LCMマクロキャップをQC位置に移動し、UVカット組織がメンブレンに付着していることを視覚的に確認して、組織が完全に付着しているかどうかを検査します。UVレーザーが組織全体を切断することが不可欠です。そうしないと、LCMキャップへの組織の接着が不完全になります。次に、各キャップを、100マイクロリットルの細胞リサスバッファーを含むRNAseフリーの0.5ミリリットルの薄肉反応チューブにすばやく入れます。サンプルを短時間ボルテックスして完全なリスを確保し、下流のゲノム解析を行う準備ができるまで摂氏マイナス80度で保存します。以下は、LCMシステム上で赤外線およびUVレーザー機能を使用して損傷部位の上端側から収集された組織切片の代表的な画像です。これは前頭葉連合皮質の領域です。この画像は、収集後の同じ領域を示しています。そして、これが収集後のキャップの上のティッシュです。この画像は、歯状回のグラニュアル層の完全に形成された角の隣にある海馬のCA1、CA2、およびCA3パラミート層のコンポーネントを示しています。CA2およびCA3領域が収集され、これらの細胞集団がキャップに見られます。ここでは、前交連に近位の側吾核の領域が標的とされた前方交連に忠実に再現されています。最後に、視交叉上への視交吻上核は、TBI後にLCMによって捕捉されました。この手法を習得すると、約8時間で1つの脳を処理することができます。これには、組織処理、染色、LCMが含まれます。この手順に続いて、エピジェネティック分析などの他の方法を実行して、メチル化パターンやマイクロニック発現に関する質問に答えることができます。このビデオを見た後、同じ脳の複数の脳領域でLCMを実行する方法についてよく理解しているはずです。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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