Name: 当然やりがい雌ハムスターの行動中に細胞外の神経伝達物質の生体内変化を測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 学ぶ 固定電位アンペロメトリー記録と酵素バイオセンサー技術を用いて、覚醒した行動中のメスハムスターのドーパミンとグルタミン酸の動態を測定する方法。神経伝達物質の高時間分解能モニタリングにより、行動神経科学への貢献が期待されます。

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著者は、Matlab コードを実行している彼のためのダニエルの Korus 学部と学部アレックス ベッチャー行動実験を実行している彼の援助に感謝したいと思います。このプロジェクトは、R.L.M. に NSF IOS 1256799 によって薬物乱用賞番号 T32DA007234 の下で健康の国民の協会の国立研究所でサポートされています。

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著者が明らかに何もありません。

比較的簡単ですが、この手法を採用する場合にいくつかの問題が発生します。まず、プローブの固定配置が正確でなければならない: マイクロダイアリシス プローブを取り巻く細胞外の環境のより広い半径でサンプルするとは異なりこの手法のみの直接接触に入って来る物質の計測が可能プローブ。第二に、繊維の幅が狭いため、炭素繊維の記録の場合破損が発生することができますと意図的なケア、プローブを挿入します。グルタミン酸作動性バイオ センサーの場合は、酵素分解は、プローブは 3 週間の保証期間内に使用しない場合に発生します。幸いなことに、これらすべての問題は、アドレス指定可能な適切なケアと細部への注意と除去することができます。
潜在的問題の注意点は固定潜在的な炭素繊維の録音の特異性に発生します。両方神経伝達物質を解放する分野で録音が行われた場合、ノルエピネフリンなどの他のモノアミンとドーパミンの応用の可能性が一致するのでより化学的特異性の欠如は、結果の解釈を制限があります。NAc でこれ主要な問題は、プライマリ カテコールアミン送信機24をされているドーパミン...

目を覚まし行動中の動物の伝達物質の放出を測定する機能により、神経伝達の両方を生み出す機構と回路を調査するための強力なツールの時空間パターンの特定の動作をリンクする研究者自然リアルタイムでオペラント行動。歴史的に、脳1の細胞外の環境の両方の電気的反応性、非反応性の物質を測定するマイクロダイアリシスを採用されています。この技法は、先端が中空の半透膜2の小さいシャフトから成るマイクロダイアリシス プローブを細胞外液に類似のイオン組成の水溶液の連続的な流れを使用します。高速液体クロマトグラフィー (HPLC)、によってその後の分析のための間隔で収集される前に受動の拡散によって半透膜が出来る神経伝達物質または興味の他の検体プローブの挿入後、分析化学技術を区切るには、一般に利用を識別して異種混合物3のコンポーネントを定量化します。
マイクロダイアリシス興味の事実上すべての検体を測定する使用することができます敏感な手法ですが、時間の分解能は低く、およそ万分1,2分の最大サンプリング レート。高速スキャン サイクリックボルタンメトリー (FSCV)、電気活性種の酸化還元電位に依存する技術の発明は、細胞外液に興味の analyte の瞬時濃度近く解明できます。簡単に言うと (ロビンソンらを参照してください。4広範なレビューのため)、速い時間スケール4三角波ファッションに電圧を上下させる電極を適用します。電圧は、適切な範囲で、目的の化合物が繰り返し酸化して縮小しました。この酸化し削減微小交流電流を作成する電子の動きになります。スキャン レート酸化マイクロ秒単位で発生している化合物の還元とサブ秒スケールの場所を取る。現在の結果からのプローブによって作成された現在の背景を引く、現在プロットの各化合物に固有対の電圧を生成できます 1 つ。電圧振動のタイム スケールが知られているので、これらのデータは、現在のプロットを時間の関数として計算する使用できます。したがって、各酸化で転送された電子の数と還元反応が4を知られている限りは、化合物の相対濃度が決定されるかもしれない。
この化学的特異性と高い時間分解能 FSCV体内の化学成分の濃度変化を検出するための強力な技術を確認します。ただし、これらのマニホールドの利点にもかかわらず技術的なノウハウと高価な機器、セットアップにこのテクニックが必要。さらに、この手法を使用して、nonelectroactive 神経伝達物質 (例えばグルタミン酸) を測定できません。幸いなことに、これらの発明の商品化と同様、電気化学5の分野で技術の進歩は目を覚まし行動中の動物の非ゲルロボットの神経伝達物質を測定する比較的単純なアプローチを導入しています時間精度、テクニックを損なうことがなく酵素バイオ センサー技術として知られています。この手法は、あるゲルロボット過酸化水素応用可能性5 によって生成されたアンペロ メトリック酸化電流として検出される 2 枚の基板に関心の nonelectroactive 神経伝達物質の酵素的変換を使用してください。.市販バイオ センサー プローブ選択的に競争力のある内因性接しないの貢献を減らすことによって興味の検体を測定 (図 1参照)。グルタミン酸、場合共通 interferent アスコルビン酸 (AA) の貢献は競争力のある減測定電流に共同非ゲルロボット AA に変換するセンサーの活性酵素表面に AA オキシダーゼのローカライズdihydroascorbate と水。さらに、酵素層の下に存在負荷電ナフィオン膜は内因性アニオン性化合物を除外します。
この同じバイオ実験のセットアップは、FSCV のようにゲルロボットの神経伝達物質を測定できますが、代わりにそれは固定電位記録6を採用しています。FSCV で、振動電圧とは対照的で固定電位記録電圧は抑えている酸化還元で興味の analyte の潜在的です。このアプローチのターンキーの性質が化学物質の欠如を上回る圧倒的に 1 神経伝達物質に向かって傾斜する脳領域の同じ酸化還元電位、あるかもしれない複数の神経伝達物質として FSCV より少ない化学選択的ですが、特異性。
ほぼリアルタイムでゲルロボットと nonelectroactive の両方の神経伝達物質解放を測定し、特定の行動イベントにリンクする機能では、収束の伝達物質の放出を検討する機会を提供します。この原稿は、目を覚まし行動ハムスターにおける自然な報酬への応答でドーパミンやグルタミン酸の神経伝達を尋問するこのシステムの使用を詳しく説明します。本稿の目的は、性的行動その他の行動および実験パラダイムを調べるため実現の可能性を示すことを目標に、雌ハムスターの中にこの伝達物質の放出を測定するプロセスを詳しく説明することです。
ハムスターが電気化学的録音で使用するための理想的なモデル 歴史的に、ラットとマウスのモデルは、性行動の研究で採用されています。これらの齧歯動物種は耳がぴくぴくを追跡し、最終的にマウント女性7男性を誘惑するホッピング、ダーツなど多数の女性の勧誘行動を含む動的交尾シーケンスに従事します。(膣の浸透の有無にかかわらず) 男性による取付けは続きます、ほんの数秒、アクティブな勧誘行動を再開する前に、数秒間だけ中に女性を彼女の性的行動の姿勢で (前彎と呼ばれる) も行っています。この動作、不動の短い期間と散在している活動の高レベルの構成のパターンは動物の行動の神経伝達を測定する問題です。まず、神経活動とは無関係なアンペロ メトリックの録音で運動の成果物もあります。第二に、歩行が脳の特定領域の特定の神経伝達物質のリリースに関連付けられます。たとえば、ドーパミン放出は、背側と腹側線条体8、の9、マイクロダイアリシス ドーパミン精神刺激を次の測定のための基礎を形作った発見自発運動に結合されて管理10。Mos の女性-典型的な勧誘行動神経伝達の変化を総称して最後だけ性行動の明示的なコンポーネントに帰することは困難、t 齧歯動物の歩行活動の高レベルを含む、10 分性行動テストの大部分によって表されます分です。
女性の性行動の神経化学的プロファイルを分析するには、この演習は、性行動に伴う最小限の自発運動がある種を求めた。ハムスター (ん) の交尾のシーケンスは通常のラット及びマウス11見て勧誘行動の不足のため神経の録音に最適です。結果として、雌ハムスターが入力し、セッション12をテスト 10 分から 9 分の上向きの前弯姿勢を維持します。生体内で女性余分な歩行運動の欠如と男性と性的な相互作用のコンポーネントと関連付けることができる電気化学的録音が得られます。
ハムスター交尾発作 試験室に男性の刺激の動物の紹介の後、男性は最初彼女 (図 2A) をマウントする前に女性の性器調査 (AI) で従事します。マウントする男性に、女性は前弯で彼女は背中のアーチし、取付の男性は彼女の膣への陰茎のアクセスを得ることができますので、彼女の尾を偏向として知られている受容性姿勢を仮定しなければなりません。男性は両方の足 (図 2B) と彼女の後半部を握りしめる女性をマウントし、陰茎あたって (図 2C) を得るために試みに突っ込み始めます。男性は射精を最終的に達成する前に回数を intromit し同様 (挿入) することがなく女性がマウントされます。マウントと射精につながる intromissions のこのシーケンスは、「交尾試合」と呼ばれます。男性は、単一セッション内で複数交尾一続きがあります。

<table><tbody><tr><td>ネンブタール</td><td>オークファーマシューティカルズ株式会社</td><td>76478-501-50</td><td>ペントバルビタールナトリウム注射、USP。このラボでは、8.5 mg / 100 g体重をペロチン内に注射します。&nbsp;</td></tr><tr><td>ロキシコム鎮痛剤&nbsp;</td><td>ノーブルック研究所&nbsp;</td><td>6451603670</td><td>術後の疼痛管理に使用されるNSAID抗炎症薬および鎮痛薬。ジェネリック:meloxicam.&nbsp;</td></tr><tr><td>Enroflox抗生物質&nbsp;</td><td>ノーブルック研究所&nbsp;</td><td>5552915411</td><td>術後の感染予防のためのフルオロキノロン系抗生物質。ジェネリック:エンロフロキサシン。</td></tr><tr><td>Beuthanasia-D&nbsp;</td><td>メルクアニマルヘルス</td><td>00061047305</td><td>ペントバルビタールナトリウム、フェニトインナトリウム安楽死剤。</td></tr><tr><td>骨ねじ</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>8111-16</td><td>1/8インチ骨ネジ(16個入り)は、頭蓋骨に頭蓋骨キャップを固定するために使用されます。&nbsp;</td></tr><tr><td>歯科用アクリル(Bosworth Duz-All)</td><td>ボスワース&nbsp;</td><td>166261C&nbsp;</td><td>自己硬化型歯科用アクリルは、カニューレとヘッドマウントを頭蓋骨に固定するためのスカルキャップの構築に使用されます。</td></tr><tr><td>ハードウェアバイオセンサーのセットアップ&nbsp;</td><td>ピナクルテクノロジーズ株式会社</td><td>8400-K2</td><td>Pinnacleは、ラット用テザーバイオセンサーシステムの新規ユーザー向けに、完全なハードウェアキットを提供しています。キットには、整流子、プリアンプ、データコンディショニングおよびアクイジションシステム</td></tr>が含まれます <tr><td>ベースビデオコンピュータパッケージ</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>9000-K1</td><td>基本コンピュータ・パッケージには、十分なハード・ディスク・ストレージを備えた事前構成済みコンピュータ、高解像度モニタ、キーボードとマウス、無停電電源装置、および必要なすべてのケーブルが含まれています。&nbsp;</td></tr><tr><td>ビデオ EQ700 EverFocus カメラ&nbsp; パッケージ</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>&nbsp;9000-K10&nbsp;</td><td>EQ700ナイトビジョン対応ボックスカメラは、独立したIRソースを備えており、Pinnacleビデオコンピューターパッケージの一部として入手されました。ドームカメラ(9000-K9)とHDカメラ(9000-K11)もオプションでご利用いただけます。</td></tr><tr><td>Sirenia Acquisitionソフトウェア</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>無料 -- pinnaclet.com</td><td>Sirenia&nbsp; からダウンロードできます。Acquisitionは、Pinnacleのハードウェアシステムからデータを記録するための単一のプラットフォームを提供します。このソフトウェアは、すべてのデータストリームの同期、ユーザー構成可能な設定、データ統合、および複数のエクスポートオプションを備えています。さらに、このソフトウェアには、バイオセンサー記録用の基本的なレビューおよび分析モジュールが含まれています。シレニア&nbsp;データの取得とレビューに最適な無料のLL-in-Oneソフトウェアを提供します。</td></tr><tr><td>つながれたネズミ&nbsp;in vitro&nbsp;キャリブレーションキット</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>7000-K2-T-BAS&nbsp;</td><td>バイオセンサーで測定した電流の変化を実際の分析対象物濃度の変化に関連付けるためには、動物に移植する前にバイオセンサーを校正する必要があります。このプロセスでは、センサーの完全性と選択性も確認されます。&nbsp;キャリブレーションキットには、20 mLジャケットビーカー(#7058)、1/2インチ×1/8インチのマグネチックスターバー(#7059)、ライトアングルクランプ(#7056)、2ピンシングル調整クランプ(#7055)、4チャンネルキャリブレーションプリアンプライザー(#7053)、キャリブレーションホルダー(#7051)が含まれています。</td></tr><tr><td>攪拌プレート&nbsp;</td><td>Corning</td><td>6795-410D</td><td>Corningデジタルスターラー、5インチ x 7インチ、120VACは、グルタミン酸バイオセンサーのin vitroキャリブレーション中にジャケット付きビーカーでマグネチックスターラーを回転させるために使用されます。</td></tr><tr><td>閉ループ循環が可能なウォーターバス</td><td>PolyScience</td><td>8006A11B</td><td>PolyScience 8006A11B 6L Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC Water Bathは、ジャケット付きビーカーを生理学的温度まで加熱するためにプラスチックチューブとともに使用されました。&nbsp;</td></tr><tr><td>BASiラットカニューレ付きカーボンファイバーセンサー</td><td>Pinnacle Technology, Inc.</td><td>7002-CFS</td><td>は、ドーパミン神経伝達の記録に使用される炭素繊維電極です。</td></tr><tr><td>Ag/AgCl参照電極</td><td>Pinnacle Technology, Inc.</td><td>7065</td><td>カーボンファイバー録音に必要です。</td></tr><tr><td>グルタミン酸バイオセンサー&nbsp;</td><td>ピナクルテクノロジー株式会社</td><td>7001年&nbsp;</td><td>グルタミン酸作動性神経伝達の記録に使用される酵素バイオセンサープローブ。</td></tr><tr><td>BASiガイドカニューレ</td><td>Pinnacle Technologies、Inc.</td><td>7030&nbsp;</td><td>ガイドカニューレを脳の関心領域に埋め込み、プローブをガイドします。</td></tr><tr><td>BASiカニューレプラスチックヘッドピース(ネズミ用)&nbsp;</td><td>ピナクルテクノロジーズ株式会社</td><td>7011&nbsp;</td><td>ヘッドマウントはプローブを安定させ、ポテンショスタットに取り付けます。</td></tr></tbody></table>

当然やりがい雌ハムスターの行動中に細胞外の神経伝達物質の生体内変化を測定

Measuring In Vivo Changes in Extracellular Neurotransmitters During Naturally Rewarding Behaviors in Female Syrian Hamsters

急速な時間スケールでの伝達物質の放出を測定する機能により、特定の動作または操作にリンクする神経伝達のパターン基になる機構と回路の解明で強力なツールです。マイクロダイアリシス法は、脳に興味のほぼすべての検体を測定する何十年も使用されています、この手法時間的解像度に限界があります。また、高速循環ボルタンメトリーは一時的に正確な非常に敏感です。ただし、技術的に困難な本法は興味の analyte の electroactivity に依存しているので、nonelectroactive 物質 (例えば、神経伝達物質グルタミン酸) を検出する可能性がなくなります。固定ポテンシャルをアンペロメトリーと時空間精度ゲルロボットと nonelectroactive の両方の神経伝達物質を測定する酵素バイオ センサーを組み合わせたターンキー システムの使用の詳細を説明します。これらの 2 つの強力な技術の組み合わせ、比較的簡単に強壮剤や一過性の神経伝達の測定により、複数の神経伝達物質の同時録音が可能します。本稿の目的は、ドーパミンやグルタミン酸神経伝達体内表示の究極の目標をハムスターの (すなわち、性行動) 当然のことながらやりがいのある動作を使用して測定のプロセスを示すため、その他の行動および実験パラダイムを調べるためこのアッセイの技術的可能性は。

電気化学および行動コーディング上記手法を使用して、この演習は、性行動の生体内で録音中にドーパミンやグルタミン酸の一過性変動・ トニックを特徴付けるし始めています。この方法論の一時的正確な方法によるより正確に性的行動中の神経伝達を特徴付けることができる我々同様、個々 の交尾行動 (例えばあたって、射精) の女性の受信中に対応する過渡変動と交尾の発作中にリリース パターンで特定の変更を対応する強壮剤変更に帰する取り付けの男性。
具体的には、ドーパミンやグルタミン酸の別の動物の NAc のリリース パターンを計測するのに焦点を当てるこの方法論を使用しました。NAc 報酬22の処理に関与する重要な地域であり性的行動23の報酬の面で不可欠な地域として記載されています。
<p class="jove_content" fo:k...

自然やりがいのある行動の中にドーパミンやグルタミン酸高時間分解能のリリースを測定する炭素繊維電極と酵素バイオ センサー技術を使用して固定電位電流記録の使用の詳細を説明しますメスのハムスター。

The ability to measure neurotransmitter release on a rapid time scale allows patterns of neurotransmission to be linked to specific behaviors or ...

本実験手順の全体的な目的は、覚醒して行動している動物における神経伝達物質の放出を測定することです。このビデオでは、特定の行動イベントに関連した特定の神経伝達物質の放出を特性評価できるため、行動神経科学への適用例を示していますが、本手法は薬剤注入など、他のさまざまな神経科学の分科においても利用可能です。本手法の主な利点は、生体内で神経伝達物質の放出をほぼリアルタイムで測定できる、ターンキー的な利便性にあります。オスを導入する4時間前に、プロゲステロン500 microgramsを綿実油0.1 millilitersに溶解して皮下注射し、性的受容性を誘発させます。齧歯類の社会行動は白光下および赤光下の試験条件によって変化するため、必ず1日のサイクルの暗期開始時に各個体をテストしてください。検量線用溶液は、試験当日に20 milliliterガラス遠心チューブを用いて調製してください。分析物溶液を調製するため、7.4 mgのL-glutamic acidを10 mLの超純水に溶解させ、チューブをゆっくりと転倒混和させます。次に、176.1 mgのAAを10 mLの超純水に溶解させて、干渉溶液を作製します。標準較正の準備として、一般的なラボ用リングスタンドのベースにマグネチックスターラーを設置します。20 mLのジャケット付きビーカーをマグネチックスターラーの上に置き、中サイズの2本爪クランプで固定します。ジャケット付きビーカーを循環水槽に接続し、緩衝液を37 °Cに加熱します。ジャケット付きビーカーにマグネチックスターラーバーと20 mLの100 mMリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を加えます。次に、ジャケット付きビーカーの上にセンサー校正ホルダーを置き、その上に4チャンネル校正プリアンプを設置し、直角クランプで固定します。その後、プリアンプをデータコンディショニング・収集装置に接続し、校正データを記録します。実験記録の前に、プローブをジャケット付きビーカー上の校正ホルダーに入れ、センシングキャビティと塩化銀参照電極の一部を緩衝液に浸し、各酵素バイオセンサーのグルタミン酸に対する感度をテストします。無料でダウンロード可能なデータ収集ソフトウェアを使用し、コンピューターインターフェースで新しい記録を開始します。次に、テスト対象の各センサーを4チャンネル校正プリアンプのポートに接続します。センサーが安定したベースラインに達するまで待ちます。センサーが安定したベースラインに達したら、分析物の注入を開始します。キャリブレーションホルダーの穴を利用して、ピペットチップを緩衝液に導入します。その後、記録ソフトウェアのクイックキー注釈ツールを使用して、注入を行ったタイミングに注釈を付けます。次に、分析物溶液 40 µL を緩衝液中にピペッティングし、10 µM のグルタミン酸注入

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JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオは、麻酔をかけたラットに電極とカニューレを埋め込んで、ポテンショスタットを使用して側坐核のドーパミン放出を測定し、腹側被蓋領域のドーパミン作動性活性を調節するための薬物を注入する方法を示しています。...

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使用して報酬を求める行動の変化を測定するための簡単な方法<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

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検出技術その場で革新的な RNA 側坐齧歯動物の核内ドーパミン D1-アルファ受容体の同定

このプロトコルは、バーンズ迷路を使用して記憶・学習能を測定します。新たな乙女の苦痛パラダイムは、自発運動量とマウスにおける向社会的行動を評価するために使用されます。...

空間的な学習とバーンズ迷路と乙女の苦痛のパラダイムを用いたマウスの向社会的行動の分析

ここで紹介するプロトコルは、脳波(EEG)と行動評価の同時発生に関する情報をリアルタイムで提供します。このプロトコルに関連するすべてのステップを、神経科学の多く分野、特に学習および記憶分野の研究者にとって魅力的なソリューションとして説明しました。...

海馬神経新生研究ツールとしての無線電気生理学と記憶行動検査の同時モニタリング

M&amp;M's(脂肪と糖でできた非常に口当たりの良い食品)への断続的なアクセスを使用して、マウスで過食モデルが確立されました。この高脂肪、高糖質の食品を断続的に摂取するマウスは、ストレスのような行動、カロリー摂取量の増加、および標準的な食事よりもその食品を好むことを示しました。...

マウスにおける間欠的ビンジインテークモデル

によるマウス網膜神経節細胞のトランスフェクション in vivoでエレクトロポレーション

学ぶ 固定電位アンペロメトリー記録と酵素バイオセンサー技術を用いて、覚醒した行動中のメスハムスターのドーパミンとグルタミン酸の動態を測定する方法。神経伝達物質の高時間分解能モニタリングにより、行動神経科学への貢献が期待されます。

当然やりがい雌ハムスターの行動中に細胞外の神経伝達物質の生体内変化を測定

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