植物プロモーター解析: 同定とルート、インゲンの根粒特異的プロモーターの解析

毛深い根は、レポーターコンストラクトを使用してPhaseolusの変換された根を取得するために使用されます。得られたトランスジェニックルートは、レポーター遺伝子の発現を調べるために使用されます。プロモーター発現研究は、遺伝子の時空間発現パターンを理解するために重要です。

今日は、毛根誘導の方法論を示し、Phaseolusの根結節共生条件下でのトランスジェニック毛根のプロモーター発現パターンを研究する。今回、Estrada-Navarreteたちは、これまでにAgrobacterium rhizogenesが誘導する毛状根系をPhaseolusに確立した。現在の方法は、毛根誘導の期間を加速し、それによってシステムの汎用性を向上させるのに役立ちます。

手順を実演するのは、同僚のManoj-Kumar Arthikalaと、私の研究室の学部生のAlma LeticiaとBrenda Marianaです。まず、PhytozomeからPhaseolus vulgarisゲノムデータベースでNIN遺伝子配列を検索し、ATGまで上流の配列の長さを選択します。オリゴヌクレオチドは、適切なプロモーター配列解析に従って設計します。

新たに調製したPhaseolusゲノムDNAは、プロモーター配列をPCR増幅するためのテンプレートとして機能します。ハイフィデリティTaqポリメラーゼと標準PCRコンポーネント、および以前に設計したオリゴヌクレオチドを使用して、PCRマスターミックスを調製します。マスターミックスを2 mL PCRチューブに分注し、サーモサイクラーおよび適切なプログラムを用いてプロモーターフラグメントの増幅を行います。

PCR産物を1.2%アガロースゲル上で電気泳動で分離します。UV透過照明下で700塩基対で増幅されたNINフラグメントを可視化します。フラグメントをエクスキュージング、溶出、および標準の指示に従ってGatewayエントリーベクターpENTR/D-TOPOベクターにクローニングします。

反応混合物の2マイクロリットルを摂氏42度で50秒間有能な大腸菌細胞に変換し、1リットルあたり50ミリグラムのカナマイシンを補充したLBに形質転換した大腸菌をプレートします。めっきした細胞を摂氏37度で一晩成長させます。無作為に選択した大腸菌コロニーから単離されたプラスミドに対して、M13オリゴヌクレオチドを用いてPCR反応を行います。

1024塩基対のフラグメントは、ポジティブクローンを示すはずです。ポジティブエントリークローンとデスティネーションバイナリベクターの間でLR反応を行います。2マイクロリットルの反応混合物を大腸菌に変換し、摂氏37度でスペクチノマイシン1リットルあたり100ミリグラムのコロニーを選択します。

プラスミドをNIN特異的オリゴヌクレオチドで増幅します。ポジティブクローンは700塩基対で増幅するはずです。クローンフラグメントの配列を決定し、正確性を確認します。

NIN プロモーターコンストラクトをエレクトロコンピテント K599 Agrobacterium rhizogense 細胞に動員します。そしてもう一度、プロモーター特異的なオリゴヌクレオチドを持つクローンを確認します。硫黄はPhaseolus vulgarisの種子を滅菌し、摂氏28度の暗闇で2日間、滅菌済みの湿った濾紙で発芽します。

150マイクロリットルのAgrobacterium rhizogines細胞をNINコンストラクトと制御ベクターで広げ、スペクチノマイシン選択のLBプレート上に広げます。摂氏28度で一晩で文化を育てます。Phaseolusの苗をデコートし、プレートから200マイクロリットルの先端を曲げてAgrobacterium rhizogenes細胞をこすり落とします。

そして、1mLの滅菌蒸留水でEppendorf Tubeに再懸濁します。Agrobacterium rhizogenes細胞を3 mLのシリンジに集め、Phaseolusの苗を事前に準備したチューブセットアップに入れます。発芽した種子の胚軸を針先でわずかに刺し、同時にAgrobacterium rhizofines細胞を注入します。

針が胚軸を通過しないように注意する必要があります。注入した苗木を摂氏28度の成長チャンバーに保持し、16時間の明るい光周期と8時間の暗い光周期で観察します。負傷した胚軸のカルスは、5〜7日で見えるはずです。

2週間後、毛むくじゃらの根の2センチ下の茎を切って一次根を取り除き、それらを滅菌バーミキュライトの入った鉢に移植します。同時に、1 mlのRhizobium tropiciを植物に接種して、結節を誘発します。.Rhizobiumの培養物はOD 600で6に希釈してください。

植物を成長室で摂氏28度、光長16時間、暗日長8時間に維持し、B溶液とD溶液で灌漑します。NINプロモーターの時空間発現パターンを研究するために、サンプリングは異なる時点で行われます。根を傷つけずに植物を取り出し、バーミキュライトの斑点がないまま根を洗います。

NINと対照植物から根をランダムに選択し、GUSアッセイバッファーで37°Cの暗所で16時間インキュベートすることにより、GUS組織化学染色に進みます。GUS染色された根を実体顕微鏡および複合顕微鏡で観察します。この写真は、Rhizobiumが誘導するNINプロモーターの初代根での発現を示しています。

NINプロモーターの発現は、リゾビウムに感染した根有毛細胞でも見られました。さらに、GUS発現は、根結節発生のさまざまな段階で文書化できます。ベクトル制御根にGUS発現は見られませんでした。

このビデオを見れば、プロモーターコンストラクトの設計と、Phaseolusのトランスジェニック毛根におけるプロモーター発現パターンの研究についてよく理解できるはずです。このシステムは、Phaseolusや他のユーディコットにおける他の共生および病原体の相互作用の下でのプロモーター発現パターンを研究するためにさらに拡張することができます。