Name: 受動的な明快さクリア マウス卵巣の血管の 3次元再構築 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: 学ぶパッシブCLARITY法によるマウス卵巣血管の3次元可視化技術。卵胞内毛細血管分布と細胞間の関係性を明らかにし、生殖生物学研究に貢献する革新的な組織透明化手法を解説します。

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本研究は、ポスドクの中国特別基金からの助成金によって支えられた (YF に号 2014T70392)、中国の国家自然科学基金 (YF に号 81673766)、新しい教師プライミング基金、復旦大学、Zuoxue 財団、開発上海ピーク分野統合医学 (20150407) のプロジェクト。

動物を対象とするすべてのプロシージャ上海医科大学、復旦大学 (承認番号 20160225-013) の動物倫理委員会のガイドラインに従った。
1. 透明なマウス卵巣の準備
<ol><li>
溶液の調製
	<ol>
<li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ソリューション (1 M、pH 7.6) 0.1% 準備トリトン X-100 (pbst;)。10 x PBS 原液 1 リットルを作るためには、87 g の塩化ナトリウム、NaH2PO4 · 3.1 g を混ぜる2 H2O、および Na2HPO4 ·12H2O. 28.7 g dH2O に 1 L 攪拌 ~ 2 h. 調整 pH 7.4 に 1 N naoh を追加し、常温で保存します。1/10 この 10 倍原液を希釈 dH2O を使用し、0.1% トリトン X-100 PBS で。</li>
		<li>混合 (wt/巻) 4% パラホルムアルデヒド (PFA) ソリューション、4% (重量/巻) アクリルアミド、0.05% (重量/巻) bisacrylamide、ダブル蒸留水氷の上の 0.25% (重量/巻) VA 044 イニシエーターによるゲル溶液 (pH 7.5) を準備します。</li>
		<li>4% (重量/巻) ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) 二重蒸留水に 200 mM ホウ酸ナトリウム緩衝を混ぜてクリア ソリューション (Ph8.5) を準備します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transcardial 血流と卵巣の準備
	<ol>
<li>すべてのプロシージャの間に氷の上のすべてのソリューションをしてください。</li>
		<li>ペントバルビ タール (0.35 mg/kg) ソリューションの腹腔内注入成人女性野生型 c57bl/6 マウスを麻酔します。それはつま先ピンチの応答を示しています、一度マウスに麻酔がかかる適切。</li>
		<li>フラットの発泡ボードを伸ばして手足でマウスを固定する粘着テープを使用。</li>
		<li>ハサミで胸、肌や骨を剣状突起上を切開すること、心臓を公開します。</li>
		<li>動物の右房切開を行い、20 ml 10ml/分で冷たい 1 × PBS の左心室を灌流します。</li>
		<li>少なくとも 20 ml ゲル液 10 mL/分での動物を灌流します。</li>
		<li>ハサミには、全体の enterocoelia を公開している medioventral ラインに沿って腹部の皮膚を切開し、腸を削除します。卵巣の形態の整合性を維持するために子宮と卵巣を収集します。</li>
		<li>顕微鏡下で卵巣の周りの脂肪組織を削除します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
脱ガス
	<ol>
<li>3 日間の固定のための 4 ° C で 10 mL ゲル ソリューションに卵巣を配置します。</li>
		<li>5 mL チューブに卵巣を転送し、ハイドロゲル ソリューションとチューブを入力します。チューブの上にパラフィルムをストレッチし、管の首にパラフィルムをラップします。 注意: は、パラフィルムとハイドロゲル ソリューションの泡がないことを確認します。</li>
		<li>37 ° C で重合するハイドロゲルを許可する 3 h の最大のためのインキュベーターのシェーカーにチューブを置きます。</li>
		<li>ヘラを使用してゲルから卵巣を削除、ティッシュ ペーパーで卵巣の周りから余分なゲルを注意深く取り外します。1x PBS で 4 回卵巣を洗います。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
パッシブ クリア
	<ol>
<li>クリア溶液 10 mL で卵巣が水没します。消去プロセスを開始する 37 ° C で 80 rpm で軽く振る。</li>
		<li>最初の週に 3 日おきにソリューションを変更します。卵巣まで週が明確になったら、一週間後クリア ソリューションを更新します。通常このプロセスは、約 2-3 週間かかります。 注: 卵巣 immunostained を直接することができます。 またはに格納できるアジ化ナトリウム (0.02%) PBS の 4 ° C で免疫染色の前に数週間。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 免疫染色
<ol><li>Pbst; で 2 回シェーカーで 37 ° C で 1 日目に卵巣を洗います。</li>
	<li>37 ° C で 2-3 日目の主な抗体/PBST ソリューション (表 1) にシェーカーで卵巣を孵化させなさい血小板内皮細胞接着分子 1 (CD31) をされた一次抗体をここで提示する仕事でチロシン水酸化酵素それぞれ 1:10 と 1:50 PBST で希釈します。 注意: 一次抗体の 2 つ以上の種類を使用している場合は、別の動物の源があるを確認します。</li>
	<li>シェーカーで 4 日目に 37 ° C で PBST バッファーと一次抗体を洗浄します。</li>
	<li>シェーカーで 37 ° C で 5 - 6 日目 PBST 目的の二次抗体と卵巣を孵化させなさい。ここで紹介する作業、二次抗体はチロシン水酸化酵素と 1:50 PBST 内で希釈した CD31 の Alexa 小麦粉 594 が Alexa 小麦粉 488 とだった。</li>
	<li>シェーカーで 7 日で 37 ° C で PBST バッファーと二次抗体を洗浄します。</li>
	<li>屈折率マッチング ソリューション 8 日目に屈折率の均質化のために組織を転送します。目盛線目盛線を見ることができるかどうかを確認することでその映像の明瞭さをチェックすると紙の上には、組織を置きます。組織が完全に明らかにされて、一度はイメージすることができます。</li>
	<li>作ることをちょうど囲むパテ シリンダー、組織とし馬蹄形に形状、密閉された空間を作るためにスライド ガラスにしっかりと外縁隆起帯を押します。パテの高さは卵巣より少し背が高いはずです。</li>
	<li>パテの中心に明らかに卵巣を慎重に配置し、屈折率整合ソリューションを追加します。しっかりとパテの上にガラス底皿を置くし、お皿を修正するためパテを使用します。</li>
</ol>3. 共焦点顕微鏡
<ol><li>共焦点顕微鏡を用いたイメージング、「Ni E」パネルで (この場合 2.0 mm) の適切な作動距離で (この場合は水浸漬 25 X 対物レンズ、1.1 NA、2 mm WD) レンズを選択します。</li>
	<li>
「取得」パネルでチャンネル数を選択します。ここでは、3 つのチャンネルを使用します。
	<ol>
<li>まず、顕微鏡接眼レンズを通じてチェックすることによって組織をフィールドの中央に移動するのに「目ポート」タブと XY コント ローラー ジョイスティックを使用します。</li>
		<li>シャッター光を切って"HV (利得)"、「レーザー パワー」を調整する「ライブ」のタブをクリックし、"オフセット ' 各チャネル個別に。ハイパワー レーザーおよび HV より高い信号をもたらすし、高いオフセットがバック グラウンド ノイズを減らすことができます。</li>
		<li>適切な「スキャン サイズ」と「数」を選択します。スキャン サイズを 1024 x 1024 μ m2 4 ~ 8 のカウントを使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
「Z 強度補正」パネルで組織の深さを定義する画像品質を設定後、(で、組織の中心) 卵巣の最上位層のレンズを見つけるとトップ層の獲得を調整後、「プラス」をクリックトップにレイヤーを定義します。
	<ol>
<li>レンズを下に移動、適切な HV と組織の下のレーザー パワーを設定し、Z 強度補正テーブルに最低のレイヤー情報を追加します。「ND 取得」パネルで設定を同期するの"に ND"をクリックします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
「ND 取得」パネル、スキャン数のステップの最初のセット。その後、"Z"と「大きな画像」タブを選択します。
	<ol>
<li>接眼レンズを通して組織の可視化の助けを借りて、組織の境界線に従ってフィールドのサイズを定義する「大きな画像をスキャン」ウィンドウに移動します。スキャン領域 (「フィールド」) のサイズを入力し、10% と 15% 間の重複を選択して「ND 取得」パネルに戻ります。</li>
		<li>「実行 Z 補正」、ない「今すぐ実行」自動的に各レイヤーに適切な HV、レーザー出力とオフセットを設定し、画像を処理するのを待つをクリックしてします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 個別包とその血管の三次元
<ol><li>まず、ImageJ5を使用して、元の NIS ファイルを開きます。「イメージ」ボタンをクリックしてし、「色」と"分割チャンネル"を選択します。「ファイル」をクリックし、「名前を付けて保存」で「イメージ シーケンス」オプションを使用して tiff ファイル シリーズとしてチャンネルを個別に保存します。</li>
	<li>Imaris を使用すると、tiff ファイル シリーズのうちの 1 つを開きます。「編集」ボタンをクリックし、「チャンネルの追加」を選択してチャンネル残り部分を追加します。「ディスプレイの調整」タブでは、名前およびチャネルの色を変更できます。 されます組織の厚さは、「編集」下のドロップ ダウン リストで「イメージ プロパティ」パネルで修正される必要があります。</li>
	<li>最終のイメージと余分な部分の除去の 3 D のトリミング、"Edit"ボタンをクリックし、「トリミング 3 D」を選択します。フィールドのサイズは、枠線をドラッグして調整できます。</li>
	<li>
サーパス パネルにおけるフィラメント アルゴリズムを用いた船舶信号を再構築するには、新しいフィラメントを作成し、次へをクリックする「フィラメント」をクリックします。
	<ol>
<li>最大かつ最薄の直径を定義するために「スライス」パネルに移動しをトレース船を見つけます。容器の最大幅で 2 つの点を選択することにより、距離が自動的に「測定」パネルに表示されます。</li>
		<li>「サーパス」パネルに戻ると幅の測定値を入力次へをクリックして。</li>
	</ol>
</li>
	<li>開始とシード ポイントのしきい値を調整します。「カメラ」パネルで「選択」を選択します。自動的に作り出された球のいくつかが削除する場合は、shift キーを押し、ポイントをクリックします。「移動」を選択して、マウスを動かして、によってすべての正しいポイントが保持されている, し、次へをクリックを確認する構造を回転できます。</li>
	<li>局所的なコントラストの高いしきい値を選択し、[次へ] をクリックします。「検出の棘」を選択しないし、血管柱の再構成を完了する続行。色は、「カラー」タブをクリックしてして編集できます。再建されたフィラメントの「統計」パネルで統計データを抽出できます。[編集] パネルで余分な部分を削除できます。 注: 合計卵胞または濾胞壁のボリュームを測定するための他のアルゴリズムを使用できます。ここで紹介する作業、卵母細胞は両方の二次抗体の蛍光によって示されました。データ量が大きいためワークステーションのサーバーは、データ分析のため使用されました。</li>
</ol>5. 統計解析
注: ± 標準誤差を手段として、画像解析データが掲載されています。
<ol><li>独立したサンプルの t 検定を使用して卵胞の比較実行し、ピアソンの相関テストを使用して卵胞壁毛細血管の長さの相関係数を比較します。P の値設定 < 統計的有意性の制限と 0.05 です。</li>
</ol>

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

現在の研究では、毛細血管と個々 の発育卵胞の間の関係を評価するイメージング 3 D を提案する.筆者らは同じプロトコル9を使用して、大血管、毛包とそのままマウス卵巣内の卵胞の場所間の相互作用の役割を検討しました。パッシブわかりやすくアプローチでは、マイクロおよびマクロ生、卵胞形成、および黄体と卵胞だけでなくさまざまな発達段階で卵巣の建築を再建するための間の相互関係を検討することができました。
そのまま組織の 3次元画像データを取得するには、清算プロセスは、最初の重要なステップです。主な戦略は 2 つあります-脱水方法と受動的な明快さ10など、親水性試薬ベースのメソッド。脱水方法が頻繁に蛍光シグナルの低下につながる、しばしば有害有機廃液を作り出す、ので私達の注意に注力様々 な組織型の受動的な明快さ使用法のいくつかの手順を簡素化します。
清算プロセスの最初の重要な手順は、transcardial 血流です。灌、心臓の鼓動は、背景の蛍光性...

卵胞が卵巣の構造と機能の基本単位とその開発は、卵巣内にある血管に関連性の高い。血管は栄養と卵胞ホルモンと成長と1卵胞の成熟に重要な役割を担っています。
選択的血管マーカー、トランスジェニック マウス モデル、医薬品開発などの技術の組み合わせは、卵巣の血管網、血管新生、血管の機能に関する知識を増加しています。卵胞形成。卵巣は、卵胞発育と排卵の間に様々 な組織や血管のネットワークを改造するためにアクティブな器官と呼ばれます。サイズと血管の構造のようなアクティブな改造開発、採用に卵胞の生物学的機能に必要です。
卵巣のセクションおよび血管の反応を使用して従来の組織学的および組織計量方法は二次元 (2 D) 画像2に限定されます。三次元 (3 D) 再構成技術の発展に伴い、組織スライスの 2 D 画像を 3 D 構造に重ねることができますが、この方法はまだいくつかの制限を持って-微細構造の一部を破壊することが組織の区分、組織は、不足していると多くの労働力がスライスから得られた画像からの 3次元再構成の製作にかかわっています。全体組織 3 D 共焦点顕微鏡イメージングは、これらの制限の多数を克服できるがこれらのメソッドは萌芽期卵巣3における血管新生の評価に限定。生後および成体卵巣におけるこれらの問題を解決するために可視化されたボリュームを増やして全体ティッシュ クリア透明度4などのメソッドを使用して、このようなメソッドは任意の構造変形せず卵巣の光のクリアランスを提供します。そのまま卵巣の 3 D 構造のイメージングは、本作で使用されている Imaris ソフトウェア パッケージなどの画像解析ソフトウェアの正確な画像データベースを提供します。
動的な生理学的システムの一部である成人期にわたって卵巣の改造、これ卵巣血管新生の調節に調査のための優秀なモデル。さらに、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣癌などの女性生殖器系の病的な状態で卵巣血管の役割の評価は全卵巣組織イメージングを通じて学ぶことができます。パッシブのクラリティ法の開発と高度な画像解析ソフトウェアの使用は、血管や毛包などの卵巣構造の関係に関する詳細な空間情報を提供しました。

<table><tbody><tr><td>アクリルアミド</td><td>ベテック</td><td>v900845</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845</td></tr><tr><td>アレクサフラワー488(希釈1:50)&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>A11039</td><td>https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039</td></tr><tr><td>アレクサフラワー 594 (希釈率 1:50)</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>A11012</td><td>https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012</td></tr><tr><td>ビサアクリルアミド</td><td>アムレスコ</td><td>172</td><td>http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx</td></tr><tr><td>黒壁ガラス底皿 (Willco-Dish)</td><td>テッド ペラ</td><td>14032</td><td>http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall</td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>Sinopharm 化学試薬</td><td>10004818</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818</td></tr><tr><td>リン酸二ナトリウム 12 水和物 (Na2HPO4 12H2O)</td><td>Sinopharm 化学試薬</td><td>10020318</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318</td></tr><tr><td>FocusClear</td><td>Celexplorer</td><td>FC-102</td><td>http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td>http://www.parafilm.com/products</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sinopharm Chemical試薬</td><td>80096618</td><td></td></tr><tr><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618 PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10)</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html</td></tr><tr><td>PhotoInitiator VA044</td><td>Wako</td><td>va-044/225-02111</td><td>http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm</td></tr><tr><td>Na-Dide</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>シノファーム化学試薬</td><td>10019318</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318</td></tr><tr><td>リン酸二水素ナトリウム二水和物(NaH2PO4 2H2O)</td><td>Sinopharm化学試薬</td><td>20040718</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718</td></tr> ド<tr><td>デシル硫酸ナトリウム</td><td>Sinopharm化学試薬</td><td>30166428</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム(NaOH)</td><td>Sinopharm化学試薬</td><td>10019718</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sinopharm化学試薬</td><td>30188928</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928</td></tr><tr><td>チロシンヒドロキシラーゼ (TH, 希釈率 1:50)</td><td>Abcam</td><td>ab76442</td><td>http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html</td></tr></tbody></table>

受動的な明快さクリア マウス卵巣の血管の 3次元再構築

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

卵巣は、女性の生殖器系の主要な器官と雌性の配偶子の生産構造の複雑な関係との三次元 (3 D) 血管アーキテクチャが、内分泌系を制御するために不可欠です、卵巣は記述されていません。3 D の接続とそのまま卵巣の血管の構造を視覚化するために最初の重要なステップは、光学的に透明の卵巣をすることです。ヒドロゲルを用いて組織の収縮を避けるためには、受動的な明快さの固定ベース (アクリルアミド ハイブリダイズ リジッドのオフ脂質交換イメージング/染色/の場-交配-互換性のある組織ハイドロゲル) プロトコルをそのまま卵巣をクリアする方法.染色、高度な多光子の共焦点顕微鏡と 3 D 画像再構成それから卵巣の血管と濾胞性毛細血管の可視化のために使用されました。このアプローチを使用すると、有意な正の相関を示した (P < 0.01) 卵胞の毛細血管と卵胞壁量の長さの間。

我々 は受動的な卵巣の卵胞期と血管のアーキテクチャを維持すると、容器と包のラベル付きのマーカーからの最高の蛍光信号の取得をオフに迅速かつ簡単な方法にパッシブのクラリティ法を適応しました。卵胞血管の 3 D アーキテクチャは、CD31、内皮細胞6マーカーの免疫染色により決定されました。CD31 染色成体マウスの卵巣では卵胞の毛細血管とプライマリとセカンダリの卵胞 (図 1) との間の相互関係を示し, フィラメントのアルゴリズムを使用してトレースされました。
スポット変換と表面のアルゴリズムは、チロシン水酸化酵素 immunostained 卵母細胞と顆粒膜層を検出し、包7,8の総体積を計算する使用されました。卵胞の圧縮のためトリミン...

ここでそのままマウス卵巣における受動的な明快さと卵巣の血管と濾胞性毛細血管の可視化における 3 D 画像再構成法の適応を提案する.

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

このプロトコルの全体的な目的は、マウス卵胞における毛細血管分布の完全な三次元像を提供し、それらの相互関係を示すことです。卵巣は、生殖および内分泌学において不可欠な器官です。卵胞の各発達段階および体細胞の数を計測します。さらに、他の臓器とは異なり、卵巣では機能単位の反復的な分枝は見られません。局所の血管系は、神経系とともに、成人女性の各月経周期において大幅な変化を起こす可能性があります。卵巣にパッシブクリアリングを適用することで、卵巣内の細胞や卵胞の全体的な分布およびそれらの間の接続を観察することが可能になります。本手法の最大の利点は、卵巣への影響を最小限に抑えつつ、さまざまなマーカーの透過性を確保できることです。顕微鏡画像の再構成により、卵巣のマッピングを実現しました。血管、ニューロン、および卵胞の詳細な構造を明確に観察することが可能です。画像解析には、Imarisのいくつかのオプションを用いて、卵巣と各構造との関係を評価しました。論文の指示に従って灌流液を調製し、氷上で保持します。マウスを麻酔し、足先へのつまみ刺激に対して反応がないことを確認します。エタノールをスプレーし、右心房を切開した後、すぐに左心室に氷冷PBSを10ml/minの速度で20ml灌流し、血液を洗い流します。次に、同速度で冷 Hydrogel Solution を動物に灌流します。卵巣の形態学的完全性を維持するため、子宮と共に卵巣を回収します。分離した卵巣を冷やしたハイドロゲル溶液に移します。実体顕微鏡下で、卵巣周囲の脂肪組織を取り除きます。組織固定の結果を向上させるために、卵巣嚢を除去することを推奨します。卵巣をハイドロゲル溶液中で3日間保持します。3日後、卵巣をガラスチューブに移し、新鮮なハイドロゲル溶液をチューブに満たします。チューブの上部をパラフィルムで密閉し、さらにチューブのネック部分に別のパラフィルムを巻き付けます。パラフィルムとハイドロゲル溶液の間に気泡が入っていないことを確認します。ガラスチューブをシェーカーインキュベーターに設置し、ゲルが形成されるまで37 °Cで2時間静置します。ペーパーフィルターを用いて、卵巣周囲の余分なゲルを慎重に取り除きます。卵巣を15mlチューブに入れ、10mlの透明化溶液を満たします。チューブを37°Cのシェーカーインキュベーターに設置し、少なくとも2か月間保持します。透明化溶液は、最初の3日間は毎日、その後は卵巣が透明になるまで毎週交換してください。すべての免疫染色の手順は、シェーカーを用いて37 °Cで行います。まず、卵巣をPBSTで24時間洗浄します。次に、PBSTで希釈した一次抗体の中で卵巣を2日間インキュベートします。3番目に、PBST緩衝液で一次抗体を洗浄します。4番目に、目的の二次抗体を含むPBST中で卵巣を2日間インキュベートします。5番目に、PBSTで二次抗体を洗浄します。6番目に、RI均質化のために卵巣を屈折率整合溶液に移します。視覚的な透明度を確認し、卵巣が完全に透明化したらイメージングが可能です。まず、清潔なガラスボトムディッシュを準備します。パテで円筒を作り、それを馬蹄形に成形します。パテの外縁をガラススライドに強く押し付け、密閉空間を作ります。パテの高さは、卵巣よりもわずかに高くしてください。卵巣を慎重に中央に移動させ、封入剤を加えます。パテの上にディッシュを押し当て、2つのパテで固定します。卵巣のイメージング準備が整ったら、16倍レンズを装着したNikon共焦点顕微鏡を使用して撮影することができます。共焦点顕微鏡でイメージングを行うには、まずNi-Eパネルでレンズを選択します。撮影パネルでチャンネル数を選択してください。次に、接眼レンズで確認しながら、Eye PortタブとXYコントローラーのジョイスティックを使用して、組織を視野の中心に移動させます。次に、シャッターライトを消灯した後、ライブタブをクリックして、各チャンネルのレーザー出力、HV、およびオフセットを調整します。「Z Intensity Correction」パネルで最上層の取得設定を調整し、プラスボタンをクリックして最上部を定義します。その後、レンズを下方へ移動させ、組織の底部に対して適切なHVとレーザー出力を設定し、最下層の情報を追加します。「To ND」をクリックして、設定をパネルおよび取得条件と同期させます。また、「acquisition」において、まずスキャンステップ数を設定します。Zおよび拡大画像のタブをクリックします。次に、拡大画像スキャンウィンドウに移動し、組織の境界に合わせて視野サイズを定義します。3番目に、ND取得画面に戻り、スキャン視野のサイズを入力し、10%から50%の間でオーバーラップを選択します。その後、Z補正の実行をクリックし、イメージングプロセスが完了するまで待ちます。まず、Imagicを使用して元のNISファイルを開きます。Imageボタンをクリックして、色と表示チャンネルを選択し、次にFileからImage Sequencesを選択して、それぞれをtiffファイルとして保存します。次に、Imarisを使用してtiffファイルのいずれか1つを開きます。編集ボタンをクリックし、「チャンネル追加」を選択して残りのチャンネルを追加します。名前と色は表示調整で変更可能です。また、画像プロパティで組織の厚さを修正してください。次に、編集ボタンをクリックし、Crop 3Dを選択して不要な部分を切り出します。まず、フィラメントボタンをクリックして「次へ」をクリックします。スライスパネルに移動し、トレーシング容器と距離を確認した後、Surpassに戻り、静止値を入力して「次へ」をクリックします。次に、開始点とセットポイントのしきい値を調整します。カメラパネルで選択ツールを選び、Shiftキーを押しながらクリックして不要な部分を削除します。3番目に、最高しきい値を選択し、「次へ」をクリックします。検出ポイントを選択せずに次へ進んでください。不要な部分は編集パネルで削除できます。色は、色をクリックすることで編集可能です。CD31の免疫染色後、卵巣脈管の3D構造を解析しました。3D構造は、他のスライスを透過した断面として、またはボリュームレンダリングによる全体像として観察することが可能です。成体マウスの卵胞脈管におけるCD31染色を行いました。フィラメントによる毛細血管の再構築を通じて、個々の卵胞とその毛細血管との関係を示すことができました。女性の卵巣は常に活動的であり、絶えず変化しています。しかし、従来の組織学的解析には限界があるため、このような複雑な構成要素間の関係を記述することは非常に困難です。新しく開発されたパッシブクリアランス法は、光学的な障害を克服し、組織全体の完全性を維持し、機能的な手がかりを提供することに役立つ可能性があります。

three-dimensional-reconstruction-vascular-architecture-passive

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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受動的な明快さクリアマウス卵巣の血管の 3次元再構築

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