受動的な明快さクリア マウス卵巣の血管の 3次元再構築
2017年12月10日
ここでそのままマウス卵巣における受動的な明快さと卵巣の血管と濾胞性毛細血管の可視化における 3 D 画像再構成法の適応を提案する.
このプロトコルの全体的な目標は、マウス卵巣卵胞の毛細血管分布の完全な3次元ビューを提供し、それらの関係を示すことです。卵巣は、生殖および内分泌学において不可欠な器官です。卵胞と体細胞の異なる発達段階をそれぞれ数えます。
さらに、他の臓器とは異なり、卵巣は機能単位の繰り返しの分岐を示しません。局所血管系は、神経系と一緒にいる可能性があり、成人女性の各月経周期で大きな変化を経験することもできる。卵巣に受動的な透明度を適用すると、卵巣の細胞と卵胞の間の全体的な分布と接続を確認できます。
この尺度の1つの鍵のほとんどは、卵巣への影響が最も少なく、さまざまなマーカーのクリアを説明することです。顕微鏡画像の再構成を通じて、卵巣の地図を提供しました。血管、ニューロン、卵胞の一部の詳細をはっきりと観察できます。
画像解析では、イマリスのいくつかのオプションを使用して、卵巣と構造との関係を評価しました。記事の指示に従って豊富な溶液を調製し、氷の上に保ちます。マウスに麻酔をかけ、マウスにつま先のピンチ反応がないことを確認します。
エタノールをスプレーし、右心房を切開し、次に左心室に毎分10mlの速度で20mlの氷冷PBSを即座に大量に使用して血液を洗い流します。次に、同じ速度で動物を冷たいヒドロゲル溶液で大量に使用します。卵巣の形態の完全性を維持するために、卵巣と子宮を採取します。
分離した卵巣を冷たいハイドロゲル溶液に移します。.実体顕微鏡で卵巣の周りの脂肪組織を取り除きます。組織固定のより良い結果を得るために、卵巣滑液包の除去をお勧めします。
卵巣をハイドロゲル溶液に3日間保管します。3日後、卵巣をガラス管に移し、チューブに新鮮なヒドロゲル溶液を入れます。パラフィルムをチューブの上部に伸ばし、次に別のパラフィルムをチューブの首に巻き付けます。
パラフィルムとハイドロゲル溶液の間に気泡がないことを確認してください。ガラス管を摂氏37度のシェーカーインキュベーターに2時間置き、ゲルが形成されるまで待ちます。ペーパーフィルターで卵巣の周りの余分なゲルを慎重に取り除きます。
卵巣を15mlのチューブに入れ、チューブに10mlの清澄溶液を入れます。チューブを摂氏37度のシェーカーインキュベーターに少なくとも2か月間置きます。最初の3日間は毎日、その後は卵巣が透明になるまで毎週、クリアリングソリューションを交換します。
すべての免疫染色手順は、37°Cのシェーカーで行われます。まず、PBSTで卵巣を24時間洗います。2回目は、PBSTで希釈した一次抗体で卵巣を2日間インキュベートします。
第三に、一次抗体をPBSTバッファーで洗い流します。第四に、PBSTで目的の二次抗体と卵巣を2日間インキュベートします。第五に、二次抗体をPBSTで洗い流します。
第六に、卵巣を屈折率マッチング溶液に移し、RI均質化を行います。視覚的な透明度を確認し、卵巣が完全に明確になったら、画像化することができます。まず、きれいなガラス底皿を用意します。
パテシリンダーを作り、馬蹄形に形作ります。外縁をスライドガラスにしっかりと押し付けて、密閉されたスペースを作ります。パテの高さは卵巣より少し高いはずです。
卵巣を慎重に中央に移動し、取り付けソリューションを追加します。パテの上に皿を押し、2つのパテピースを使用して固定します。卵巣を画像化する準備ができたら、16倍レンズを備えたニコン共焦点顕微鏡を選択して画像化できます。
共焦点顕微鏡でのイメージングには、まずNi-Eパネルのレンズを選択します。パネル取得で、チャンネル数を選択します。まず、Eye PortタブとXYコントローラージョイスティックを使用して、顕微鏡接眼レンズによるチェックを通じて組織を被写界の中心に移動します。
次に、シャッターライトをオフにした後、ライブタブをクリックして、各チャネルのレーザー出力、HV、オフセットを調整します。パネルのZ強度補正で、最上層の画像取得を調整し、プラスボタンをクリックして上層を定義し、レンズを下に移動して適切なHVとレーザー出力を組織の底に設定し、最下層の情報を追加します。NDをクリックして、設定をパネルと同期させ、画像を取得しました。そして取得時には、まずスキャンステップ数を設定します。
Zのタブと大きな画像をクリックします。次に、スキャンの大きな画像ウィンドウに移動して、組織の境界に応じてフィールドのサイズを定義します。第三に、ND取得に戻ってスキャンフィールドのサイズを入力し、10〜50%以内のオーバーラップを選択します次に、[Z補正の実行]をクリックしてイメージングプロセスを待ちます。
まず、imagicを使用して元のNISファイルを開きます。画像ボタンをクリックし、色と表示チャンネルを選択してから、ファイルをクリックし、画像シーケンスを選択して、それらをtiffファイルとして個別に保存します。次に、Imarisを使用してtiffファイルの1つを開きます。
編集ボタンをクリックし、残りを追加するためのチャネルの追加を選択します。表示調整で名前や色を変更することができます。組織の厚さも画像プロパティで修正する必要があります。
第三に、編集ボタンをクリックして、余分な部分を切り取るために3Dを切り取ります。まず、フィラメントボタンをクリックして[次へ]をクリックします。スライスパネルに移動し、トレースベッセルと距離を見つけてから、Surpassに戻り、静電気を入力して[次へ]をクリックします。
次に、開始点と設定点のしきい値を調整します。カメラパネルで選択を選択し、Shiftキーを押しながらポイントをクリックして余分な部分を削除します。3 番目に、最も高いしきい値を選択し、[次へ] をクリックします。
検出ポイントを選択しず、次へ進んでください。余分な部分は編集パネルで削除できます。色をクリックすると色を編集できます。
卵巣血管系の3D構造は、CD31の免疫染色後に調査されました。3D構造は、スライスから他のスライスまで観察するか、ボリュームレンダリングを通じて全体的に観察することができます。CD31は、成体マウスの濾胞性血管系の染色が行われた。
フィラメントによる毛細血管の再構築により、個々の卵胞とその毛細血管との関係を示すことができました。卵巣は、女性のように、常に活発で交換可能です。しかし、従来の組織学的解析には限界があるため、このような複雑な構成要素間の関係を説明することは非常に困難です。
新たに開発された方法である受動的な明瞭さは、光学的障害を克服し、組織全体の完全性を維持し、機能的な手がかりを提供するのに役立つ可能性があります。
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概要
この研究は、マウスの卵巣の血管系と卵胞毛細血管を視覚化するための受動的CLARITY法の適応を提示します。このプロトコルは、卵巣卵胞内の毛細血管分布の包括的な三次元ビューを提供することを目的としています。
研究の主要な構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 生殖生物学
- 血管生物学
背景
- 卵巣は生殖と内分泌学において重要な役割を果たしています。
- 卵胞は様々な発達段階を経て、それぞれに特徴的な体細胞を持っています。
- 他の器官とは異なり、卵巣は機能単位の繰り返し分岐を示しません。
- 卵巣の血管系は、各月経周期の間に大幅に変化することがあります。
研究の目的
- マウスの卵巣卵胞における毛細血管の全体的な分布を視覚化する。
- 卵巣内の細胞と卵胞の関係を示す。
- 卵巣の血管形成とそれが生殖健康に与える影響についての理解を深める。
使用された方法
- 受動的CLARITY技術の適用。
- 卵巣血管系の三次元再構築。
- マウスの卵巣における卵胞毛細血管の視覚化。
- 卵胞と体細胞の異なる発達段階の数え上げ。
主要な結果
- 卵巣卵胞における毛細血管ネットワークの成功的な視覚化。
- 卵胞間の血管接続の詳細なマッピング。
- 卵巣血管系の動的な変化への洞察。
- 卵巣生物学に関する将来の研究のためのフレームワークの確立。
結論
- 受動的CLARITY法は卵巣の血管構造を効果的に明らかにします。
- このアプローチは卵巣機能と健康についての理解を進めることができます。
- 将来の研究はこれらの知見を基に生殖内分泌学を探求することができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Visualizing intact ovarian vasculature in 3D enables mechanistic de-risking of reproductive target hypotheses by clarifying structural relationships between follicles and their capillary networks. This approach supports predictive confidence in early discovery by providing quantitative, reproducible readouts of vascular architecture that can inform target validation and phenotypic screening workflows. The method addresses a key discovery-stage challenge: linking anatomical context to functional ovarian biology without tissue distortion.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping follicular capillary length to follicular wall volume, supporting functional target validation.
- Operational Value: Provides a standardized, shrinkage-minimized clearing protocol that preserves tissue integrity for reproducible vascular analysis.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking through quantitative correlation data (P<0.01) between capillary extent and follicular development.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated 3D vascular maps that serve as disease-relevant systems for assessing compound effects on ovarian microstructure.
- Operational Value: Enables assay standardization via consistent immunostaining (CD31), clearing, and imaging parameters across follicles.
- Scalability: Supports platform reuse through adaptable clearing and reconstruction workflows applicable to other endocrine tissues.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links discovery-stage vascular phenotypes to preclinical models by preserving native ovarian architecture for longitudinal study.
- Mechanistic De-risking: Clarifies neurovascular interactions in the ovary, reducing ambiguity in endocrine target pathways.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides structural biomarkers (e.g., capillary length, follicular volume) to inform go/no-go decisions in follicle-modulating programs.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis-driven analysis of vascular contributions to follicle maturation, supporting lead identification through phenotypic vascular profiling, and informing preclinical validation via intact tissue phenotyping.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of vascular regulators in follicle development through direct 3D visualization of capillary networks.
- Screening: Delivers assay-ready, cleared ovarian tissue with quantitative vascular outputs for compound screening campaigns.
- Analytics: Provides morphometric measurements (capillary length, follicular volume) and correlation statistics to enable comparative condition analysis.
- Translational Research: Maintains histological fidelity from discovery through preclinical stages by avoiding tissue sectioning artifacts.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable vascular mapping capability for endocrine and reproductive tissue atlases across discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity in ovarian vascular biology.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across labs via passive CLARITY’s minimal tissue perturbation.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of vascular-related follicle phenotypes, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on vascular-structural phenotypes in follicle cohorts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hydrogel-based tissue clearing, immunostaining, and multiphoton confocal microscopy.
- Depends on specialized instrumentation including shaker incubators, refractive index matching systems, and 3D reconstruction software (e.g., Imaris).
- Necessitates cross-team standardization of clearing duration, antibody validation, and imaging parameters for reproducible vascular quantification.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to non-ovarian tissues due to differences in density and lipid content.
- Limited by extended clearing timelines (up to two months) and the need for optimized antibody penetration in dense stromal regions.
