Name: 大腸菌の伝染性のバクテリオファージの合成による無細胞発現系 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: 学ぶ大腸菌由来無細胞転写翻訳系を用いたバクテリオファージの合成手法。ゲノム情報から感染性ファージを再構成し、合成生物学における分子自己集合メカニズムの解明に貢献する革新的な技術です。

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この材料は (v. n.) に海軍研究所受賞番号 N00014-13-1-0074 によってサポートされる作業に基づいて、人間科学フロンティア許可番号 RGP0037/2015 (砲兵/ベトナム) と二国間の科学技術振興財団 (v. n.) に 2014400 を与えます。

<ol><li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis%3A+Applications+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis: Applications come of age.</a> Biotechnol Adv. , (2011).</li>
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<li>Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+macromolecular+crowding+for+protein+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Implications of macromolecular crowding for protein assembly.</a> Curr Opin Struct Biol. 10 (1), 34-39 (2000).</li>
<li>Zimmerman, S. B., Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+crowding%3A+biochemical%2C+biophysical%2C+and+physiological+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Macromolecular crowding: biochemical, biophysical, and physiological consequences.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 22, 27-65 (1993).</li>
</ol>

著者宣言次競合金融利益のため: Noireaux 研究所は、MYcroarray、MYtxtl 無細胞タンパク質発現キットのディストリビューターから研究資金を受け取る。

次の陳らの手法14 SPMC、重複感染の適切な条件を決定する際の重要なステップは達されます。最も密接にホスト株の重複感染に耐える能力を制御するパラメーターは頻繁に感染しているバクテリオファージの初期濃度です。宿主細胞は、バクテリオファージの非常に少量の初期感染前に対数増殖期でなければなりません。最終的には、バクテリオファージはまた対数増殖を達するし、急速に各ホスト セルのバクテリオファージの複数のコピーを可能にする細胞数を凌駕するバクテリオファージの数字を許可すること。これは、それは換散を起こさない準安定状態に細胞を強制します。この状態に達していない場合、セルはカスケード、合流の換散を受けるのウイルス負荷がリリースされます。重複感染は、上記の初期ウイルス濃度を使用して到達できない場合、は、後続の試行をする前に 10 の要因によって感染の初期多様性を下げます。宿主細胞は、収穫前に溶解を行う重複感染が達していない場合は、すぐに別の精製法続行します。DNase を追加 5 μ g/mL と 500 μ L CHCl3すべて細胞換散を完成させるために。さらに...

過去 10 年間無料のセルの表現技術を創発的学際的な研究領域合成と定量的に関連する生物学の新しいアプリケーションに対応し設計されています。もともと独立した生きている有機体の蛋白質を表現するために使用、新しい携帯無料 TXTL システムは両方基本的な応用科学1、2、かなりこの技術の範囲を広げるために開発されています。TXTL プラットフォームの新世代はユーザーフレンドリーをできるように設計されている効率的 (到達するとバッチ モード3におけるタンパク質合成の 2 mg/mL) より転写4のレベルで汎用性とするようモジュールを簡単に統合自然小説または既存の生物学的システム5,6の機能を拡張する合成関数。特に、携帯無料 TXTL システムとなっている規制要素または小さな遺伝的回路7,8,9などの遺伝的プログラムのラピッドプロトタイピングの便利なデザイン、ビルド、テストを減らすことによって数日サイクルします。驚くことに、新しい TXTL システムは、coliphages10,11, アクティブなゲノムの再構成をサポートする十分な性能を示す強いの完全な合成など大規模な DNA プログラムを処理できます。DNA は、生き物のエンティティがエンコードされます。
TXTL システムは、従来の in vitro建設的な生化学的アッセイに比べて多くの技術的な優位性を提示します。携帯無料 TXTL は、遺伝子発現のプロセスを生きている細胞の複雑な細胞質とは対照的削減とオープン環境で最終製品にリンクします。TXTL では、DNA を利用して、現代 DNA のアセンブリ技術と手頃な価格、気難しいタンパク質精製工程を必要としないに加えて高速生化学システムの in vitro、再構成します。無細胞発現分子間相互作用12の深い郭清をできるように、生化学的な反作用の部品のほとんどへの直接アクセスを提供します。TXTL 反応では、生きている細胞ではほとんど不可能で生化学と生物物理設定変更できます。これらの利点と最近の改善を考えると、TXTL 技術、合成および量的な生物学の代替プラットフォームとして人気が高まってください。それは TXTL 反応の実行に関連する適切なプラクティスを開発するためにこのようなプラットフォームを使用する方法を理解する重要な TXTL を使用して、研究コミュニティは急速に成長しているし、TXTL は、バイオ エンジニア リングの標準的な技術になって、結果の解釈。
この記事での合成、ワンポット反応でバクテリオファージのゲノムから11、MS2 などすべてのエシェリヒア属大腸菌の TXTL システムを使用する方法について説明 (RNA、3.4 kb)、ΦΧ174 (ssDNA、5.4 kb)、および T7 (dsDNA、40 kb)。どのようにファージ量合成反応 (マグネシウムとカリウム濃度) の生化学的な設定の一部に関して変更を示します。ペグ範囲 8000 濃度をエミュレート分子クラウディング バクテリオファージ合成に劇的な効果は、桁違いです。同時に転写、翻訳のプロセスを要約、関連生物学および生物物理学の基本的な質問に対処するための興味深い自己集合、単一試験管反応でこのような大規模な生化学的なシステムの実現10 (遺伝子発現制御、自己集合), だけでなく、新しいナノ構造13を構築するバクテリオファージ関数情報の転用などのアプリケーションを開発します。TXTL の実用的なに加えて我々 はプラクの試金によってバクテリオファージ増幅、ゲノム抽出と精製・ ファージ定量化メソッドを提供します。本稿では提案手法はエシェリヒア属大腸菌の抽出による無細胞システムを使用し、バクテリオファージに興味がある者に適しています。
この作品で提示プロトコルはフォローとしてまとめることができます: 1) バクテリオファージ増幅 (日 1: 接種の準備細胞、2 日目: 単一のプラーク、複数のバクテリオファージの成長と濃度、および 3 日目: バクテリオファージの浄化)、2) 二重座礁させたゲノム DNA の抽出(フェノール/クロロホルム抽出)、3) 携帯無料ファージ反応と抗体実験 (日 1: 宿主細胞をプレートし、寒天プレートを作る 2 日目: 無細胞反応とホスト細胞の前培養と一日 3: ホスト細胞文化およびバクテリオファージ価)。

<table><tbody><tr><td>超遠心チューブ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>344057</td><td></td></tr><tr><td>コニカルチューブ</td><td>ファルコン</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>グラジエントメーカー</td><td>バイオコンプ グラジエントマスター</td><td>アナル生化学を見る 1985年7月;148(1):254-9。</td><td></td></tr><tr><td>シリンジと鈍いカニューレ</td><td>Monoject</td><td>8881513918と888202017</td><td></td></tr><tr><td>ワイドボアピペットチップ</td><td>Fischerbrand</td><td>02-707-134</td><td></td></tr><tr><td>プラークカウンター</td><td>ニューブランズウィック科学</td><td>コロニーカウンター モデルC-110</td><td></td></tr><tr><td>培養チューブ</td><td>Fischerbrand</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>無細胞システム</td><td>Mycroarray Inc</td><td>Mytxtl</td><td></td></tr><tr><td>BioComp グラジエントマスター</td><td>BioComp インスツルメン</td>ツ <td>モデル 105ME</td><td></td></tr><tr><td>LB 寒天プレートレシピ</td><td></td><td></td><td>25 g/L Luria-Bertani 培地 (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents 製品番号 BP1426) および 15 g/L Bacto-Agar 固体 (Brenton, Dickenson and Company - 製品番号 214010)。</td></tr></tbody></table>

大腸菌の伝染性のバクテリオファージの合成による無細胞発現系

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

試験管反応の基礎および応用科学を実行する新しい機能を提供するより汎用性とモジュール性、エンジニア リング、無細胞転写・翻訳 (TXTL) システムの新世代。過去 10 年間携帯無料 TXTL 斬新な学際的な研究領域定量と合成に関連する生物学の広い範囲のための強力な技術となっています。新しい TXTL プラットフォームは、構築し、合成又は天然の遺伝子回路の実施により生化学システムを尋問すると特に便利です。体外TXTL 実証されています急速にプロトタイプ規制要素と生物学的ネットワーク同様に要約として便利な分子の自己組織化メカニズムは、生活システム。この資料でどのように伝染性のバクテリオファージ、MS2 (RNA)、ΦΧ174 などを述べる (ssDNA) および T7 (dsDNA) 完全すべて大腸菌、無細胞 TXTL 系を用いたワンポット反応で彼らのゲノムから合成されます。3 つの coliphages の合成は、プラクの試金を使用して定量化されます。どのように合成バクテリオファージの収量反応の生化学的設定に依存を示します。ペグの 8000 系の制御された濃度をエミュレート分子クラウディング大きさの命令によって合成されたファージの量に影響します。バクテリオファージを増幅する方法と彼らのゲノムを浄化する方法について述べる。プロトコルとこの作品で示された結果のセットは無細胞合成生物学と工学の学際的な研究者に関心のはずです。

4 つの代表的な結果を示します。図 1、携帯無料 TXTL システムとファージ DNA 株式はリビングで汚染されないように否定的なコントロールのセットを提案するエシェリヒア属大腸菌のセル。我々 はそのまま大腸菌の無細胞 TXTL システムが無いことを確認 (図 1A 図 1B) の genomic DNA の void 両方非培養し、, 反応溶液をめっきを用いた細胞の汚染。携帯無料 TXTL システムは、大腸菌に汚染されていた場合、成長はプレートに祝われるでしょう。さらに、我々 は無細胞反応、したがってない任意の汚染物質の細胞が非培養と培養反応 (図 1Cと<strong class...

無細胞転写・翻訳プラットフォームの新世代は、生化学システムの in vitro遺伝子回路の実行を構築するために設計されています。この記事で私たちはすべて大腸菌無細胞 TXTL システムを使用して彼らのゲノムからのバクテリオファージ MS2、ΦΧ174、T7 などの合成方法について説明します。

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

この実験の全体的な目的は、すべてE.coliを用いた無細胞転写翻訳系を用いて、バクテリオファージがそのゲノムからどのように合成されるかを記述することです。この手法は、生体系における分子自己組織化メカニズムの解明など、合成生物学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。この技術の主な利点は、プラットフォームの汎用性にあります。多くの生物学的システムは、実験的解析のために完全に再現し、微調整することが可能です。本手順を開始する前に、テキストプロトコルに記載されている通りにファージプラークを調製してください。滅菌済みのパストゥールピペットの先端を用いて、単一のプラークをコアリングして採取します。プラークを希釈細胞中に吹き込みます。その後、37 °Cで2時間インキュベートします。完全な感染を確認するには、500 µLのサンプルを1.5 mLチューブに取り、10 µLのクロロホルムを加えます。混合物を直ちに高速でボルテックスし、溶液が透明になるか（ファージ感染を示す）を確認します。細胞が完全に感染した後、さらに2時間インキュベートします。次に、DNaseを添加し、8,000 ×g、4°Cで細胞を遠心分離します。上清を捨て、ペレットを10 millilitersの1X Tris magnesium chlorideに再懸濁します。500 microlitersのクロロフォームを加え、高速でボルテックスして細胞を溶解させます。4°Cで10分間、12,000 ×gで遠心分離して清澄化します。次に、上清を15 mLコニカルチューブに分注し、4°Cで保存します。4本の超遠心管に45% sucroseを2.5 mLずつピペッティングし、5～45% sucrose勾配を4本作成します。その上に5% sucroseを約2.6 mL加え、液面がチューブの縁から2 mmの位置に達したところで停止させます。グラジエント形成装置を用い、チューブを86度の角度で23 RPMにて43秒間回転させ、グラジエントを混合します。1 mL ピペットを使用して、プールしたファージ懸濁液 500 µL を添加します。この際、チップを液面に接触させ、ショ糖密度勾配の上部に非常にゆっくりと分注し、急速なピペッティングによって混合されないように注意してください。4 °Cで70,000 ×gにて20分間遠心分離します。鈍端カニューラを溶液に浸し、先端がファージバンドの最上端の中央に位置するようにします。シリンジのプランジャーを引いて、ファージバンドの大部分が除去されるまで吸引します。その後、ファージ懸濁液を含むショ糖溶液を3本または4本の超遠心管に分注します。チューブの上端から3〜4 mmのところまで、冷やした1XTMを満たします。チューブをパラフィンフィルムで密閉し、転倒混和します。チューブを再び超遠心機にセットし、4°Cで145,000 ×gにて1時間遠心分離します。上清を速やかに捨て、ディスポーザブルワイプの上で逆さまにして水気を切ります。すべてのペレットに200から400 µLの冷えた1XTMを分注し、4 °Cで一晩再懸濁させます。振盪は不要です。タイターを測定する前日に、10 millilitersのLB成長培地でE.coli宿主細胞の培養液を調製し、250 RPM、37 degrees Celsiusに設定した振盪インキュベーターで一晩培養します。次に、14 milliliterの培養チューブに、5.25 millilitersのトップアガー、220 microlitersの希釈済みファージサンプル、および50 microlitersの宿主細菌細胞をピペッティングしてマスターミックスを調製します。培養チューブにキャップをし、高速でボルテックスします。37°Cのインキュベーターから培養プレートを2枚取り出します。次に、1枚目のプレートの中央にマスターミックスを2.5 mLゆっくりと加えます。プレートを手でそっと回転させ、マスターミックスを培養プレート全体に均一に広げます。トップアガーが完全に凝固するまで20分間待機します。プレートを37 °Cで4〜7時間インキュベートします。プラーク数を計測し、各反応サンプルのファージ濃度を決定します。ファージストックの一部を、新しい1.5 milliliterチューブ内で1XTMバッファーを用いて400 microlitersに希釈します。この希釈液に同量のTrisフェノールクロロホルムを加えます。混合液をラボラトリーロッカーで、または手で5分間緩やかに振盪します。その後、得られたエマルションをベンチトップ遠心分離機で17,000 ×gで5〜10分間遠心分離します。界面を乱さないように注意しながら、上層の水相を新しいチューブに移します。これらの手順をさらに2回繰り返し、計3回のフェノール抽出を行います。水相を新しいチューブに移し、等量のクロロフォームを加えます。振盪および遠心分離を行い、水相のDNAサンプルを清潔なチューブに移します。次に、3 M 酢酸ナトリウムを0.4容量分、および95% ethanolを3容量分加えます。チューブを-20°Cのフリーザーに置き、一晩静置して沈殿させます。ベンチトップ遠心機を用い、17,000 ×gで10〜15分間遠心分離します。デカンテーションまたはピペッティングにより、上清を除去して廃棄します。次に、70% ethanolを500 µL加え、ペレットがチューブの底から離れて浮き上がるまでチューブを静かに振ります。遠心分離後、ペレットを乱さないように注意しながら、ethanolを除去して廃棄します。前述と同様にethanolを加えて遠心分離した後、再度ペレットを乱さないように注意しながら、2回目にethanolを除去して廃棄します。ペレットをベンチトップで30〜60分間、風乾させます。乾燥後、ペレットに50 µLの二回蒸留水を加え、室温で1時間、または4 °Cで一晩インキュベートして再懸濁させます。280 nmでの吸収測定を用いてDNA濃度を決定します。無細胞反応を行うには、粗抽出液の規定量（最終反応液量の33%）をマイクロ遠心チューブに分注します。テキストプロトコルに記載されている通りにマスターミックスを調製します。粗抽出液に各コンポーネントの適切な量を加えます。最後の成分を加えた後、ボルテックスミキサーで攪拌して反応液を均質化します。次に、マスターミックスをn本のマイクロ遠心チューブに分注します。続いて、マスターミックスの各チューブに、指定された量の変動成分を加えます。ボルテックスにかける前に、各反応液に水を加え、目的の最終反応量にします。その後、マイクロ遠心チューブを29°Cで少なくとも8時間、または一晩インキュベートします。テキストプロトコルに従ってファージタイター用の細胞を調製した後、このビデオで先に示した方法で、最終的な細胞除去済み反応LB溶液のタイターを測定します。ここでは、phi X 174ファージを合成する無細胞反応の代表的な結果を示しています。このファージプラークは、適切な希釈倍率でタイター測定が行われた成功したファージ反応を示しており、プラークの数が計数可能であることからそれが分かります。しかし、反応によるファージ収量に対して希釈倍率が低すぎると、成功した反応であっても適切に表示されない場合があります。このプレートには、数え切れないほどのプラークが認められます。ここでは、培養プレートの温度の事前平衡化が不十分であったため、ファージプラークの分布が不均一になっているプレートを示しています。ファージタイターの測定中に、プレートの右下部分で反応液が凝固しました。分子混雑条件は、phi X 174およびT7のファージ合成に強い影響を及ぼします。特に、PEG濃度が4% w/vから2% w/vに低下すると、T7のファージ収量は3桁減少します。適切に実施されれば、ファージ精製とDNA抽出は習得後に2日間で完了させることができます。問題がなければ、セルフリー反応はわずか数時間で終了します。このビデオを視聴することで、ファージの培養、DNAの抽出および精製、そしてその結果を用いて無細胞反応系により完全な感染性ファージを再構成する方法について、十分に理解できるはずです。フェノールを取り扱う際は極めて危険が伴うため、本手順の実施には白衣、保護眼鏡、手袋などの予防策を講じる必要があります。フェノールを含む開放容器を用いたすべての作業は、ドラフトチャンバー内で行ってください。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

この記事では、バクテリオファージラムダの感染の蛍光標識されたバージョンを準備する手順を説明します...

細胞運命を以下に<em&gt; E大腸菌の</emラムダファージによる感染後&gt;

Source: Rustad, M., et al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the synthesis of bacteriophages using a cell-free transcription–translation (TXTL) system. A master mix is prepared using a bacterial crude extract, an energy mix, an amino acid mix, an inhibitor for a DNA-degrading enzyme, and bacteriophage DNA, then incubated. The in vitro molecular machinery enables viral protein expression and DNA...

Bacteriophage Synthesis Using a Cell-Free Transcription-Translation System

Source: Rustad, M. et al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the amplification and recovery of infectious bacteriophages from E. coli cultures. It outlines the steps for plaque isolation, phage replication, controlled lysis, and purification.

Amplification and Recovery of Infectious Bacteriophages

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp.(2018)This video demonstrates preparation of a bacteriophage lysate containing transducing particles. A donor strain is infected, plaques form, and the soft agar overlay is processed with chloroform to yield a clarified lysate for downstream analysis.

Preparation of Bacteriophage Lysate for Generalized Transduction

この5日間のプロトコルは、すべての手順、機器、およびベースの効率的な内在大腸菌ゼロからTX-TLの無細胞発現系を作成し、実行するために必要な追加ソフトウェアの概要を説明します。試薬を用いて、プロトコルは8セットアップ時間以下の反応、収集、およびプロセスデータをとる。...

実装するためのプロトコルエシェリヒア·コリに基づくTX-TLの無細胞発現系

このプロトコルの詳細手順、コスト、および大腸菌を生成に必要な装置・細胞抽出液をベースし、4 日間以内の in...

大腸菌の無細胞タンパク質合成のベース: 堅牢な柔軟性とアクセス可能なプラットフォーム技術のためのプロトコル

このプロトコルは、RNAおよびタンパク質生産合成細胞のボトムアップ調製のための方法、材料、装置およびステップを記述する。合成細胞の内部水質コンパートメントには、脂質二重層内に封入されたS30細菌リセート(すなわち、安定リポソーム)を含み、油中水エマルジョン移動法を用いた。...

細胞を含まない細菌抽出物、リポソーム、エマルジョン移動を用いた合成細胞の調製

この記事では、アルカリホスファターゼ結合ScFv D11抗体を使用した免疫蛍光法による組織内のイソレブグランジンの測定のための詳細な方法論を提供します。マウスとヒトの両方の高血圧モデルは、組織サンプル中のイソレブグランジン測定に関連する段階的な手順と基本原理を説明するために使用されます。...

D11 scFv-アルカリホスファターゼ融合タンパク質と免疫蛍光を用いた組織中のイソレブグランジンの直接検出(英語)

細菌に感染するウイルスであるバクテリオファージ(ファージ)は、腸内細菌叢の不可欠な構成要素です。これらの共生生物は細菌の適応度と個体群動態を促進しますが、腸の恒常性や疾患にどのような影響を与えるかについてはほとんどわかっていません。このプロトコルは他のバクテリオファージ細菌の組に適応可能なマウス...

マウス腸におけるT4バクテリオファージと 大腸菌 の相互作用:宿主-バクテリオファージ動態をIn vivoで研究するためのプロトタイプモデル

このプロトコルは、合成細胞の構築に使用される無細胞タンパク質合成(CFPS)システムについて説明しています。主要なステージの概要と、さまざまなマイクロコンパートメントでの代表的な結果を示します。このプロトコルは、合成細胞コミュニティの多様な研究室のベストプラクティスを確立し、合成細胞開発の進歩を促進することを目的としています。...

合成細胞を構築するための無細胞タンパク質合成システム

本プロトコルは、カチオン性ペプチドMel4およびペプチド模倣RK758の抗菌活性および細胞毒性の産生および評価方法を記述しています。化学合成、組換え発現、標準化された機能的アッセイを統合することで、ペプチドおよび小分子模倣者の生産と試験の効率的なワークフローを提供します。...

抗菌ペプチドおよびその模倣体の生産と試験

学ぶ大腸菌由来無細胞転写翻訳系を用いたバクテリオファージの合成手法。ゲノム情報から感染性ファージを再構成し、合成生物学における分子自己集合メカニズムの解明に貢献する革新的な技術です。

大腸菌の伝染性のバクテリオファージの合成による無細胞発現系

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