大腸菌の伝染性のバクテリオファージの合成による無細胞発現系

この実験の全体的な目標は、全大腸菌の無細胞転写翻訳システムを使用して、バクテリオファージがゲノムからどのように合成されるかを説明することです。この手法は、生体内の分子自己組織化メカニズムの解明など、合成生物学分野の重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、プラットフォームの汎用性です。

多くの生物学的システムは、実験分析のために完全に再現し、微調整することができます。この手順は、テキストプロトコルに記載されているファージプラークの調製から開始します。滅菌パスツールピペットの端を使用して、1つのプラークをコアリングして除去します。

希釈した細胞にプラークを吹き込みます。その後、摂氏37度で2時間インキュベートします。完全な感染をテストするには、500マイクロリットルのサンプルを1.5ミリリットルのチューブに取り込み、10マイクロリットルのクロロホルムを追加します。

直ちに混合物を高速でボルテックスし、溶液が明確になるかどうか、つまりファージ感染を示すかどうかを観察します。細胞が完全に感染したら、さらに2時間インキュベートします。次に、細胞を8, 000倍gおよび摂氏4度で遠心分離する前にDNaseを添加する。

上清を捨ててから、ペレットを10ミリリットルの1X Tris塩化マグネシウムに再懸濁します。500マイクロリットルのクロロホルムとボルテックスを高速で加えて細胞を溶解します。12, 000倍gで4°Cで10分間遠心分離して清澄

次に、上清を15ミリリットルの円錐形のチューブにデカンプし、摂氏4度で保存します。2.5ミリリットルの45%スクロースを4本の超遠心チューブにピペットで移し、5〜45%スクロースのグラジエントを4本調製します。約2.6ミリリットルの5%スクロースを層の上に置き、液体がチューブの縁から2ミリメートルに達すると停止します。

グラジエント形成装置を使用して、86度と23RPMで43秒間、チルトチューブ回転によりグラディエントを混合します。1ミリリットルのピペットを使用して、先端を液体表面に接触させ、スクロース勾配の上部に非常にゆっくりとボリュームを分注することにより、プールされたファージ懸濁液を500マイクロリットル追加します。摂氏4度で20分間、70, 000倍gで遠心分離します。

先端がファージバンドの最上端の中心に来るまで、鈍いカニューレを溶液に浸します。ファージバンドの大部分が取り除かれるまで、シリンジプランジャーでバンドを取り外してください。次に、懸濁したファージを含むスクロース量を3本または4本の超遠心チューブに加えます。

チューブの上部から3〜4ミリメートルまでチューブを冷たい1XTMで満たします。チューブをパラフィンフィルムで覆い、反転させて混合します。チューブを超遠心分離機に戻し、摂氏4度で1時間145, 000倍のgで過ごします。

上澄みをすばやく注ぎ取り、使い捨てワイプで逆さまに排出します。200〜400マイクロリットルの冷たい1XTMをすべてのペレットに分割し、摂氏4度で一晩再懸濁します。振る必要はありません。

力価を作製する前日に、10ミリリットルのLB増殖培地で大腸菌宿主細胞の培養物を調製し、培養物を250RPMおよび摂氏37度に設定された振とうインキュベーターに一晩放置します。次に、5.25ミリリットルのトップ寒天培地、220マイクロリットルの希釈ファージサンプル、および50マイクロリットルの宿主細菌細胞を14ミリリットルの培養チューブにピペッティングしてマスターミックスを調製します。培養チューブとボルテックスに高速でキャップをします。

摂氏37度のインキュベーターから2つの培養プレートを取り出します。次に、2.5ミリリットルのマスターミックスを最初のプレートの中央にゆっくりと加えます。プレートを手でゆっくりと回転させて、マスターミックスが培養プレート全体に広がるように均等に分散させます。

20分待って、上部の寒天が固まることを確認します。プレートを摂氏37度で4〜7時間インキュベートします。プラークをカウントし、各反応サンプルのファージ濃度を決定します。

ファージストックの一部を、新しい1.5ミリリットルチューブ内の1XTMバッファーで400マイクロリットルに希釈します。希釈液に等量のトリスフェノールクロロホルムを加えます。混合物を実験室のロッカーで、または手で5分間静かに振ってください。

次に、得られたエマルジョンをベンチトップ遠心分離機で17,000倍gで5〜10分間遠心分離します。上部の水相を新しいチューブに移し、相間境界を乱さないように注意してください。これらの手順をさらに2回繰り返して、合計3回のフェノール抽出を行います。

水相を新しいチューブに移し、等量のクロロホルムを加えます。水性DNAサンプルをきれいなチューブに移す前に、振とうして遠心分離します。次に、0.4容量の3モル酢酸ナトリウムと3容量の95%エタノールを追加します。

チューブをマイナス20°Cの冷凍庫に入れて、一晩降水させます。ベンチトップ遠心分離機で17, 000倍gで10〜15分間遠心分離します。上清をデカンテーションまたはピペッティングして除去し、廃棄します。

次に、500マイクロリットルの70%エタノールを追加し、ペレットがチューブの底から浮かぶまでチューブを静かに振とうします。遠心分離後、ペレットを乱さないように注意しながら、エタノールを取り出して廃棄します。エタノールを添加して前回と同様に遠心分離した後、ペレットを乱さないように注意しながら、もう一度エタノールを取り出して廃棄します。

ベンチトップでペレットを30〜60分間風乾します。乾燥したら、ペレットに50マイクロリットルの再蒸留水を加え、室温で1時間インキュベートするか、摂氏4度で一晩インキュベートして再懸濁します。280ナノメートルの吸収測定を使用してDNA濃度を決定します。

無細胞反応を行うには、最終反応量の33%にあたる指示量の粗抽出物を微量遠心チューブに分注します。テキストプロトコルに記載されているようにマスターミックスを準備します。各成分の適切な量を粗抽出物に加えます。

最後の成分を添加した後、ボルテックスにより反応を均質化します。次に、マスターミックスをn本の微量遠心チューブに分割します。次に、指定された可変成分の体積をマスターミックス配列に追加します。

ボルテックスする前に、各反応に水を加えて、目的の最終反応量に到達します。次に、微量遠心チューブを摂氏29度で少なくとも8時間または一晩インキュベートします。テキストプロトコルに記載されているようにファージ力価測定用の細胞を調製した後、このビデオで前述したように、最終的な無細胞反応LB溶液を力価で測定します。

ここに示されているのは、phi X 174ファージを合成した無細胞反応の代表的な結果です。このファージプラークは、適切な希釈で力価を付けた成功したファージ反応を示しており、これはプラークの数え切れない数によって明らかです。しかし、希釈係数が反応のファージ収率に対して低すぎる場合、成功した反応はあまり現れない可能性があります。

このプレートには、数え切れないほどのプラークが描かれています。ここに示されているのは、培養プレートの温度の事前平衡化が不十分なためにファージプラークの分布が不均一であるプレートです。ファージ力価の間、培養プレートはプレートの右下部分で反応を固化させた。

分子の混雑条件は、phi X 174のファージ合成に強い影響を及ぼし、特に、PEG濃度が体積で4 T7.In 2%に低下すると、T7のファージ収量は3桁低下します。一度マスターすれば、適切に行えば、ファージの精製やDNA抽出は2日で行うことができます。無細胞反応は、問題がなければわずか数時間で完了します。

このビデオを見れば、ファージを増殖させ、そのDNAを抽出して精製し、その結果を用いて無細胞反応システムを用いて完全感染性ファージを再構成する方法を十分に理解できるはずです。フェノールの取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には、白衣、目の保護具、手袋などの予防策を着用する必要があります。フェノールの開いた容器でのすべての作業は、ヒュームフードで行う必要があります。