ラミニン521マトリックスを用いたヒト誘導多能性幹細胞の統合された誘導

このプロトコルの全体的な目標は、均質なヒト誘導多能性幹細胞を誘導することです。この方法は、疾患モデリング、薬物スクリーニング、または前臨床細胞療法試験のための細胞の誘導など、多くの目的でヒト人工多能性幹細胞を導出するために使用できます。このプロトコールの利点は、堅牢で均質な細胞を生成し、ユーザーフレンドリーでXenoフリーで、完全に化学的に定義された培養システムで維持できることです。

ヒトiPS細胞は、ドナー組織の遺伝的背景を再現し、疾患に関連するあらゆる細胞タイプに分化できる可能性があるため、論文モデリングのための優れたツールを提供します。生検の解剖とコロニーピッキングは複雑な手順です。経験豊富な手でそれらが実行されるのを見ることは、手順の理解を助け、繰り返しやすくなります。

本日は、カロリンスカ研究所のiPSコア施設の経験豊富なラボ技術者であるハリエット・ロンホルムとケリー・デイが、その手順を実演します。皮膚生検サンプルは、PBSと1%ペニシリンストレプトマイシンを添加して摂氏4度で最大48時間保存できますが、取得後はできるだけ早く処理する必要があります。.生検を35ミリメートル皿に移します。

皮膚生検を2ミリリットルの70%エタノールを含む35ミリメートルの皿に30秒間浸します。1%ペニシリンストレプトマイシンを補充した滅菌ハンクバランスソルト溶液を1ミリリットル新しい35ミリメートル皿に加え、生検を新しい皿に移します。.生検を、新たに調製した0.1%ジスパーゼ溶液1ミリリットルで満たされた4つの35ミリメートル皿に移します。

滅菌済みの外科用メスと鉗子を使用して、皮膚生検を1〜2立方ミリメートルに切断します。ディスパーゼ溶液を含む生検片を15ミリリットルのチューブに移し、さらに2ミリリットルのディスパーゼを追加します。35ミリメートル皿を1ミリリットルのディスパーゼ溶液ですすぎ、すすぎた溶液を15ミリリットルのチューブに移します。

生検を摂氏4度で一晩インキュベートします。翌朝、4ミリリットルの0.1%コラゲナーゼIを生検片と一緒にチューブに加え、摂氏37度で4時間インキュベートします。細胞を播種する30分前に、1ウェルを6ウェル組織培養プレートに1ミリリットルの0.1%ゼラチンDPBSでコーティングします。

室温で30分間インキュベートします。コラゲナーゼと4時間インキュベートした後、消化した細胞を室温で300倍gで3分間遠心分離します。上清を吸引し、消化物を2ミリリットルの線維芽細胞培地に再懸濁します。

以前に調製した6ウェル組織培養プレートからゼラチン溶液を取り出します。細胞懸濁液を、残りの組織片を含めて6ウェルプレートに移します。細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で高湿度でインキュベートします。

線維芽細胞は、80%がコンフルエントになったらT25組織培養フラスコに継代する準備ができています。継代2〜4の線維芽細胞は、一般に継代の少ない線維芽細胞ほど再プログラミング効率が高いため、再プログラミングに最適です。フラスコから細胞培養培地を吸引し、1ミリリットルのDPBSで細胞を洗浄します。

DPBSを吸引し、0.5%トリプシンEDTAの1ミリリットルを追加します。摂氏37度で5分間、または細胞が剥離するまでインキュベートします。2ミリリットルの線維芽細胞培地を加え、細胞を再懸濁し、細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移します。

室温で300倍gで3分間遠心分離します。上清を吸引し、ペレットを2ミリリットルの線維芽細胞培地に再懸濁します。.血球計算盤を用いて線維芽細胞をカウントした後、24ウェル組織培養プレートの1ウェルに5倍から4番目の細胞に5倍を播種する。

細胞を摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日はセンダイウイルスを取り扱うため、適切な個人用保護具を使用しながら、指定のBSL-2研究所で手続きを続行してください。細胞培養培地を吸引し、250マイクロリットルのセンダイウイルス溶液を加えます。

プレートを摂氏37度でインキュベートします。コロニーをピッキングする1日前に、LN-521でコーティングされた24ウェル組織培養プレートを準備します。250マイクロリットルのLN-521溶液を24ウェルプレートの1ウェルにピペットで移します。

パラフィルムを使用してプレートを密封し、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、24ウェルプレートの1ウェルからLN-521溶液を吸引し、500マイクロリットルのE8をウェルに加えます。ヘアネットと処置用マスクの使用は、実体顕微鏡下でコロニーをピッキングする際に推奨されます。

コロニーは、直径が1ミリメートルを超えるサイズに達し、鋭いエッジを示し、均質な単層で成長しているときに摘み取る準備ができています。境界が曖昧で、不均一な細胞塊が大きくないコロニーは選択しないでください。メスで各コロニーをグリッド状のパターンで細かく切ります。

200マイクロリットルのピペットを使用して、皿から細胞シートを機械的に掻き取り、次にシートをLN-521でコーティングした24ウェル組織培養プレートのウェルに移します。コロニーの選択は、このプロトコールの成功にとって重要です。いくつかの追加のコロニーを選ぶことで、十分な数の愛着を確保できます。

E8培地を48時間交換せずにセルを接着させます。コロニーが5ミリメートルを超えるサイズに達したときに細胞を酵素的に継代します。細胞から細胞培養培地を吸引し、250マイクロリットルのDPBSで洗浄します。

DPBSを吸引し、250マイクロリットルの解離試薬を追加します。摂氏37度で3分間インキュベートします。細胞が切り上げられ始めたことを確認します。

解離試薬ですすいで、細胞をプレートから分離します。500ミリリットルのチューブに500マイクロリットルのE8培地を加え、細胞と解離試薬をチューブに移します。300倍gで3分間遠心分離します。

15ミリリットルのチューブから上清を吸引し、細胞ペレットを500マイクロリットルのE8培地に再懸濁します。血球計算盤を使用して細胞を数え、室温E8培地の500マイクロリットルを含む別の以前に調製されたLN−521プレコートウェルで、10〜4番目の細胞に2.5〜5倍播種します。ROCK阻害剤を最終濃度10マイクロモルまで添加します。

細胞を摂氏37度でインキュベートします。このプロトコルを使用して、ヒト誘導多能性幹細胞コロニーは、形質導入後約12日目に形質導入された線維芽細胞から出現します。コロニーは、形質導入後約3〜4週間で選別する準備ができていました。

好ましい特徴には、平坦化されたコンパクトな細胞塊、均質な単層としての成長、および鋭いエッジが含まれます。これらの明視野画像は、非常に不均一な細胞株と比較して、早期継代の均質で完全に再プログラムされたヒトiPS細胞株を示しています。センダイウイルスベクターの欠損は、ヒトiPS細胞の継代12にセンダイウイルスベクター特異的マーカーが存在しないのに対し、継代3のヒトiPS細胞には存在しないことで確認された。

多能性マーカーOCT4、SSEA-4、およびNANOGの派生細胞の免疫細胞化学染色では、均一に陽性の結果が得られました。内因性多能性遺伝子のmRNA発現は、逆転写酵素PCRによって示されました。多能性因子を発現しない部分的に再プログラムされた細胞を含む細胞培養物は廃棄した。

ヒトiPS細胞の分化能は、胚様体の形成によって評価されました。胚様体分化から21日後のリアルタイムPCRでは、内胚葉、中胚葉、および外胚葉特異的マーカーのmRNA発現が検出され、得られたヒトiPS細胞が3つの胚葉に分化できることが確認されました。このテクニックを習得すると、約16週間の間に約22時間のハンズオン時間で行うことができます。

得られたヒト人工多能性幹細胞は、成人人体の任意の細胞タイプに分化して、研究分野に関連するあらゆる質問に答えることができます。このビデオをご覧になった方には、皮膚生検から人工多能性幹細胞を作出するために必要な手順を十分にご