Name: ラミニン521マトリックスを用いたヒト誘導多能性幹細胞の統合された誘導 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: 学ぶラミニン521マトリックスを用いたヒト誘導多能性幹細胞の誘導法。センダイウイルスベクターによる非統合型再プログラミングと無異種培養系により、均一なhiPSCを樹立し、疾患モデリングや創薬スクリーニングに応用する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作業は、SSF（B13-0074）とVINNOVA（2016-04134）の資金提供機関によってサポートされました。

患者物質の収集およびhiPS細胞の誘導は、2012年3月28日のストックホルム倫理審査委員会の登録番号：2012 / 208-31 / 3によって承認されています。細胞培養ステップは、特に明記しない限り、バイオセーフティキャビネットで行う必要があります。細胞を扱うときは、常に無菌操作技術を実践してください。開始前に培地、プレートおよび試薬を室温に戻す。高湿度下、37℃、5％CO 2で細胞をインキュベートする。 1.皮膚生検からのヒト線維芽細胞の単離<ol><li> 培養液の調製、消化酵素、皿のコーティング、切開器具。 <ol><li>線維芽細胞培地：イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）44.5mL、胎児ウシ血清（FBS）5mL、ペニシリン/ストレプトマイシン（PEST）500μL（ 表1参照）を4℃で保存する。 </li><li> 1mg / mLの作用濃度で消化酵素を調製する：wei4mlのディスパーゼおよびコラーゲナーゼI型パウダーのアリコートを別の15mLチューブに入れ、4mLのDMEM / F12 + 1％PESTに溶解する。酵素溶液を0.22μmのストレーナーに通すことによって酵素溶液を滅菌する。毎回新鮮な酵素溶液を調製する。 </li><li>リン酸緩衝化生理食塩水（DPBS）中の0.1％ゼラチン1mLで切開した生検当たり6ウェル組織培養プレート（または35mm組織培養皿）に1ウェルをコートする。室温で30分間インキュベートする。 </li><li>解剖のための生検あたりの外科用ハサミと鉗子のオートクレーブ1セット。 </li></ol></li><li> 生検処置 注：採取後、できるだけ早く生検材料を処理する。 PBS + 1％PEST中で4℃で48時間保存する。生検のサイズは、直径2〜4 mmで、倫理的な許可が必要です。 <ol><li>生検を35mm皿に移す。生検を新しい35 mmの皿に移し、70％エタノール2 mLに生検を30秒間浸す。 </li><li>生検を3番目に移動する35 mm皿に入れ、1％PESTを補充した滅菌ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）1 mLで洗浄する。 </li><li>生検を第4の35mm皿に移し、新鮮に調製した0.1％ディスパーゼ溶液1mLを加える。 </li><li>外科用はさみと鉗子を使用して、皮膚生検を1〜2mm 3個に切り、ディスパーゼ溶液を含む生検片を15mLチューブに移す。ディスパーゼを2 mL追加します。 </li><li> 35 mmディッシュを1 mLディスペース溶液ですすぎ、15 mLチューブに移す。 </li><li>生検を4℃で一晩インキュベートする。 </li><li> 0.1％コラゲナーゼI 4mLをチューブに加え、37℃で4時間インキュベートする。 </li><li>消化した細胞を300 xgで3分間遠心分離し、上清を吸引し、2 mlの線維芽細胞培地に消化液を再懸濁する。 </li><li> 6ウェル組織培養プレートからゼラチン溶液を除去する。残りの断片を含む細胞懸濁液を6ウェル組織培養プレート（または35μmDPBS中の0.1％ゼラチンでプレコートした。 </li><li> 3日ごとに培地を交換する。 </li></ol></li><li> ヒト線維芽細胞の増殖 注：線維芽細胞は、80％コンフルエントになるとT25（25cm 2 ）組織培養フラスコに継代する準備ができています（ 図2B ）。線維芽細胞は、典型的には、7日以内に80％の集密度に達する。ただし、必要な時間は大きく変わる可能性がありますが、4週間を超えてはなりません。 <ol><li>培地を吸引し、2.5mLのDPBSで1回洗浄する。 </li><li> DPBSを除去し、Trypsin-EDTA（0.05％）1 mLを添加し、37℃で5分間または細胞が丸みを帯びて剥がれ始めるまでインキュベートする。 </li><li>必要に応じて細胞をすすぎ、細胞の適切な解離を確実にするために、2mLの線維芽細胞培地を加える。細胞溶液を15mLチューブに移し、300xgで3分間遠心分離する。 </li><li>上清を捨て、細胞ペレットを5mLの線維芽細胞培地およびプレート線維芽細胞に再懸濁する。被覆された細胞組織培養T25フラスコ。この工程の後に線維芽細胞を増殖させる場合には、上記のように解離し、12x10 3細胞/ cm 2で播種する。 </li><li>コンフルエントな細胞が凍結する準備ができたら、再プログラミングのために拡大または平板培養する。再プログラムを開始する前に、2ラウンドの線維芽細胞を凍結する（凍結手順については次のセクションを参照）。再プログラミング効率は一般に、より低い継代線維芽細胞についてより高く、継代2〜4での細胞が最適である。しかし、このプロトコールを用いて、10代までの線維芽細胞の再プログラミングが成功した。 </li></ol></li><li> 線維芽細胞の凍結融解 <ol><li>新鮮な線維芽細胞凍結培地：90％FBS + 10％ジメチルスルホキシド（DMSO）を調製する。 4℃に保つ（ 表1 ）。コンフルエントになると、T25組織培養フラスコを3つの冷凍庫に凍結することができる。バイアル凍結するごとに線維芽細胞凍結培地500μLを調製する。 </li><li>細胞を凍結させるには、c細胞を血球計数器を用いて計数し、3×10 5細胞の部分を15mLチューブに移す。 3分間300 xgでチューブを回転させます。上清を吸引する。 </li><li>細胞ペレットを500μLの4℃線維芽細胞凍結培地に再懸濁し、クライオバイアルに移す。バイアルを凍結容器に入れ、細胞を-80℃で24時間インキュベートしてから、長期間保管するために液体窒素に移す。 </li><li>細胞を解凍するには、クライオバイアルの底部を37℃の水に浸します。液化したら、細胞懸濁液を15mLチューブに移し、5mLの線維芽細胞を加える。細胞を300 xgで3分間回転させる。 </li><li>上清を除去し、5mLの線維芽細胞培地で細胞ペレットを再懸濁する。細胞を非被覆T25組織培養フラスコに移し、37℃でインキュベートする。 </li></ol></li></ol> 2.線維芽細胞のSeVベクターの再プログラミング<ol><li> ベクターアリコートの調製 </strong&gt; 注意：生物安全性レベル2の格納容器の下でSeVを取り扱ってください。製造元のプロトコールおよび現地ガイドライン17を参照してください。ウイルス力価はバッチごとに異なります。 <ol><li>アリコートを調製する前に、メーカーのプロトコール（ 例えば 、CytoTune 2.0）に従って、5×10 4細胞に必要なベクターの量を計算する。ウイルス力価は、一般に8×10 7 ~1.5×10 8まで変動する。 5：5：3（KOS MOI = 5、hc-myc MOI = 5およびhKlf4 = MOI 3）ベクターを解凍して結合する。オートクレーブした1.5mLチューブに5×10 4細胞を再プログラミングするために計算された量を加えます。再プログラムのために線維芽細胞培地でウイルスアリコートを250μLの最終容量に希釈する。 注：各バイアルは、5×10 4線維芽細胞を有する24ウェル組織培養プレートの1つのウェルの再プログラミングに有効である。ウイルスアリコートを-80℃で保存する。 </li></ol></li><li> SeVベクター形質導入 <ol><li>細胞を吸引する1LのDPBSで洗浄する。 DPBSを吸引し、1mLのトリプシン-EDTA（0.05％）を加える。 37℃で5分間または細胞が剥離するまでインキュベートする。 </li><li> 2mLの線維芽細胞を加え、細胞を再懸濁し、15mLのチューブに移す。 300xgで3分間遠心分離する。 </li><li>上清を吸引し、ペレットを2mLの線維芽細胞培地に再懸濁する。 </li><li>血球計算板を用いて線維芽細胞を計数し、24ウェル組織培養プレートの1つのウェルに5×10 4細胞を播種する。細胞を37℃で一晩インキュベートする。 </li><li>細胞培養液を吸引し、SeV溶液250μLを添加し、37℃で一晩インキュベートする。 </li><li>新鮮な線維芽細胞培地に毎日培地を交換する。形質導入された細胞をLN-521被覆プレートに継代する前に7日間増殖させる。通行の前日にLN-521プレートを準備する。コーティング手順については、2.3.1を参照してください。 </li></ol></li><li> 形質導入された線維芽細胞の再置換 <ol><li> LN-521コートディッシュ：DPBS中のLN-521を最終濃度0.63μg/ cm 2に希釈する。 60 mm組織培養皿あたり2 mlのLN-521溶液をピペットで採取する。パラフィルムを使用して60 mm組織培養皿をシールする。 4℃で一晩インキュベートする。 </li><li>取扱いを容易にするために、E8培地48.5mL、E8添加物1mLおよびPEST500μL（ 表1 ）の必須8培地（E8）アリコートを調製する。 </li><li>形質導入の7日後に、細胞をLN-521でコーティングした60mm組織培養皿に通す。 250μLのTrypsin-EDTA（0.05％）を添加し、37℃で5分間または細胞が剥離するまでインキュベートする。線維芽細胞2mLを加え、細胞を300xgで3分間遠心分離する。 </li><li>上清を吸引する。ペレットを2mLの線維芽細胞培地に再懸濁し、細胞を血球計数器で計数する。プレコートしたプレートからLN-521溶液を吸引し、LN-521プレコート60mmディッシュ内の5mlの線維芽細胞培地に4×10 4個の細胞を播種する。 Rhoキナーゼ阻害剤Y-27632を加える。（ROCKi）を最終濃度5μMになるように添加した。 37℃で一晩インキュベートする。 </li><li>重要なことに、翌日、培地をE8培地に交換する。毎日E8培地を交換する。 hiPS細胞コロニーは2〜3週間以内に出現する。 </li></ol></li></ol>コロニーのピッキングとhiPS細胞の増殖注：以下のステップは、ステレオ顕微鏡下でバイオセーフティーキャビネットの外部で行われます。ヘアネットと手技マスクの使用を推奨します。細胞培養を汚染しないように注意して作業してください。 <ol><li>採取する前日に、LN-521被覆組織培養24ウェルプレートを調製する。 LN-521をDPBS0.63μg/ cm 2で希釈する。 250μLのLN-521溶液を24ウェル組織培養プレートの1つのウェルにピペットで入れる。パラフィルムを使用してプレートをシールする。 4℃で一晩インキュベートする。 注：コロニーは、直径が1mmを超えるサイズに達するとすぐに拾います。コロニーは鋭いエッジを表示し、均一な月に成長する必要があります（ 図2D ）。 </li><li> LN-521溶液を吸引し、E8500μLを24ウェル組織培養プレートの1つのウェルに加える。 </li><li>実体顕微鏡の下でグリッドのようなパターンでメスでコロニーをより小さな断片に切断する。機械的に細胞シートを皿から掻き取り、200μLのピペットを使用してシートを準備したウェルに移す（ 図2D -2E ）。コロニーを別々のウェルに集める。 </li><li> 48時間培地を交換せずに細胞を付着させる。その後、E8培地を毎日交換する。 </li><li>コロニーが&gt; 5mmの大きさに達したとき、酵素的に細胞を単細胞としてLN-521被覆プレートの新しいウェルに通過させる。 </li><li>細胞培養培地を細胞から吸引し、250μLのDPBSで洗浄する。 </li><li> DPBSを吸引する。 250μLの解離試薬を添加し、37℃で3分間インキュベートする。 </li><li>細胞が丸め始めたことを観察してください。デタッチ細胞を解離試薬で数回すすいでプレートから細胞を除去する。 </li><li> E8培地500μLを15 mLチューブに添加する。解離試薬中の細胞をチューブに移し、300xgで3分間遠心分離する。 </li><li> LN - 521プレコートされたウェルからLN - 521溶液を吸引し、500μLの室温E8培地を加える。 </li><li>上清を吸引し、細胞ペレットを500μLのE8培地に再懸濁する。 </li><li>血球計数器を用いて細胞を計数し、調製したLN-521プレコートウェル（1.25×10 4〜2.5×10 4細胞/ cm 2 ）中に2.5×10 4〜5×10 4細胞を播種する。細胞培養フォーマットは、意図した目的に合わせて容易にアップスケールすることができる。 </li><li> 10μMの最終濃度にROCKiを加える。 37℃で細胞をインキュベートする。 </li><li>毎日E8培地を交換する。細胞は、通常、4〜6日後に継代する準備ができています。約90％コンフルエントである場合、上記の単一細胞として細胞を酵素的に通過させる。 注：再プログラムベクターは、hiPS細胞の増殖中に徐々に希釈され、継代12後には検出されない。継代的に再プログラミングされた細胞は、継代6-10周りで増殖を停止するか、またはそれらの特徴的な多能性幹細胞形態を失う（ 図3B ）。 </li><li> hiPS細胞の凍結融解 <ol><li>細胞を凍結するには、上記のように単一細胞として酵素的に細胞を解離させ、細胞を血球計数器で計数し、1mLのE8培地を含む15mLチューブに2.5×10 5細胞を移す。 300xgで3分間遠心分離する。上清を吸引する。 </li><li> 250μLの4℃PSCクライオメディウムに細胞ペレットを再懸濁し、クライオバイアルに移す。バイアルを凍結容器に入れ、細胞を-80℃で24時間インキュベートしてから、長期保存のために液体窒素に移す。 </li><li>細胞を解凍するために、24ウェル組織培養のプレコートLN-521ウェルを調製するプレートを、LN-521溶液を吸引し、250μLのE8培地を添加することによって洗浄する。クライオバイアルの底部を37℃の水に浸して、小さな氷色が残るようにします。 </li><li> cryovialに250μLのE8培地を添加し、細胞懸濁液を15mLチューブに移し、1mLのE8培地を加える。細胞を300 xgで3分間回転させる。 </li><li>上清を除去し、250μLの室温E8培地で細胞ペレットを再懸濁する。調製したウェルに細胞懸濁液を移し、1％の細胞生存補助剤または10μMのROCKiを加える。 37℃で組織培養プレートをインキュベートする。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Jin, Z. B., Okamoto, S., Xiang, P., Takahashi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration-free+induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+retinitis+pigmentosa+patient+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Integration-free induced pluripotent stem cells derived from retinitis pigmentosa patient for disease modeling.</a> Stem Cells Transl Med. 1 (6), 503-509 (2012).</li>
<li>Zhou, H., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+induced+pluripotent+stem+cell+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Evolution of induced pluripotent stem cell technology.</a> Curr Opin Hematol. 17 (4), 276-280 (2010).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Hovatta, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+culture+system+using+human+foreskin+fibroblasts+as+feeder+cells+allows+production+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells.</a> Hum Reprod. 18 (7), 1404-1409 (2003).</li>
<li>Ludwig, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-independent+culture+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Feeder-independent culture of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).</li>
<li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+self-renewal+of+human+pluripotent+stem+cells+on+human+recombinant+laminin-511%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511.</a> Nat Biotech. 28 (6), 611-615 (2010).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nat Meth. 8 (5), 424-429 (2011).</li>
<li>Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+culturing+and+cloning+of+human+pluripotent+stem+cells+on+laminin-521-based+matrices+under+xeno-free+and+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions.</a> Nat Protoc. 9 (10), 2354-2368 (2014).</li>
<li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+culturing+of+human+embryonic+stem+cells+on+laminin-521%2FE-cadherin+matrix+in+defined+and+xeno-free+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment.</a> Nat Commun. 5, 3195(2014).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Jpn+Acad+Ser+B+Phys+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).</li>
<li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+Reprogramming+to+Pluripotency+and+Directed+Differentiation+of+Human+Cells+with+Synthetic+Modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).</li>
<li>Unger, C., Skottman, H., Blomberg, P., Dilber, M. S., Hovatta, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Good+manufacturing+practice+and+clinical-grade+human+embryonic+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Good manufacturing practice and clinical-grade human embryonic stem cell lines.</a> Hum Mol Genet. 17 (R1), R48-R53 (2008).</li>
<li>Martin, M. J., Muotri, A., Gage, F., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+express+an+immunogenic+nonhuman+sialic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid.</a> Nat Med. 11 (2), 228-232 (2005).</li>
<li>Kele, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+iPS+cell+line+CTL07-II+from+human+fibroblasts%2C+under+defined+and+xeno-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Generation of human iPS cell line CTL07-II from human fibroblasts, under defined and xeno-free conditions.</a> Stem Cell Research. 17 (3), 474-478 (2016).</li>
<li>Uhlin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+iPS+cell+lines+from+monozygotic+twins+in+defined+and+xeno+free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Derivation of human iPS cell lines from monozygotic twins in defined and xeno free conditions.</a> Stem Cell Research. 18, 22-25 (2017).</li>
<li>Center for Disease Control and Prevention. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 5th ed, U.S. Department of Health and Human Services. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf">https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf</a> (2009).</li>
<li>Itskovitz-Eldor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+compromising+the+three+embryonic+germ+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers.</a> Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).</li>
<li>Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell+culture%3A+considerations+for+maintenance%2C+expansion%2C+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).</li>
<li>Jacobs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-Density+Culture+in+Human+Embryonic+Stem+Cells+Results+in+DNA+Damage+and+Genome+Instability%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Higher-Density Culture in Human Embryonic Stem Cells Results in DNA Damage and Genome Instability.</a> Stem Cell Reports. 6 (3), 330-341 (2016).</li>
<li>Schlaeger, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+non-integrating+reprogramming+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">A comparison of non-integrating reprogramming methods.</a> Nat Biotech. 33 (1), 58-63 (2015).</li>
<li>Nichole Wetton, C. C., Zarrabi MacArthur, A. ryan, Lakshmipathy, U. ma Ideal Xeno-Free Culture Conditions For Human Fibroblasts That Facilitate Efficient Reprogramming. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/xeno-free-culture-conditions-fibroblasts-poster.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/xeno-free-culture-conditions-fibroblasts-poster.pdf</a> (2016).</li>
<li>Trokovic, R., Weltner, J., Noisa, P., Raivio, T., Otonkoski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+negative+effect+of+donor+age+and+time+in+culture+on+the+reprogramming+efficiency+into+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Combined negative effect of donor age and time in culture on the reprogramming efficiency into induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res. 15 (1), 254-262 (2015).</li>
</ol>

著者は報告する利益相反はない。

このプロトコールの予想される結果は、いくつかのクローン的に誘導されたhiPS細胞株の生成が成功したことである。重要なことに、ここに記載された確立されたhiPS細胞の維持および増殖のための方法は信頼性があり、幹細胞培養の経験がほとんどない状態で実施することができる。 ROCKiとLN-521マトリックスとの酵素的単一細胞継代は、細胞を核型正常、多能性および容易に分化させることができ、コロニーに基づく継代が10,19,20を刺激することができる誘導された異種性を避けることが知られている。 ROCKi 10を添加しなくても、LN-521上で培養されたhiPS細胞は単一細胞として継代することができるが、ROCKiを添加すると、経験の少ないハンドラーにとってプロトコールが容易になり、hiPS細胞誘導に要する時間が短縮される。 再プログラミング効率はGEですこのプロトコルの問題ではありません。 SeVベクターは、線維芽細胞11に対して&gt; 1％の比較的高い再プログラミング効率を有する。豊富なコロ...

Takahashi らによるhiPS細胞株の最初の誘導以来、 1、2 、hiPS細胞は、疾患モデル化、創薬、および再生医療における細胞療法を生成するための原材料として有用なツールを提供している3 。 hiPS細胞培養は、線維芽細胞フィーダー細胞4,5またはマトリゲル6および胎児ウシ血清（FBS）を含有する培地製剤との共培養に長く依存してきた。バッチ間の変動は、これらの培養条件の未定義の性質の共通の結果であり、予測不可能な変動をもたらし、これらのプロトコルの信頼性に大きく寄与する7 。 Essential 8（E8） 8および定義された細胞培養マトリックス、例えばLN-521 9のような規定された培地の開発は、高度に再現可能なプロトコールの確立および均質なhiPS細胞の堅牢な生成および維持を助けるためのものである7,8,9,10。 統合型の再プログラミング技術の開発は飛躍的な進歩を遂げています。もともと、再プログラミングは、ゲノムの完全性に破壊的な影響を与えてゲノムにランダムに組み込まれたレトロウイルスベクターに依存していました11 。再プログラミング方法の進歩には、RNAに基づくベクターの開発が含まれる。 RNAベクターは、ゲノム組換えによる意図しない組込みが不可能であるため、DNAベースの再プログラミング方法よりも有利である12 。 SeVベクターは、DNA相11を持たない一本鎖RNAを介して、外因性因子の高い一過性の発現を提供する。 SeVによって送達された再プログラミングベクター細胞の増殖の至るところで希釈され、最終的に培養から脱落して、フットプリントの自由な再プログラミング方法を提供する。その後、多能性の維持は、多能性遺伝子の内在的発現に依存する2 。 先駆的なhiPS細胞ベースの治療法が臨床試験に移行し始めているため、標準化されたバッチ、再現性、および安全性に対する要求は、 13に対処するための重要な課題です。したがって、動物起源の製品は避けるべきである。例えば、異種産物の使用は、非ヒト病原体汚染のリスクと関連している。また、動物由来の培養成分の存在下で培養された細胞は、非ヒトのシリア酸を細胞膜に取り込ませ、誘導された細胞を免疫原性にすると脅かされている14 。したがって、将来の臨床研究には、異種産物を排除する必要があります。このプロトコルはxeを適用しますhiPS細胞の維持における無細胞で規定された培養は、細胞を臨床コンプライアンスに近づける。 このプロトコルは、線維芽細胞から標準化されたhiPS細胞を生成する、一貫性があり、再現性があり、使い易い方法を記載しています。また、確立されたhiPS細胞の維持のための使いやすい培養システムを提供します。このプロトコールは、Karolinska Institutetのスウェーデン国内ヒトiPSコア施設で、300以上のhiPS細胞株を誘導するために使用されています。

<table><tbody><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>171105-041</td><td>生検消化</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ</td><td>シグマ</td><td>C0130</td><td>生検消化</td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>シグマ</td><td>G1393</td><td>線維芽細胞マトリックス</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life Technologies</td><td>21980002-032</td><td>線維芽細胞培地</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td>線維芽細胞培地</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td>Antibiotic</td></tr><tr><td>Essential 8 培地</td><td>ThermFisher Scientific</td><td>A1517001</td><td>iPS細胞培養培地</td></tr><tr><td>LN-521</td><td>Biolamina</td><td>LN521-03</td><td>iPS細胞培養マトリックス</td></tr><tr><td>TrypLE select 1X</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12563011</td><td>Dissociation reagent</td></tr><tr><td>Rho-kinase inhibitor Y27632</td><td>Millipore</td><td>SCM075</td><td>Rho-kinase inhibitor (ROCKi)</td></tr><tr><td>CytoTune &ndash; iPS 2.0 リプログラミングキット</td><td>Life Technologies</td><td>A1377801</td><td>仙台ウイルス リプログラミングベクター</td></tr><tr><td>35 mm 組織培養皿</td><td>Sarstedt</td><td>83.3900.300</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>60 mm 組織培養皿</td><td>Sarstedt</td><td>83.3901.300</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>24 ウェル組織培養プレート</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922.300</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>T25 組織培養フラスコ</td><td>VWR</td><td>734-2311</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>15 mL チューブ</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>遠心分離チューブ</td></tr><tr><td>1.5 mL チューブ</td><td>Eppendorf</td><td>0030123.301</td><td>1.5 mL チューブ</td></tr><tr><td>CoolCell cell LX</td><td>Biocision</td><td>BCS-405</td><td>凍結容器</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ml</td><td>線維芽細胞凍結</td></tr><tr><td>クライオバイアル 1.8 mL</td><td>VWR</td><td>479-6847</td><td>クライオバイアル</td></tr><tr><td>PSC 凍結保存キット</td><td>Gibco</td><td>A2644601</td><td>PSC クライオmediumRevitaCellサプリメント</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.05%)</td> <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25300054</td><td>線維芽細胞解離酵素</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>31331-028</td><td>消化酵素希釈剤</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td>PBS</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFIsher Scientific</td><td>14025-050</td><td>生検調製</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Sigma</td><td>BRAND, 718920</td><td>細胞計数パラ</td></tr><tr><td>フィルム</td><td>VWR</td><td>291-1213</td><td>保管用シーリングプレート</td></tr></tbody></table>

ラミニン521マトリックスを用いたヒト誘導多能性幹細胞の統合された誘導

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Xeno-freeおよび完全に定義された条件は、均一なヒト誘導多能性幹（hiPS）細胞の堅牢で再現性のある世代のための重要なパラメータである。フィーダー細胞または未定義マトリックス上のhiPS細胞の維持は、バッチの変動、病原性の汚染および免疫原性のリスクに影響されやすい。定義された組換えヒトラミニン521（LN-521）マトリックスを異種非含有培地および規定培地と組み合わせて使用​​することにより、変動性が減少し、hiPS細胞の一貫した生成が可能になる。センダイウイルス（SeV）ベクターは、非組み込み型RNAベースのシステムであるため、組み込みベクターが有するゲノムの完全性に対する潜在的な破壊的効果に関連する懸念を回避することができる。さらに、これらのベクターは真皮線維芽細胞の再プログラミングにおいて比較的高い効率を示した。さらに、細胞の酵素的な単細胞継代は、実質的に以前の経験のないhiPS細胞の均質な維持を容易にする培養する。ここでは、再現性と使いやすさに重点を置いて広範囲に試験および開発され、線維芽細胞から定義された異種非含有ヒトhiPS細胞を生成するための堅牢で実用的な方法を提供するプロトコールについて説明します。

生検からhiPS細胞まで生検から確立されたhiPS細胞までの全過程は、再プログラミングベクターがなく、特性決定の準備ができてから約16週間かかる（ 図1 ）。より詳細なタイムラインが図2Aに示されている 。線維芽細胞の培養を確立して拡張するためには、約4週間が必要である。最初のhiPS細胞コロニーは、センダイベクター導入の約3週間後に出現し始めた。最初の継代のためにコロニーを機械的に採取し、次いで単一細胞として酵素的に継代した。 ヒト線維芽細胞培養の確立ヒト線維芽細胞培養物がコンフルエントまで増殖し、受け入...

ヒトに誘導された多能性幹（hiPS）細胞の強力な誘導は、真皮線維芽細胞の非組込みセンダイウイルス（SeV）ベクター媒介性再プログラミングを使用することによって達成された。 hiPS細胞の維持およびクローン増殖は、組換えヒトラミニン521（LN-521）マトリックスおよびEssential E8（E8）培地を用いた異種非含有および化学的に規定された培養条件を用いて行った。

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

このプロトコルの全体的な目的は、均一なヒト人工多能性幹細胞を誘導することです。この手法は、疾患モデリング、薬剤スクリーニング、または前臨床細胞治療試験用の細胞誘導など、多くの目的でヒト人工多能性幹細胞を誘導するために利用可能です。本プロトコルの利点は、堅牢であること、およびユーザーフレンドリーでXeno-free（外来動物由来成分不含）かつ完全に化学的に定義された培養システムで維持される均一な細胞を生成できることです。ヒトiPS細胞は、ドナー組織の遺伝的背景を再現し、あらゆる疾患関連細胞へと分化させることが可能であるため、疾患モデリングにおいて優れたツールとなります。生検組織の解離とコロニーピックアップは複雑な手順を要します。熟練した技術による実際の手技を確認することで、手順への理解が深まり、再現性が向上します。本日の手順を実演するのは、カロリンスカ研究所iPSコアファシリティの経験豊富な2名の臨床検査技師、Harriet RonnHolmとKelly Dayです。皮膚生検サンプルは、1%ペニシリン・ストレプトマイシンを含むPBS中で4°Cで最大48時間まで保存可能ですが、採取後できるだけ速やかに処理してください。生検サンプルを35 mmディッシュに移します。皮膚生検組織を、2 mLの70% ethanolを入れた35 mmディッシュに30秒間浸します。新しい35 mmディッシュに、1% penicillin streptomycinを添加した滅菌済みのHank's Balanced Salt Solutionを1 mL加え、生検組織をその新しいディッシュに移します。その後、生検組織を、調製直後の0.1% dispase溶液1 mLを満たした4つ目の35 mmディッシュに移します。滅菌済みの外科用メスとピンセットを用いて、皮膚生検組織を1〜2立方ミリメートルの大きさに切断します。生検片をディスパース溶液とともに15 mLチューブに移し、さらに2 mLのディスパース溶液を加えます。35 mmディッシュを1 mLのディスパース溶液で洗浄し、その洗浄液を15 mLチューブに移します。生検組織を4 °Cで一晩インキュベートします。翌朝、生検組織が入ったチューブに0.1% collagenase Iを4 mL加え、37 °Cで4時間インキュベートします。細胞を播種する30分前に、6ウェル組織培養プレートの1ウェルにDPBSで調製した0.1% gelatinを1 mL添加してコーティングします。室温で30分間インキュベートします。コラゲナーゼで4時間インキュベートした後、消化した細胞を室温で300 ×gで3分間遠心分離します。上清を吸引し、消化物を2 mLの線維芽細胞培地で再懸濁します。あらかじめ準備しておいた6ウェル組織培養プレートからゼラチン溶液を除去します。残存する組織片を含む細胞懸濁液を6ウェルプレートに移します。細胞を37°C、5% carbon dioxideの高湿度条件下でインキュベートします。線維芽細胞が80%コンフルエントに達した時点で、T25組織培養フラスコへ継代します。一般的に、継代数の少ない線維芽細胞の方がリプログラミング効率が高いため、継代2回から4回の線維芽細胞がリプログラミングに最適です。フラスコから細胞培養液を吸引し、1 mLのDPBSで細胞を洗浄します。DPBSを吸引し、0.5% Trypsin EDTAを1 mL加えます。37 °Cで5分間、または細胞が剥離するまでインキュベートします。線維芽細胞培地を2 mL加え、細胞を再懸濁し、細胞懸濁液を15 mLチューブに移します。室温で300 ×gで3分間遠心分離します。上清を吸引し、ペレットを2 mLの線維芽細胞培地で再懸濁します。ヘモサイトメーターを用いて線維芽細胞をカウントした後、24ウェル組織培養プレートの1ウェルに5 × 10⁴個の細胞を播種します。細胞を37°Cで一晩インキュベートします。翌日は、センダイウイルスを取り扱うため、適切な個人用保護具を着用し、指定されたBSL-2実験室で手順を継続してください。細胞培養液を吸引し、250 µLのセンダイウイルス溶液を添加します。プレートを37 °Cでインキュベートします。コロニーをピックアップする1日前に、LN-521をコーティングした24ウェル組織培養プレートを準備します。24ウェルプレートの1ウェルに、LN-521溶液を250 µLピペッティングします。プレートをパラフィルムで密封し、4°Cで一晩インキュベートします。翌日、24ウェルプレートの1ウェルからLN-521溶液を吸引し、そのウェルに500 µLのE8を添加します。実体顕微鏡下でコロニーをピックアップする際は、ヘアネットとサージカルマスクの着用が推奨されます。コロニーが直径1 mm以上の大きさに達し、縁がはっきりしており、均一な単層で増殖している場合にピックアップします。縁がぼやけていたり、細胞塊が大きく不均一で凝集していないコロニーはピックアップしないでください。各コロニーをメスで格子状に切り、小さく断片化します。200 µL ピペットを使用して、ディッシュから細胞シートを機械的に掻き取り、あらかじめ LN-521 でコーティングした 24 ウェル組織培養プレートのウェルにシートを転移させます。本プロトコールの成功には、コロニーの選択が極めて重要です。予備として数個のコロニーを追加でピックアップすることで、十分な数の細胞の接着を確実にすることができます。E8培地を交換せずに、48時間細胞を接着させます。コロニーの大きさが5 mm以上に達した時点で、細胞を酵素的に継代します。細胞から細胞培養培地を吸引し、250 µLのDPBSで洗浄します。DPBSを吸引し、解離試薬を250 µL加えます。37 °Cで3分間インキュベートします。細胞が円形に変化し始めたことを確認します。解離剤で細胞を洗浄し、プレートから剥離させます。15 milliliterチューブに500 µLのE8培地を加え、細胞と解離剤をそのチューブに移します。300 ×gで3分間遠心分離します。15 mLチューブから上清を吸引し、細胞ペレットを500 µLのE8培地で再懸濁します。ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測し、室温のE8培地500 µLが入った、あらかじめ準備した別のLN-521プレコートウェルに2.5～5 × 10⁴個の細胞を播種します。最終濃度が10 µMとなるようにROCK阻害剤を添加します。細胞を37°Cでインキュベートします。本プロトコルを用いると、導入後の約12日目に、導入された線維芽細胞からヒト人工多能性幹細胞のコロニーが出現します。コロニーは導入後約3〜4週間でピックアップ可能な状態になります。好ましい特徴として、扁平でコンパクトな細胞塊、均一な単層での増殖、および明確な境界などが挙げられます。これらの明視野像は、高度に不均一な細胞株と比較して、早期継代の均一で完全にリプログラミングされたヒトiPS細胞株を示しています。Sendaiウイルスベクターの消失は、継代3回のヒトiPS細胞とは対照的に、継代12回のヒトiPS細胞においてSendaiウイルスベクター特異的マーカーが認められないことで確認されました。分化細胞を多能性マーカーであるOCT4、SSEA-4、およびNANOGで免疫細胞化学染色した結果、均一に陽性であることが示されました。内因性多能性遺伝子のmRNA発現は、逆転写PCRによって確認されました。多能性因子を発現していない部分的にリプログラミングされた細胞を含む細胞培養物は、廃棄されました。ヒトiPS細胞の分化能を、胚様体の形成により評価しました。胚様体分化から21日後にリアルタイムPCRを行ったところ、内胚葉、中胚葉、および外胚葉の特異的マーカーのmRNA発現が検出され、由来したヒトiPS細胞が三胚葉への分化能を有することが確認されました。この手法に習熟すれば、約16週間の期間中、実作業時間は約22時間で実施可能です。誘導されたヒト人工多能性幹細胞は、あなたの研究分野に関連するあらゆる疑問を解決するために、成人ヒト体のあらゆる細胞型に分化させることが可能です。このビデオを視聴することで、皮膚生検から人工多能性幹細胞を誘導するために必要な手順をどのように実行すべきかについて、十分に理解していただけることを願っています。

integration-free-derivation-human-induced-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

私たちは、人間の神経前駆細胞の大量供給と神経修復のための開発CNSにおける神経細胞の種類の導出を可能にする低分子化合物、と定義された条件の下で維持さ多能性ヒト胚性幹細胞から直接、神経芽細胞の誘導のためのプロトコルを確立している。...

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト神経前駆細胞と神経細胞の効率的な導出

大人の線維芽細胞から再プログラムヒト人工多能性幹細胞のコロニーを選択し、分離

ここでは、解離した単一細胞の非コロニー型単層(NCM)増殖に基づくヒト多能性幹細胞(hPSC)培養プロトコルを紹介します。この新しい方法は、Rho関連キナーゼ阻害剤またはラミニンアイソフォーム521(LN-521)を利用しており、大量の均質なhPSCの産生、遺伝子操作、および創薬に適しています。...

ヒト多能性のための代替培養はセル生産、メンテナンス、および遺伝子解析幹

私たちは、レンチビラールベースの再プログラムされ、特徴付けられた因子フリーのヒト誘導多能性幹細胞を導き出し、推定される臨床グレードの状態に変換するためのプロトコルを記述します。...

導入遺伝子のない人間の人工多能性の導出および特徴は、定義された臨床グレードの条件に細胞株および変換の幹

人工多能性幹細胞の生成は、自家移植の導出のための魅力的な展望を提供しています。しかし、多能性状態と面倒な再分化の進行はまだ臨床の翻訳を妨げます。ここでは、成人のヒト線維芽細胞の誘導および誘導神経前駆細胞への直接変換と神経系統へその後の分化を説明します。...

成人ヒト線維芽細胞の導出と拡張神経前駆細胞へのそれらの直接変換

この原稿は、抜毛された髪の毛からのヒトケラチノサイトの誘導と維持、およびその後のエピソームベクターによる統合フリーのヒト人工多能性幹細胞（hiPSCs）の生成のための段階的な手順を提供します。...

髪の由来ケラチノサイトを使用した統合フリーヒト誘導多能性幹細胞の生成

このプロトコルは、ヒトの成人末梢血細胞から統合フリーのiPS細胞を効率的に生成するための詳細な方法を説明しています。4つのoriP/EBNAベースのエピソームベクターを使用してリプログラミング因子(KLF4、MYC、BCL-XL、またはOCT4およびSOX2)を発現させることで、1...

エピソームベクトルを用いたヒト末梢血単核細胞からの統合フリー人工多能性幹細胞の生成

ここで紹介する方法は、多能性幹細胞からのヒト肝細胞様細胞を生成するための拡張性と優れた製造基準（GMP）-Readyビデオ分化システムを記載しています。これは、基礎および応用ヒト肝臓研究のためのヒト肝細胞様細胞を生成するために、費用対効果の高い標準化されたシステムとして機能します。...

ヒト多能性幹細胞から肝細胞様細胞の定義され、スケーラブルな世代

細胞リプログラミングでは、多能性細胞状態を調節し維持する主要遺伝子の導入が必要です。記載されたプロトコルは、ウイルス/統合方法なしでヒト皮膚線維芽細胞からの誘導多能性幹細胞(iPSC)コロニーの形成を可能にするが、非修飾RNA(NM-RNA)を免疫回避因子と組み合わせて細胞防御機構を低下させる。...

腹部皮膚からの成人ヒト皮膚線維芽細胞の分離と非積分法を用いた人工多能性幹細胞の生成

このプロトコルの目的は、さまざまな細胞外マトリックス(ECM)コーティング条件を比較して、差動コーティングが人工多能性幹細胞(iPSC)の増殖速度にどのように影響するかを評価することです。特に、iPS細胞培養の最適な増殖を得るための条件設定を目指しています。...

自動イメージングシステムを用いたiPS細胞の合流点の測定

本稿の目的は、多能性幹細胞からのヒト肝前駆物質分化を誘導する標準化されたアプローチを提供することです。すぐに使用できるメディア製剤を用いたこの手順の開発は、生物医学の研究と翻訳のためのヒト肝細胞を生成する容易なシステムをユーザーに提供する。...

定義された分化系を用いた多能性幹細胞からの肝前駆体仕様

学ぶラミニン521マトリックスを用いたヒト誘導多能性幹細胞の誘導法。センダイウイルスベクターによる非統合型再プログラミングと無異種培養系により、均一なhiPSCを樹立し、疾患モデリングや創薬スクリーニングに応用する。

ラミニン521マトリックスを用いたヒト誘導多能性幹細胞の統合された誘導

さらに動画を探す