Name: からの電気生理学的記録ショウジョウバエ低揮発性の臭気物質に対するトリコイドセンシラ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 学ぶショウジョウバエのトリコイドセンシラにおける単一感覚毛記録法による低揮発性フェロモンの電気生理学的応答測定。この手法は昆虫の化学感覚メカニズム解明に貢献します。

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私たちはサンプルの痕跡とTin Ki Tsangの助けを借りて、絵の助けを借りてYe Zhangに感謝します。この研究は、レイ・トーマス・エドワーズの早期キャリア賞とC.-YSおよびNIHグラント（R01DC009597およびR01DK092640）のNIHグラント（R01DC015519）がJWW

1. at4記録用ハードウェアの準備<ol><li>ピペットプラー装置を使用して、アルミノシリケートガラスキャピラリー（OD 1.0mm、ID 0.64mm）で電極を調製する。ハエの頭蓋内への挿入を容易にするために、一対の細かい鉗子で参照電極の先端をわずかに鈍らせる（ すなわち 、ハエ頭の前部、口部の上の丸いプレート）。 注：7日齢のWT男性（ベルリン）をこの研究で使用した。両方の電極の電解質としてAHL生理食塩水14を使用する。 </li><li> NaCl 6.312グラム、塩化カリウムの0.373グラム、NaHCO 3を0.337グラム、のNaH 2 PO 4、トレハロースּ2 H 2 O、スクロース3.423グラムの1.892グラムの0.1120グラムを用いて、蒸留水900mlを混合することによってAHLの1 Lを調製1.192gのHEPES、および8.2mLの1M MgCl 2を入れた 。蒸留水を使用して、全容量を1 Lにする。1 N NaOHを使用してpHを7.4にし、溶液を滅菌する。真空駆動フィルターシステム。長期間保存するには、AHLアリコートを4℃に保ちます。 注：パルミトレイン酸の一貫したデリバリーは、カートリッジ間の均一性に左右されます。各カートリッジが再現可能な方法で組み立てられることが重要です。 </li><li>カミソリの刃を使用して、200μLのピペットチップの先端から0.9cmを取り除いて、4.1cmの第1のカートリッジセクションを作成する。 図1Aに詳述されている寸法を参照してください。別の200μLピペットチップを使用し、チップとベースからそれぞれ1.7cmと1.5cmを取り除いて、1.8cmの第2カートリッジセクションを作成します（ 図1A ）。再現性を保証するためにルーラーを使用してください。 </li><li>濾紙からディスクを切断するには、1/8 &quot;穴パンチャーを使用してください。 </li><li>鉗子を使用して、第2カートリッジセクションの先端に濾紙ディスクを置きます。空気が通過できる開口部がカートリッジの先端にあることを視覚的に確認する。 </li><li> 図1Aに示すように、第1と第2のカートリッジセクションを一緒に取り付けます 。第2のカートリッジ部分を下方に傾けて、準備を正方形にすることを容易にする（ 図1B ）。 </li><li>カートリッジをマイクロマニピュレーターに取り付けられた臭気送達チューブに接続します。 注記：この設計により、交換を容易にするためにカートリッジを外側に旋回させることができます（ 図1C ）。 </li><li> 1つの質量コントローラで一定の加湿空気流量を2 L /分に設定し、別の質量コントローラで付臭剤フローを500 mL /分に設定します。 </li><li>ソフトウェア（ 表の表を参照）を使用して、500 msの臭気パフを管理する手順をプログラムします。 </li></ol> 2.送達のためのパルミトレイン酸匂い溶液の調製注：Or47b ORNは、 シス及びトランスパルミトレイン酸の両方に応答する。パルミトレイン酸はRで不安定であるのでTは-20℃で貯蔵し、開封後1ヶ月以内に使用する。エタノールは、パルミトレイン酸のために選択される溶媒である。 <ol><li>ボルテックスミキサーを使用して、10μLのシスまたはトランス -パルミトレイン酸のストックまたは希釈液を、1.7mLのマイクロチューブで10倍連続希釈するために100μLのエタノール90μLと完全に混合する。実験前に毎日新鮮なパルミトレイン酸希釈液を調製し、1日以内に使用する。 注：エタノールに溶けないにおい物質の場合、他の種類の有機溶媒で臭い希釈液を調製するには、ガラスバイアルの使用を推奨します。 </li><li> P10マイクロピペットを用いて、所望の希釈液のシス -パルミトレイン酸溶液5μLを対応するカートリッジの濾紙に塗布する。 注：最高用量（10 -1 ）には450μgの化合物が含まれています。 トランス -パルミトール酸溶液の場合、最高用量（10 -1 ）に450μLのt彼は化合物。 </li><li>溶媒を完全に蒸発させるために、パルミトレイン酸カートリッジを真空デシケーター中に室温および圧力7.59mmHgで1時間置く。 注記：カートリッジはRTで4時間まで使用できます。 </li></ol> インビボ電気生理学的記録のためのat4センシラへの容易なアクセスのためのショウジョウバエの調製注：WTハエ（ベルリン）は、12：12の明暗サイクルで25℃で標準的なコナミール培地で飼育される。勃起すると、ハエは性別によって10のグループに分けられ、それによって7歳までグループに収容されます。オスとメスの両方でor47b ORNがパルミトレイン酸に応答する。簡単にするために、現在の研究では雄ハエのみを調べる。 <ol><li>フライ・プレップ・スライドを組み立てる：ガラス・スライド上にガラス・カバースリップ（18×18mm 2 ）を少量のモデリング・クレー上に置き、スライドガラスと約3°の角度をなす。内部Eに両面テープを置きますカバースリップとすぐ下のスライドの領域に表示されます。記録の毎日のために新鮮なテープで交換してください（ 図2A ）。 </li><li>フライアスピレーター15を使用してチュービングのフライを集め、チューブの端に200μLのピペットチップを取り付けます。同時にチューブを前方に軽く叩きながらチューブに空気を吹き込み、ピペットチップの端にフライを押します。かみそりの刃を使って、フライの身体のすぐ下と、フライの上の2頭の長さを切断します。 </li><li>アンテナとクライスが両方露出するまで、飛行を上に押して、モデリング粘土でピペットチップの底を塞ぎます（ 図2B ）。フライの腹部が潰れないように、飛行機を殺すのを避けるために、アンテナとアルスターを暴露するのに十分な粘土だけを加えてください。さらに、粘土をゆっくりと穏やかに加えて突然の狭窄を防ぐ。ハエが生きていることを確認するには、または頸動脈の動き。 </li><li>フライを収容するピペットチップを操作するために鉗子を使用してください。頭頂部が観察者の右を向くように頭を向ける。アンテナの側面がテーピングされたカバースリップの表面（ 図2B ）に当たるまで、細かいピンセットを使用してカバースリップに沿って準備を調整します。 </li><li>アンテナを両面テープに固定して動きを防止するために、支柱に支柱を置きます （ 図2B ）。 注記：保持ロッドはピペットプラーでホウケイ酸ガラスキャピラリーから引き出され、モデリング粘土で定位置に保持されます （ 図2A ）。 </li><li>リグのステージ上にプレパラートを置く（ 図2C ）。顕微鏡を使用して、トリコイドがアンテナの3番目のセグメントの遠位端に沿って見えることを確認します。 注：理想的には、sensillaはバックグラウンドに対して明確なシルエットを持つ必要があります。<html>記録を容易にします（ 図3 ）。この調製では、アクセス可能なトリコイド感受性物質の大部分はat4型である。 </li><li>先に図2 に 示す ように、15のように、分取から約2cmの距離（ 図4）からの別個の空気送達チューブを介して送達定数加湿空気流（2L /分）下で分取を保ちます。 </li></ol> 4.パルミトレイン酸に反応したat4トリコイド中のOr47b ORNからのat4感覚活性の記録<ol><li>参照電極を鞘に挿入する（ 図3A ）。組織の損傷を避けるために、電極が表面のすぐ下に挿入されていることを確認してください。電極がキューティクルの下の血リンパと接触できるようにしてください。 </li><li>ターゲット電極と同じ平面に入るまで記録電極をゆっくりと下げてください（= &quot;xfig&quot;&gt;図3B）。 50倍の対物レンズで記録します。 注記：タフタコイダルキューティクルは、記録電極を感知器ベースに挿入する必要があり、その広い領域は、電極が偏向される可能性を低減する大きなターゲットを提供する（ 図3B 、挿入図）。 </li><li> 感覚刺激に匂い刺激を加える前に、以下の選択基準を守ってください。これらの基準を満たしていないトリコイドは拒絶され、もう一つの感覚は選択されるべきである。 <ol><li>高い信号対雑音比（例として図3Cを参照）を観察してください。 </li><li> at4Aおよびat4Cニューロンからの同定可能なスパイクを観察する（ 図3C ）。 注意：注目すべきは、at4Bスパイク振幅はat4A 10と非常によく似ており、臭い刺激なしでは容易に同定できないことです。 </li><li> at4Aニューロンの基礎発火率は、約20Hz以下である。 注：この基準は、ニューロンの基礎発火率が基底ORNs 2のそれよりも高いため、at4Aに特有である。はるかに高い基礎発火は、ニューロンが電極挿入中に損傷を受けた可能性があることを示す。 </li></ol></li><li>カートリッジを付臭剤供給チューブに接続します。溶媒制御装置で始め、次に臭い物質を低濃度から高濃度にします。マイクロマニピュレーターを使用してカートリッジを準備の方向に動かし、カートリッジを準備の頭に正対して向ける。数ミリメートル離れたところからカートリッジがアンテナに直接向いていることを目視で確認します （ 図4 ）。 注：目的は、カートリッジの開口部をアンテナに直接向け、標的組織に近接して配置することです。 </li><li>付臭剤カートリッジが記録電極から右に1〜2 mm離れていることを確認してください。pを約1 mm下にスライドさせます。 注記：ここで説明する設定では、付臭剤カートリッジは、記録電極、参照電極、フライ・プレップ・スライド（ 図4 ）と密接に接しています。 注記：カートリッジと記録/参照電極間の距離に注意してください。約4 mmの距離をお勧めします1 。意図しない接触は、信号を終了させ、記録電極の先端を壊し、現在のニューロンに損傷を与え、さらなる記録を複雑にする可能性がある。 注記：カートリッジとフライ・プレップ・スライドとの距離を考慮してください。カバースリップに触れても記録電極がはずれて記録が中断されることがあります。 </li><li>記録を開始するには、データ収集ソフトウェアの &quot;Record&quot;を押します。 注：10秒ごとの録音ごとに、ステップ1.9で説明したように、500 msの単一臭いパルスがアンテナに直接送られます。 </li><li>ニオイ剤塗布後、次の濃度のカートリッジに交換する前にカートリッジを注意深く引き出してください。投与量の全範囲が得られるまで続ける。 注：適応の影響を避けるために、各フライから1つのOr47b ORNしか記録されないことが推奨される。 </li><li>記録電極を蒸留水で徹底的にすすいでください。 </li><li>市販のオフライン解析ソフトウェアを使用してデータを分析およびプロットする。 </li></ol>

<ol><li>Lin, H. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+modulation+of+pheromone+detection+enhances+male+courtship+success%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hormonal modulation of pheromone detection enhances male courtship success.</a> Neuron. 90 (6), 1272-1285 (2016).</li>
<li>Hallem, E. A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coding+of+odors+by+a+receptor+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Coding of odors by a receptor repertoire.</a> Cell. 125 (1), 143-160 (2006).</li>
<li>Silbering, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+function+and+integrated+wiring+of+the+evolutionarily+distinct+Drosophila+olfactory+subsystems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems.</a> J Neurosci. 31 (38), 13357-13375 (2011).</li>
<li>Min, S., Ai, M., Shin, S. A., Suh, G. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedicated+olfactory+neurons+mediating+attraction+behavior+to+ammonia+and+amines+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dedicated olfactory neurons mediating attraction behavior to ammonia and amines in Drosophila.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 110, 1321-1329 (2013).</li>
<li>Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+class+of+olfactory+neurons+mediates+behavioural+responses+to+a+Drosophila+sex+pheromone%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone.</a> Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).</li>
<li>Van der Goes van Naters, W., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptors+and+neurons+for+fly+odors+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Receptors and neurons for fly odors in Drosophila.</a> Curr Biol. 17, 606-612 (2007).</li>
<li>Schlief, M. L., Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+processing+and+behavior+downstream+from+highly+selective+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Olfactory processing and behavior downstream from highly selective receptor neurons.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 623-630 (2007).</li>
<li>Laughlin, J. D., Ha, T. S., Jones, D. N. M., Smith, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Pheromone-sensitive+neurons+is+mediated+by+conformational+activation+of+pheromone-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of Pheromone-sensitive neurons is mediated by conformational activation of pheromone-binding protein.</a> Cell. 133 (7), 1255-1265 (2008).</li>
<li>Gomez-Diaz, C., Reina, J. H., Cambillau, C., Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligands+for+pheromone-sensing+neurons+are+not+conformationally+activated+odorant+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Ligands for pheromone-sensing neurons are not conformationally activated odorant binding proteins.</a> PLoS Biol. 11 (4), e1001546(2013).</li>
<li>Dweck, H. K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromones+mediating+copulation+and+attraction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+USA%22%5BJournal%5D)">Pheromones mediating copulation and attraction in Drosophila.</a> Proc Nat Acad USA. 112, 2829-2835 (2015).</li>
<li>Cappa, C. D., Lovejoy, E. R., Ravishankara, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaporation+rates+and+vapor+pressures+of+the+even-numbered+C8-C18monocarboxylic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+A%22%5BJournal%5D)">Evaporation rates and vapor pressures of the even-numbered C8-C18monocarboxylic acids.</a> J Phys Chem A. 112 (17), 3959-3964 (2008).</li>
<li>Kimura, K. -I., Sato, C., Yamamoto, K., Yamamoto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+back+or+front%3A+the+courtship+position+is+a+matter+of+smell+and+sight+in+Drosophila+melanogaster+males%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">From the back or front: the courtship position is a matter of smell and sight in Drosophila melanogaster males.</a> J Neurogenet. 29 (1), 18-22 (2015).</li>
<li>Grosjean, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+olfactory+receptor+for+food-derived+odours+promotes+male+courtship+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila.</a> Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).</li>
<li>Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112 (2), 271-282 (2003).</li>
<li>Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+sensillum+recordings+in+the+insects+Drosophila+melanogaster+and+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae.</a> J Vis Exp. (36), e1-e5 (2010).</li>
</ol>

著者は何も開示することはない。

ここでは、Or47b ORNのパルミトレイン酸に対する応答を強く誘発し、記録することができる手順を記載した。我々は不十分フェロモン臭気物質の送達の問題を解決するために、従来の長距離臭気配信方法2、7、10を修正しました。臭気物質カートリッジを介して化合物を送達することにより、低い臭気物質の揮発性の問題に対処した。その開口部は、調製のミリメートル以内に配置されている。各匂いカートリッジの一貫した構築および配置を考慮すると、このプロトコルは、アクセスできない匂い物質を再現可能な方法で提示する有効な方法として現れる。 ここに記載された近距離匂い提示手順は、既存の匂い配送方法に関して重要である。それは、他のlのスクリーニングトリコイド感覚器1に収容されたORNだけでなく、任意の感覚器タイプに見られるORNにおける応答のための低変動性臭気物質である。この手順は...

<html> ショウジョウバエ ORNは、エステル、アルコール、ケトン、ラクトン、アルデヒド、テルペン、有機酸、アミン、硫黄化合物、複素環および芳香族化合物を含む広範な炭素鎖長および様々な官能基を有する膨大な数の匂い物質に反応する2 、 3 。それらの物理化学的特徴が異なる匂い物質は、化合物の蒸気圧によって示される顕著に異なる揮発性を有することができる。特に、 ショウジョウバエのメラノガスターの生物学的に関連する臭気物質は、そのボラティリティにおいて著しく異なる。例えば、Ir92a ORNは、20℃で6322Hgの蒸気圧で、非常に揮発性の高いアンモニア4に反応します。対照的に、Or67d ORN類は男性フェロモン、 シス -vaccenyl酢酸（C VA）5、6、20°Cで43 mmHgであるの蒸気圧に応答します。 低揮発性の匂い物質に対する嗅覚応答の研究は、匂い物質が比較的長い距離（ すなわち、数センチメートル）にわたって担体空気流を介して送達される従来の匂い送達方法では特に困難である。所定の低揮発性臭気物質に臭気デリバリーシステムの設計に依存して、大きく変化することができ、例えば、C VAの高用量にOr67d ORN類の報告された応答は、約40 7の範囲である- &gt; 200スパイク/秒6さらに、従来の送達方法とCの VAの無効送達がそうVA C単独ではOr67d ORN類8を活性化するのに十分ではないという解釈につながる、偽陰性の結果に起因する。この解釈は、後で使用する別の研究によりチャレンジしました近距離匂い送達方法9それゆえ、それはイペラ低揮発性の臭気物質を効果的に提示するための強力な臭気供給システムを開発しています。 最近、我々は、Or47b ORNのリガンドとしていくつかの長鎖クチクラ脂肪酸を同定した。彼らはタイプ4 Antennal Trichoid Sensillum（at4）に収容されています。長鎖脂肪酸臭気物質の中で、我々はOr47bのORN類1を活性化することにより、男性の求愛を促進媚薬フェロモンとしてそのパルミトレイン酸機能を発見しました。しかし、従来の臭気送達法を用いた別の研究では、ラウリン酸メチルはOr47b ORNからの応答を誘発することが示されたが、パルミトレイン酸は同じ距離から提示された場合に応答を示さなかった10 。 VA Cと比較して、長鎖脂肪酸は、25°C 11未満で0.001 mmHgの蒸気圧であっても低揮発性です。長鎖脂肪酸臭気物質の本質的に低い揮発性は、経由するアンテナへの効率的な提示を妨げる​​。従来の匂いデリバリーシステムは、偽陰性の結果である可能性が高い10 。この不一致は、低揮発性臭気物質を提示する際の従来の匂い供給システムの不備を強調する。フライクチクラの臭いの効果的な送達には、臭気源と標的組織との間の近接性が必要であることが以前に示された6 。このように、完全に彼らはおそらく、自然12、13でショウジョウバエが遭遇され、そこから距離を模倣しながら、生物学的に活性なフェロモンの効果を特徴づけるために、我々は、最小距離が私たちの手順に高い優先順位を与えられる必要があることに同意しました。 我々の方法は、標準的な電気生理学リグおよび技術との互換性を含むさらなる利点を保持する。既存のリグセットアップでは、このプロトコルに対応するために最小限の変更が必要です。ほとんどのSSR手順では、わずかな調整しか必要ありません。この我々の技術はSSRで経験された研究者に容易にアクセス可能にする。さらに、我々の技術は、神経応答と刺激伝達を相関させる、鋭い発症およびオフセットを伴う低揮発性臭気物質の提示を可能にする。最後に、ハードウェアレイアウトは、ニオイのカートリッジ間の迅速な交換を容易にし、所望の用量範囲にわたってデータ収集を迅速化する。 我々は、参照電極および記録電極、成人ヘムリンパ様（AHL）溶液、付臭剤送達カートリッジ、および対応する嗅覚器の調製を検討することから始める。次に、パルミトレイン酸臭気物質溶液の調製、その後の記録用フライの調製について議論する。我々は、この方法を使用して得られた代表的なデータを提示する前に、トリコイド感知物質を選択し、付臭剤カートリッジの位置をより詳細に記録するための基準を検討することに進む。最後に、このtechniqの有用なアプリケーションを調べることで結論づけますue、いくつかの遭遇した問題、およびその解決策。

<table><tbody><tr><td>Prepセットアップ&その他の材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペットプーラー機器&nbsp;</td><td>Sutter Instruments Novato CA USA</td><td>P97</td>ピ<td>ペットプーラー</td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス毛細血管</td><td>World Precision Instruments Sarasota FL USA</td><td>1B100F-4</td><td>to make holding rods</td></tr><tr><td>アルミノケイ酸ガラス毛細血管&nbsp;</td><td>Sutter Instruments Novato CA USA</td><td>AF100-64-10</td><td>to make electrodes</td></tr><tr><td>Superfrost microscope Slides</td><td>Fisher Scientific Pittsburgh PA USA</td><td>12-550-143</td><td>for fly-prep station</td></tr><tr><td>Permanent Double Sided Tape</td><td>Scotch St. Paul MN USA</td><td>NA for</td><td>fly-prep station</td></tr><tr><td>Upright microscope</td><td>Olympus Shinjuku Tokyo Japan</td><td>BX51</td><td>レコーディングリグ</td></tr><tr><td>Plastalinaモデリング粘土</td><td>Van Aken ノースチャールストンSC米国</td><td>B0019QZMQQ</td><td>、準備ステーション用および保持ロッドを安定させるための</td></tr><tr><td>SFCAメンブレン付きRapid-Flow滅菌使い捨てフィルターユニット、0.45 mm</td><td>Nalgene Rochester NY USA#</td><td>156-4045</td><td>AHL溶液を滅菌する</td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Company&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>カートリッジ材料</td><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;</ストロング></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 & マイクロ;Lピペットチップ&nbsp;</td><td>VWR Radnor PA USA</td><td>53508-810</td><td>臭気カートリッジを作成し、</td></tr><tr><td>準備フィルターペーパー</td><td>Whatman Maidstone Kent UK</td><td>740-E</td><td>臭気カートリッジを作るために&nbsp;</td></tr><tr><td>真空デシケーター&nbsp;</td><td>コールパーマー バーノンヒルズイリノイ州</td>米国<td>VX-06514-30</td><td>エタノール溶剤を気化させる</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>臭気材料</td><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cis-パルミトレイン酸</td><td>Cayman Chemical Ann Arbor MI USA</td><td>#10009871 (CAS # 373-49-9)</td><td>Or47b 臭気</td></tr><tr><td>剤 トランスパルミトレイン酸</td><td>Cayman Chemical Ann Arbor MI USA#</td><td>9001798 (CAS # 10030-73-6)</td><td>Or47b 臭気剤</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Spectrum Chemical MFG.&nbsp; New Brunswick NJ USA</td><td>E1028-500MLGL</td><td>to dilute palmitoleic acid&nbsp;</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Rigセットアップ材料</td><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odorant Cartridge Micromanipulator</td><td>Siskiyou Grants Pass OR USA</td><td>MX130R</td><td>は、嗅覚計</td></tr><tr><td>のFlow Visionソフトウェアを配置します&nbsp;</td><td>Alicat タスコン アリゾナ</td>州 <td>米国 FLOWVISIONSC</td><td>流量を制御するソフトウェア</td></tr><tr><td>質量コントローラー</td><td>Alicat タスコン アリゾナ州 米国</td><td>MC-2SLPM-D</td><td>加湿空気の流量を制御する</td></tr><tr><td>質量コントローラー</td><td>Alicat タスコン アリゾナ州 米国</td><td>MC-500SCCM-D</td><td>臭気刺激の流量を制御する</td></tr><tr><td>Clampex</td><td>Molecular Devices サニーベール CA USA</td><td>Ver. 10.4</td><td>データ収集ソフトウェア</td></tr><tr><td>Air delivery tube</td><td>Ace Glass Vineland NJ USA</td><td>8802-936&nbsp;</td><td>加湿された空気を届けるために</td></tr><tr><td>50倍対物レンズ&nbsp;</td><td>Olympus 新宿 日本</td><td>LMPLFL50X</td><td>レコーディングリグ</td></tr><tr><td>Clampfit 10</td><td>Molecular Devices Sunnyvale CA USA</td><td>Ver. 10.4</td><td>スパイク解析用ソフトウェア&nbsp;</td></tr><tr><td>Igor Pro 6</td><td>WaveMetrics Lake Oswego OR USA</td><td>Ver. 6.37</td><td>データ分析用ソフトウェア&nbsp;</td></tr><tr><td>オーディオモニター</td><td>ALA Scientific Instruments Farmingdale NY US AA</td><td>NPIEXB-AUDIS-08B</td><td>Aurally reports individual spikes</td></tr><tr><td>Extracellular Amplifier</td><td>ALA Scientific Instruments Farmingdale NY</td> US <td>NPIEXT-02F</td><td>to increase the amplitude of electrical signals</td></tr><tr>Valve<td>Controller</td><td>Warner Instruments&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>VC-8</td> 臭<td>気刺激のためのバルブの開度を制御する</td></tr><tr><td>記録電極 マイクロマニピュレーター</td><td>Sutter Instruments Novato CA</td><td>USA MP-285</td><td>記録電極の位置</td></tr><tr><td>Headstage Amplifier</td><td>ALA Scientific Instruments Farmingdale NY US</td><td>EQ-16.0008</td><td>電気信号の振幅を増加させる</td></tr> オ<tr><td>シロスコープ</td><td>Tektronix BeavertonOR USA</td><td>TDS2000C</td><td>個々のスパイクのビジュアルレポート</td></tr></tbody></table>

からの電気生理学的記録<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;低揮発性の臭気物質に対するトリコイドセンシラ

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

昆虫は、食物探索、捕食者回避、産卵、交尾など、生存に不可欠な幅広い行動を導くために、嗅覚に頼っています。変化する揮発性の無数の化学物質は、昆虫の嗅覚受容器ニューロン（ORN）を活性化する天然臭気物質として同定されている。しかしながら、低揮発性臭気物質に対する嗅覚応答の研究は、従来の臭気伝達方法を用いてそのような刺激を効果的に提示することができないことによって妨げられてきた。ここでは、インビボ Single-Sensillum Recording（SSR）の低揮発性臭気物質の効果的な提示を可能にする手順を説明します。臭気源と標的組織との間の距離を最小にすることによって、この方法は、生物学的に顕著なのアプリケーションが、パルミトレイン酸、求愛と交尾行動1に関与ORN類で実証効果を有する刺激性フェロモンを含むこれまでアクセスできない着臭剤、を可能にします。従って、我々の手順は、昆虫嗅覚およびフェロモン通信の研究のための低揮発性臭気物質の宿主をアッセイする新しい手段を提供する。

我々の技術は、パルミトレイン酸のシス （ 図5B ）異性体対トランス （ 図5A ）の相対的有効性を決定するために首尾よく適用された。本発明者らの代表的なデータは、 トランス -パルミトレイン酸が、 シスアイソフォームと比較した場合、Or47b ORNのより有効なリガンドであることを実証する（ 図5C ）。単一のニューロンを各フライから記録し、投与曲線ごとに12個のハエを記録し、合計24個のハエを記録した。集団データは、実験の3回の独立した反復から得られ、それぞれ8枚のハエが記録された。エラーバーは、 注目すべきは、匂いカートリッジの開口部とフライの頭部との間の距離は、記録の結果に重要な影響を及ぼすことで...

このプロトコールの全体的な目標は、長鎖クチクラフェロモンに応答するショウジョウバエの嗅覚受容体ニューロンからの単一感覚記録のための低揮発性の付臭剤を提示する方法を示すことである。

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, ...

この技術の全体的な目標は、電気生理学的記録のために、低揮発性の匂い物質を嗅覚受容体ニューロンとショウジョウバエに効果的に提示することです。これらのニューロンはトリコイドセンシラに収容され、長鎖クチクラフェロモンに反応します。この方法は、改善された臭気伝達技術を提供することにより、昆虫フェロモンコミュニケーションの分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、揮発性が低いために以前はアクセスできなかった匂い物質を、in vivo記録中に効果的に提示できることです。具体的には、フェロモンを近距離から提示し、求愛するオスとターゲットのメスの間の距離をシミュレートします。AT4 録音用の臭気送達カートリッジ コンポーネントの準備は、200 マイクロリットルのピペット チップの狭い端から 0.9 cm 取り外すことから始まります。次に、2番目のピペットチップから、狭い端から1.7センチメートル、幅の広い端から1.5センチメートル取り外して、長さを1.8センチにします。次に、鉗子を使用して、直径1/8インチの濾紙のディスクを1.8センチメートルのセクションの先端に置きます。空気が通過できる小さな開口部を残します。次に、ピペットセクションと小さなセクションを下に角度を付けて固定し、準備を目指します。次に、P10を使用して、濾紙に希望の希釈で臭気物質を塗布します。次に、溶媒を蒸発させるために、装填したカートリッジを真空デシケーターに1時間置いておきます。まずはフライ準備スライドを組み立てます。スライドガラスに、モデリング粘土でカバースリップを取り付け、スライドとカバースリップの間に約3度の角度を作ります。次に、カバースリップの内側の端とカバースリップのすぐ下のスライドの2か所に両面テープを貼り付けます。常に新しいテープを使用してください。次に、目的のフライを吸引器チューブに集めます。次に、200マイクロリットルのピペットチップをチューブの端に取り付け、同時にチューブをフリックしながら、フライをピペットチップの端に押し込みます。次に、かみそりの刃を使用して、フライの体のすぐ下の先端を切ります。次に、先端の広い方の端に成形粘土を慎重にロードして、ハエの頭を小さい方の開口部に押し込みます。両方のアンテナが露出したら、粘土に詰めるのをやめます。次に、鉗子を使用して、プレップをスライドに配置します。クリップを水平に向け、アンテナの側面をテープで留めたカバーの滑り面に当てて配置します。次に、保持ロッドをアリスタに置き、アンテナをテープに固定します。次に、プレップをリグのステージに置きます。アンテナの 3 番目のセグメントの遠位側縁に沿ってトリコイドが見えていることを確認します。センシラは、背景に対してはっきりとしたシルエットである必要があります。約2cmの距離で別々のチューブを介して供給される一定の加湿空気の流れの下で準備を保ちます。録音するには、参照電極をクリペウスに素早く滑らかな動きで挿入します。血リンパと接触するキューティクルのすぐ下に置きます。次に、記録電極がターゲットセンシラムと同じ視野に入るまで、記録電極をゆっくりと下げます。次に、記録電極をセンシラーベースに挿入します。先に進む前に、信号対雑音比が高く、AT4-AおよびAT4-Cニューロンからのスパイクが識別可能であることを確認してください。AT4-Aニューロンは、20ヘルツ以下の速さで発火する必要があります。次に、カートリッジを臭気物質送達チューブに接続します。溶媒制御から始めて、最高臭気物質濃度に向かって進んでください。この場合、パルミトレイン酸カートリッジが取り付けられます。次に、マイクロマニピュレーターを使用して、カートリッジを頭に向けながら、カートリッジをプレップに向かって操作します。カートリッジの先端をアンテナに直接向けるように、約 4 mm の距離から配置します。また、カートリッジはスライドから約 1 mm 上にある必要があります。プレップに対するカートリッジの正確な位置決めは、この手順の最も重要なステップです。一貫したニューロン応答は、試行間でカートリッジの再現性のある位置に依存します。カートリッジは、電極とスライドで密接に縁取られている場合があります。理想的には、どちらの電極からも少なくとも4ミリメートル離れている必要があります。刺激には、臭気フローコントローラーを500ミリ秒バーストに設定し、毎分500ミリリットルの流量を使用します。刺激バーストごとに、電気的活動を10秒間記録します。臭気物質を塗布した後は、カートリッジを慎重に引っ込めてから、次に高濃度のカートリッジと交換してください。その日の録音をすべて行った後、録音電極を蒸留水で十分にすすいでください。7日齢の雄のベルリン野生型ハエについて記載された方法を用いて、トランスパルミトレイン酸とシスパルミトレイン酸の相対的な有効性を比較した。トランスパルミトレイン酸は、Or47b嗅覚受容体ニューロンのより強力な刺激剤でした。各ハエからは、1つのニューロンのみが記録されました。臭気カートリッジの開口部からハエの頭までの距離は、ニューロンの反応に大きな影響を与えました。4ミリメートルでは、パルミトレイン酸に反応してさらに多くのスパイクが発射されました。11ミリメートルの距離では、O47bニューロンによる観察可能な応答はほとんどありませんでした。パルミトレイン酸の近距離提示は、匂い物質としての効果を研究するために非常に重要でした。このビデオをご覧になった後、in vivo の単一感覚記録中にパルミトレイン酸またはその他の低揮発性の匂い物質をショウジョウバエの嗅覚受容体ニューロンに提示する方法を明確に理解していただければ幸いです。この技術を習得すると、1回のフライから全体の投与量曲線を約20分で記録できます。この技術の開発後、この技術は、昆虫の嗅覚の分野の研究者がフェロモン検出のための神経生理学とシグナル伝達メカニズムを探求する道を開きました。

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