Name: 海馬の齧歯動物の脳スライスにおけるシナプス密度の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 学ぶ マウス海馬脳スライスにおけるシナプス密度評価の免疫蛍光法。興奮性・抑制性シナプスの半定量解析により、神経変性疾患におけるシナプス変化の理解に貢献します。

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この作品は、MRC、EU FP7、ARUK、Wellcome の信頼、およびパーキンソン病イギリスによって支えられました。共焦点画像の彼女の貢献および原稿と方法論に対する彼らの建設的な意見のラボのメンバーさんヨハンナ Buchler に感謝したいと思いますも。

総本店動物 (科学的なプロシージャ) の行為 1986 の対象すべてのマウスおよびラットを用いた実験は承認されたスケジュール 1 の手順を使用して実施します。表 1 人工髄液 (アプライド) レシピを見つけることができます。
 1 急性海馬スライス標本 <ol><li>マウス脳をヘラを使ってできるだけ早く削除と鋭いはさみ、頭蓋骨を切り取って冷たいのに、酸素 (95% O 2, 5% CO 2)、。高蔗糖アプライド (~ 100 mL).</li>
	<li>シャーレにマウスの脳を配置し、小脳、前頭葉を脳の正中線を hemisecting 前にメスの小さなセクションを削除します</li>。
	<li>だけカットされた側に 2 つの半球を配置し、vibratome のステージにそれぞれの半球を接着します</li>。
	<li>は、完全な関心領域の 200-300 μ m 厚のセクションをカットしました。海馬の場合半球ごとの約 3-4 スライスを取得必要があります</li>。
	<li>スライスを水中に酸素 (95% O 2, 5% CO 2) 商工会議所プラスチック パスツール ピペットを使用して転送アプライド。34 ° C で 30 分間維持 
	メモ: 組換え Dkk1 タンパク質などのアクティブな薬理学的エージェントとスライスの治療実行できますこの段階でスライス チャンバーにエージェントを追加しています</li>。
	<li>絵筆を使って室内からスライスを削除、24 ウェル プレートに置いて、4% パラホルムアルデヒドで 1 時間 20 分の修正 (常温 (RT) PFA)/4% スクロース 。
	注意: PFA は有毒である、適切な保護具を着用します</li>。
	<li>は、1 × PBS (各 10 分) でスライスを 3 回洗浄します 。
	注: プロトコルを一時停止できるここ 1-2 日のスライスが 4 ° c 1x PBS で保持されます限り</li>。
</ol> 2。シナプス マーカーの蛍光 注: 表 2 で使用されるすべてのバッファーのレシピを見つけることができます。
<ol><li>スライスの井戸/構造のブロック バッファー (表 2) と PBS を交換し 4-6 のための RT で孵化させなさい</li>
	<li>希釈ブロック/透過バッファーで 1:2,000 希釈 vGlut1 抗体ポリクローナル モルモット 。
	注: vGlut1 は、興奮性シナプス前のターミナル可視化のためのマーカーです。シナプスの興奮性シナプスの識別のためには、同じソリューションで psd ファイル 95 と希釈 1: 500 ポリクローナル抗体を使用します。各ウェルに 300 μ L の最小量を使用します。海馬の解剖学的位置を識別するためにまた MAP2 やチューブリンなどの神経構造を識別できる抗体を使用します。正しい選択 (前およびシナプス後細胞) のシナプス マーカー値のすべての一次抗体濃度を新鮮なブロック構造のバッファーで希釈と</li>。
	<li>インキュベート一次抗体溶液中スライス一晩 (または 1-2 日) 4 ° C. 使用活発な動きと振動プラットフォーム</li>。
	<li>PBS (各 10 分) でスライスを 3 回洗浄します</li>。
	<li>は、ブロック バッファーに適切な二次抗体 1: 500 を希釈します。たとえば、vGlut1 モルモット抗体を使用する場合は、特定の fluorophore に活用されるモルモット コンポーネント (例えば、 ロバ アンチ-guinea 豚) を認識する二次抗体を適用します。Psd ファイル 95 ウサギ抗体を使用している場合は異なる特定 fluorophore に活用されるウサギ コンポーネント (ロバ反ウサギ など) を認識する二次抗体を適用します</li>。
	<li>二次抗体は光に敏感、2-3 時間で RT スライスが、光から保護されていることを確認してください。 このソリューションでスライスをインキュベートします。</li>。
	<li>PBS (各 10 分) でスライスを 3 回洗浄します</li>。
	<li>は慎重に絵筆を使って 24 ウェル プレートからスライスを削除し、事前ラベル ガラス スライド上に均等に配置。各スライス上にメディアをマウントの滴を追加し、スライスの上にガラス基板優しく。空気の泡の形成を避けるため。大事に使用して十分なメディアをマウント (300-400 μ L)、量が不足はスライスを乾燥につながる可能性があります</li>。
	<li>RT で 1-2 日の最低を乾燥させると、スライドを光から保護されたままです</li>。
	<li>では、短期的に長期保存のため 4 ° C でスライドを格納、-20 でそれらを保つ ° C</li>
</ol> 3。共焦点画像の取得と解析 <ol><li>共焦点レーザ走査型顕微鏡を用いたイメージングします。
	<ol><li>イメージングする海馬の領域を識別する (例えば、 1 および 3 (CA1、CA3) ・ コルニュ ammonis または海馬歯状回 (DG)) による 10 倍または 20 × 対物</li>。
		40 x または 63 x <li>変更油浸漬目的スライス解剖学はそのまま連続突起を識別することによって、組織構造を確認します。( 図 1 a) の参照として MAP2 などの神経細胞のマーカーを使用します</li>。
		<li>は、その後、油浸対物レンズ × 60 に切り替える (NA = ~1.3 - 1.4) し最適な信号とコントラストを取得する各チャネルの設定を調整します。高/低コントラストのオプションを使用して任意のピクセルの飽和を避けるためにそれぞれのレーザーの強さを設定します 。
		注: これらの設定が使用する顕微鏡によって異なりますが、材料表 図 2 図 3 で使用されるレーザーのパワー設定を参照してください、図 4。最高の結果を得るには、1024 x 1024 ピクセルの解像度を使用します。設定は、同じ実験のさまざまな条件の中で一定でなければなりません。必要な場合、追加のズームを適用ことができます</li>。
		<li>どこでもには染色の深さを評価し、少なくとも 8 等距離の画像のスタックを取得 (250 nm) の飛行機。スライスあたりの金利の同じ領域から 3 隣接する代表的な画像のスタックを取る 。
		注: 深さ別に 1 つのスライスから異なる場合がありますが、スライスの表面から約 2-5 μ m を常にする必要があります</li>。
		<li>1 つの条件、治療グループごとの 6-8 動物から少なくとも 3 スライスの買収を繰り返す</li>。
	</ol></li> <li>画像解析 。
	注: 自動画像解析ソフトウェアを使用 (材料の表 を参照してください)。あれば、無料 ImageJ のようないくつかのシステムがライセンスを必要とすることに注意してください。使用するソフトウェアは、イメージ スタックのすべての面を考慮して 3 d 画像を分析する必要があります。画像解析 ( 図 1) で使用されているソフトウェアの詳細については、材料の表 を参照してください。
	<ol><li>カスタム ベースの強度閾値プロトコルを使用してすべてのシナプス涙点と手動で最適化し、ソフトウェア内で選択が神経細胞のマーカーを識別する [これで使用されている特定のソフトウェアの 材料表 を参照してください。プロトコル]. 
		注: ソフトウェアは各 fluorophore の最小値と最大強度を識別し、各認識されたオブジェクトに対する強度の割合を関連付けます。強度の割合は、使用される蛍光体によって異なります注とシナプス マーカーに対する抗体です</li>。
		<li>シナプス マーカー サイズをフィルター処理することを確認 (&#62; 0.1 μ m 3 と &#60; 0.8µm 3) ソフトウェア内で選択し、イメージに適用します。選択したオブジェクトが重複していないことを確認するためのパラメーターを調整します。大きすぎる、または小さすぎてシナプス涙点を考慮することは、任意のオブジェクトを除外する ( 図 2B 参照). 
		注: 最適化されれば、同じしきい値に適用されます特定の実験内のすべてのイメージ</li>。
		<li>は平均数、強さ、および個々 のシナプス涙点 (前または後シナプス) の量を定量化するソフトウェア内で選択した最適化のしきい値のプロトコルを使用しています。イメージ フィールド (約 16,928 μ m 3 でここで使用されるシステム) のボリュームに涙点数を正規化します。参照神経マーカーの強さに涙点のシナプス強度をノーマライズします 。
		注: シナプス前およびシナプス後細胞のマーカー間の共局在として定義されます。一度前およびシナプス後細胞の涙点 h のしきい値のプロトコルアベニューされて設立され、ソフトウェアが 1 つの平面に 1 ピクセル以上の重なりとしてシナプス涙点の共局在を識別する必要が 。
		メモ: 統計解析、確認正規性および分散の均一性すべてのサンプルのセットに従うことそれぞれ Lilliefords および χ 2 テストによって決定されます。正規分布と均一分散性を示すサンプルは、下記のとおりパラメトリック テストと分析必要があります。たとえば、ブロッキングおよびレプリケーションを持つ一方通行 ANOVA を使用して興奮性シナプス涙点分析を実行する必要があります。それぞれの個々 の実験は、ブロックとして考慮されるべき通常、各条件から 1-3 マウスでそれぞれ 3 つの独立した実験があります</li>。
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1"class="xfigimg"src="/files/ftp_upload/56153/56153fig1.jpg"/> 図 1: 画像解析を用いたシナプス涙点の解析ソフトウェア 輝度しきい値プロトコル カスタマイズの (A) のスクリーン ショット。与えられる例は、PSD-95、選択した点が定義されたサイズである &#62; 0.1 μ m 3 と &#60; 0.8 μ m 3 最小化された重複するオブジェクト。示されているイメージは、簡単に可視化シナプス涙点と正確なパラメーター選択を有効にする 1 つの共焦点平面に注意してください。(B) 解析 (最適化されたプロトコルの選択後) のソフトウェアからの出力のスクリーン ショット。ボリュームに基づいて生シナプス涙点測定の例です。これらの値は、表計算ソフトにエクスポートされます。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig1large.jpg"target="_blank"> この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
 <img alt="Figure 2"class="xfigimg"src="/files/ftp_upload/56153/56153fig2.jpg"/> 図 2: シナプス涙点のスライスとパラメーターの設定の品質チェックします。(A) 代表的な共焦点画像 (40 × 対物) 関心領域の: CA1 地層結腸寄生虫 (sr) そして海馬スライスの地層オリエンス (そう) を識別 MAP2 の汚損によって。スケール バー = 2 μ m。 (B) 共焦点画像 (目的および追加 1.3 X x 60 集録ソフトウェアの倍率) 結腸 CA1 地層寄生虫、興奮性マーカー-vGlut1 (緑) と psd ファイル 95 (赤) の-海馬スライスから。クリア前と後シナプスの涙点の識別に注意してください。0.8 μ m 3 よりも大きい点は、定量化 (白い矢印) から除外されます。スケール バー = 2 μ m (C) 共焦点画像 (目的および追加 1.3 X x 60 集録ソフトウェアの倍率) の CA1 地層結腸の寄生虫興奮性マーカー-vGlut1 (緑) と、-クライオスタット カット全体の脳から海馬セクションからPFA で固定。大きな穴や不規則な周辺固定支持の vGlut1 染色の存在に注意してください。スケール バー = 2 μ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig2large.jpg"target="_blank"> この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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</ol>

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神経科学の分野には、シナプス結合の数の正確な評価が欠かせません。ここでは、モデル システムとしての海馬スライスの地層結腸寄生虫 ca1 のシナプス密度を評価する方法を示します。既存のメソッドに関して意義は単一セクション10によって Wnt 欠乏海馬と我々 もシナプス結合の数を評価の効果に関する私たちの最近の研究の記事で示されます。シナプス損失の大きさが単一セクション EM と脳スライス間で類似メソッドがここで10を説明。したがって、この発見は、精度と技術の信頼性を示します。
重要なは、単一セクション EM の免疫シナプス、ここに示された制限は、特定の脳領域の絶対的なシナプス結合の数を正確に推定できないことです。確かに、総容積の変化がシナプスの数に影響を与えると、グローバルの形態学的変化を識別するために重要です。別の制限は、特定の抗体はシナプス接続の極端な密度のために部分的にそのまま脳の領域を染色でより少なく効率的ということです。高品質 vGlut1 と gephyrin PFA (図 2) で全体の脳の即時の固定に比べて、1 時間の最大のこのスライスの準備とその後の PFA 固定を使用して染色を経験しました。後者は、組織の穴と、周辺固定支持シナプス染色につながった。それにもかかわらず、vGlut1 抗体の浸透はまだ両方の方法 (数十ミクロンの数) に制限されます。我々 はこの制限を克服しなかったも増加抗体培養が、提供抗体浸透イメージ深さの合計より大きい、最終的な結果に影響はないはず。さらに、特別な注意は、染色されるようにも全体にわたって取得すべき。
本研究で我々 は興奮性抑制性シナプスから区別するためにいました。その結果、我々 vGlut1/PSD-95 と選んだ vgat ノックアウト/gephyrin、それぞれ、これらの蛋白質は成体マウス海馬で高発現している、各シナプス サブタイプ4,5に固有。他の興奮性および抑制性シナプス マーカー値が受容体 NMDA 及び AMPA 受容体を含む各シナプスで濃縮など各それぞれシナプスを識別するために使用されている興奮性と抑制性シナプスの GABAA 受容体。22線条体におけるドーパミン作動性シナプスの示すように、特定の抗体が提供されたことを確保する我々 のプロトコルとは、他の神経伝達物質や neuromodulators も識別できます。さらに、120 μ m の各スライスの厚みを減らすは部分的には扁桃体などの小さな脳構造の研究のために不可欠である急性スライスで得られた試料の少量を克服できます。
プロトコルの将来のアプリケーションは、異なる脳領域と障害の研究で実装できます。たとえば、線条体 (パーキンソン病に関連する脳の領域)、vGlut2/PSD-95 または vGlut1/PSD-95 の組み合わせに使える皮質や視床からの求心性神経の興奮性のシナプスを区別それぞれ22。
結論としては、シナプスを定義する前およびシナプス後細胞のマーカーを用いた脳組織におけるシナプスの数を確認する信頼性の高い方法を示しています。重要なステップには、PFA、十分な取付中のアプリケーション、信頼性の高い抗体、適切なイメージの取得設定、および厳格なシナプス涙点検出の使用まで 1 時間の固定時間良い海馬スライスの準備が含まれます。最終的には、このメソッドは比較的短時間、共焦点顕微鏡にアクセスした所、簡単に再現できます。

人間の脳は、約 10 の14のシナプスで構成されます。シナプス結合の数が開発と中枢神経系 (CNS) の成熟の間に堅く調整されます。シナプス結合の数の変調、開発全体を通してシナプス形成と機能的神経ネットワークを形成するために刈り込み。学習と記憶は、シナプス結合の数と強さでシナプス増強とうつ病の1として知られているプロセスの規則によってサポートされます。重要なは、成熟したシナプスの安定化は、神経ネットワーク接続を維持するために不可欠です。さらに、シナプス密度で赤字はアルツハイマー病 (AD)2等に神経変性の初期の段階で報告されています。したがって、正確に識別し、シナプス結合の数を評価する能力は、脳生理学と病理学の評価に不可欠です。
極端な密度とシナプスのコンパクトな性質はそのまま脳の領域の正確な数を推定するために挑戦、です。中枢神経系における化学シナプスは、近い同格、シナプス裂3で区切られた 2 つのニューロンから成っています。シナプス前ターミナル、またはシナプスブートン、軸索から出現し、神経伝達物質シナプスの特異性を定義するを含む蓄積された小胞で構成されています-すなわち、グルタミン酸、γ-アミノ酪酸 (GABA) の興奮と抑制性シナプス、それぞれ。小胞の膜を含む小胞トランスポーター各神経伝達物質に固有: グルタミン酸や GABA の小胞の GABA トランスポーター (vgat ノックアウト)、小胞グルタミン酸トランスポーター (vGlut)。後シナプス受容体、接着分子足場タンパク質など、複数のタンパク質から成る高密度構造であります。興奮性のシナプスのシナプス密度 95 蛋白質 (PSD-95) は、最も豊富な足場蛋白質4、興奮性の N-methyl-D-aspartate(NMDA-) および α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic 酸 (AMPA) 受容体を調節することgephyrin アンカー抑制性シナプス ターミナル5抑制性受容体に対し、機能します。全体的にみて、前およびシナプス後細胞のコンパートメントに蛋白質の特異性は、分化とシナプスのサブタイプの同定支援します。
シナプス結合の数の評価は、さまざまなテクニックを実行できます。最も一般的なは、高倍率と分解能でコンパクトでそのまま脳領域におけるシナプスの分析を可能にする電子顕微鏡 (EM) を使用です。この手法は非常に高価、複雑な前処理を必要とし、非常に時間がかかります。その他のテクニックは、配列トモグラフィ6解析を実行する特殊な高価な機器を必要とするという点で、主要な不利な点を持っているの使用を含みます。さらに、特定のシナプス マーカー値を表現する形質転換線、シナプス数7の評価に有用な新しい行の生成は制限し、高価なをすることができます、望ましくないオフのターゲット蛋白質の過剰発現があります。表現型。
これらの制限のため、簡略化のため、多くの研究者は合計シナプス蛋白質のレベルを調べることによってシナプス結合の数を評価します。ただし、シナプス蛋白質の劣化はありませんが前またはシナプスの同格の散布でシナプス構造の改造結果として、蛋白質の相当な変更の前にシナプス損失を観察できます。さらに、広告、シナプス蛋白質レベルが減少次シナプス変性または神経細胞死8,9です。合計レベルの定量化は、この区別を有効にしません。従って、脳のシナプス結合の数を評価するための信頼性の高い、アクセス、および正確なメソッドを開発する必要があります。
この記事では徹底的に識別し、シナプスを蛍光顕微鏡を用いて海馬齧歯動物脳スライスの数を決定する方法をについて説明します。シナプスは、点状の分布に表示される前およびシナプス後細胞のマーカーの共存によって定義されます。脳における Wnt シグナル伝達の研究を通して本手法の有効性を示す.Wnts は、分泌された蛋白質の形成、除去、およびシナプスのメンテナンスが重要です。Wnt シグナルのカスケード、Dickkopf-1 (Dkk1) の分泌の拮抗薬の生体内で誘導は10海馬の抑制性シナプスを維持しながら興奮性シナプス損失につながります。同定と海馬スライス標本 Dkk1 を表現する大人のマウスからの興奮性および抑制性のシナプスの数を説明をし、他の種類/培養の準備のためにこの手法の伝達性。

<table><tbody><tr><td>ビブラトーム</td><td>ライカ</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>一次抗体</td><td>Millipore</td><td>AB5905</td><td>vGlut1 (1:2000)</td></tr><tr><td>一次抗体</td><td>Thermo Scientific</td><td>MA1-046</td><td>PSD-95 (1:500)</td></tr><tr><td>一次抗体</td><td>Synaptic Systems</td><td>131 004</td><td>vGAT (1:500)</td></tr><tr><td>一次抗体</td><td>Synaptic Systems</td><td>147011</td><td>Gephyrin (1:500)</td></tr><tr><td>一次抗体</td><td>Abcam</td><td>ab5392</td><td>MAP2 (1:10000)</td></tr><tr><td>二次抗体</td><td>Jackson Laboratories</td><td>706-545-148</td><td>Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Flour 488 (1:600)</td></tr><tr><td></td><td>Abcam</td><td>ab175470</td><td>Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600)</td></tr><tr><td>埋込培地</td><td>SouthernBiotech</td><td>00-4958-02</td><td>Fluoromount-G</td></tr><tr><td>Confocal顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>NA</td><td>FV1000 60×1.35の開口数(NA)オイル対物レンズを使用した共焦点顕微鏡。vGlut1 の場合は、出力が 14% のパーセンテージで 488 レーザーを使用します。PSD-95の場合は、559%のパーセンテージ出力の20レーザーを使用します。</td></tr><tr><td>分析ソフトウェア</td><td>PerkinElmer</td><td>NA</td><td>Volocity</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Swann-Morton</td><td>203</td><td>No 11</td></tr><tr><td>Super Glue</td><td>Loctite</td><td>1446875</td><td></td></tr><tr><td>95% O2, 5% CO2</td><td>BOC</td><td>NA</td><td>シリンダー</td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>ガラススライド</td><td>サーモ</td><td>7107</td><td>08-1.0mm厚</td></tr><tr><td>のペトリ皿</td><td>コーニング</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>iDkk1マウス</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>マウスは、tetO Dkk1トランスジェニックマウスとCaMKII&α; rtTA2トランスジェニックマウスを交配することによって得られた。TetO Dkk1トランスジェニックマウスおよびCaMKII&alpha;rtTA2はヘテロ接合状態で交配されました。両方のマウス系統はC57BL/6Jの背景で飼育されました。単一のトランスジェニックおよびWT同腹仔を対照として使用した。</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>溶液用試薬:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>V800372</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO<サブ>4</サブ>シ</td><td>グマ</td><td>255793 KH</td><td></td></tr><tr><td>2PO4</td><td>Σ</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Ca2Cl</td><td>Σ</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Mg2Cl</td><td></td><td>Σ M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>キヌレン酸</td><td>Σ</td><td>K3375</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Σ</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸</td><td>Σ</td><td>107360</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Σ</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>Σ</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Σ</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Σ</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>ロバ セラム</td><td>ミリポア</td><td>S30-100ml</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Σ</td><td>P6148</td><td></td></tr></tbody></table>

海馬の齧歯動物の脳スライスにおけるシナプス密度の評価

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

脳内のシナプスは強度と神経伝達の広がりを決定するニューロン間の特殊結合です。シナプスの数が開発と神経細胞の成熟の間に堅く調整されます。重要なは、シナプス数で赤字は認知機能障害につながることができます。したがって、シナプス結合の数の評価は、神経生物学の不可欠な部分です。ただし、シナプスは、そのまま脳に小さくてコンパクトな絶対数の評価は難しいです。このプロトコルでは、簡単に識別し、蛍光顕微鏡を用いた海馬スライス標本齧歯動物のシナプスを評価する方法について説明します。海馬スライスにおける前及びシナプス後のタンパク質の共局在を分析することによって高品質の共焦点顕微鏡画像におけるシナプスを評価する 3 つの手順が含まれています。また、分析の実行し、興奮性および抑制性のシナプスから代表的な例を与える方法について説明します。このプロトコルは、シナプスの分析のための強固な基盤を提供し、構造と脳の機能を調査している任意の調査に適用することができます。

AD などの神経変性疾患の初期段階で発生するシナプス損失とパーキンソン病2,11,12。ただし、これらの赤字の分子機構のままかり。Wnt シグナル伝達の不備は広告13,14,15,16,17に関連付けられています。Wnts は分泌された糖蛋白質であり、シナプス形成とシナプス伝達18,19,20,21の変調に不可欠な役割を果たします。最近では、成熟した神経系10,22シナプス メンテナンスの主調整装置として Wnts を識別します。我々 は遺伝子改変マウスの海馬におけるシナプスでの wnt シグナルの影響を正確に勉強するには、シナプス結合の数の変化を評価する脳スライス標本と共焦点顕微鏡を利用しました。構造はよく健康的なスライスがわかりました (図 2 a) を保持します。また、おそらく集約されたタンパク質 (図 2 b) を表す大きなステンド グラス オブジェクトの除外と、シナプスの涙点の選択は慎重に定義。この基準は、同じ厳密な解析パラメーターで、すべての画像に適用されました。
大人の中で分泌される Wnt 拮抗 Dkk1 の発現を誘導するトランスジェニック モデル システムを用いてテトラサイクリン下マウス (iDkk1) 制御 (材料の表を参照してください)10,22。私たちは大人の海馬における Wnt シグナルの封鎖が ca1 地層結腸寄生虫 (図 3) 具体的には興奮性シナプス損失を引き起こすことを示した。図 3 aは、興奮前およびシナプス後細胞のマーカーの代表的な共焦点画像を示しています (vGlut1 と PSD-95、それぞれ) Dkk1 それぞれのコントロールと同様に、2 週間の iDkk1 マウスの海馬スライス標本から得られます。ソフトウェア Volocity を使用してこれらのイメージを分析し、iDkk1 マウスの海馬の ca1 における vGlut1 と PSD-95-ラベル付き涙点の共局在によって量を示される、興奮性のシナプスの数を大幅に削減を実証、2 週間 Dkk1 の誘導 (図 3 b、* p &#60; 0.05;クラスカル-ウォリス検定;遺伝子ごと 6 マウス)。CA1 地層結腸寄生虫、1,000 μ m3あたり興奮性シナプス涙点数は制御マウス 500 から 300 iDkk1 マウスに減った。対照的に、誘導の Dkk1 式は図 4 a・ Bに示すように (によって識別される前およびシナプス後細胞マーカー vgat ノックアウトと gephyrin、間の共局在それぞれ) と抑制性シナプスの数は影響しなかった (p &#62; 0.05;クラスカル-ウォリス検定;遺伝子ごと 3 マウス)。
重要なは、スライスやこれらの堅牢な結果を生成するために必要な動物の適切な数を推定する統計的検出力分析を行った。R を使用すると、我々 は約 35 スライス 1 つの条件が必要である計算 (3 画像 x 3 スライス x 6 動物 = 36) 大きな効果のサイズを検出する (f = 0.4) 80% 自信を持って (電源 = 0.8) ブロッキングおよびレプリケーションを持つ一方通行 ANOVA でに記載されているステップ 3.2.6。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig3.jpg"> 
図 3: iDkk1 マウス海馬スライスにおける興奮性シナプスの損失。(A) 代表的な共焦点画像、CA1 地層結腸寄生虫を興奮性シナプス、vGlut1 と psd ファイル 95 (白い矢印) の間の共局在によって識別されます。下のパネルは、強調表示された四角形の高倍率を表します。スケール バー = 2 μ m (B)材料の表に記載されているソフトウェアを使用してコントロールと iDkk1 の間の興奮性シナプスの割合の定量化を行った (* p &#60; 0.05;。クラスカル-ウォリス検定;遺伝子ごと 6 マウス)。データが表される ± SEM. です。この図は、参照10から変更されています。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig4.jpg"> 
図 4: iDkk1 マウス海馬スライスにおける抑制性シナプスを変更します。(A) vgat ノックアウトと gephyrin (白い矢印) の間の共局在によって識別される抑制性シナプスの CA1 地層結腸寄生虫の代表的な共焦点画像。下のパネルは、強調表示された四角形の高倍率を表します。スケール バー = 2 μ m (B) ソフトウェア Volocity を用いて定量化の制御や iDkk1 マウス、間抑制性シナプスの割合 (p &#62; 0.05;。クラスカル-ウォリス検定;遺伝子ごと 3 マウス)。データが表される ± SEM. です。この図は、参照10から変更されています。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>高糖性アプライド コンポーネント</td>
			<td>濃度</td>
			<td>ノート</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>塩化ナトリウム</td>
			<td>75 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>2.5 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4、2 H2O</td>
			<td>1.25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>キヌレン酸</td>
			<td>1.25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ピルビン酸</td>
			<td>2 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>0.1 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>ソリューションの酸素化の後に追加します。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>4 mM</td>
			<td>ソリューションの酸素化の後に追加します。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-グルコース</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ショ糖</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>水中商工会議所アプライド コンポーネント</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>塩化ナトリウム</td>
			<td>125 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>2.5 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4、2 H2O</td>
			<td>1.25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>ソリューションの酸素化の後に追加します。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
</tr></tbody></table>			<td>1 mM</td>
			<td>ソリューションの酸素化の後に追加します。</td>
		
		<tr>
			<td>D-グルコース</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
	

表 1: アプライド成分。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>バッファーのブロック構造</td>
			<td>濃度</td>
			<td>ノート</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ロバ血清</td>
			<td>10%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>トリトン X</td>
			<td>0.50%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x PBS</td>
			<td></td>
			<td>pH 7.4 に</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>塩化ナトリウム</td>
			<td>1.37 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>27 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>18 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 %pfa/4% スクロース</td>
			<td></td>
			<td>pH 7.4 に</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>1 x</td>
			<td>10 倍を希釈します。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>1.33 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ショ糖</td>
			<td>117 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 2: バッファーが免疫蛍光染色に使用されます。

正確に特定および蛍光抗体法を用いた海馬スライスにおけるシナプスの分析のためのプロトコルは、この資料に記載されています。

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

この免疫染色のプロトコルの全体的な目的は、ex vivoの脳切片におけるシナプス密度を評価することです。この手法は神経科学分野における重要な疑問への回答に寄与し、神経変性疾患などで観察されるシナプス密度の変化を研究する際に有用です。本手法の主な利点は、シナプス密度の半定量的な推定が可能であり、同時に調製した実験条件間で比較ができる点にあります。まず、マウス脳をシャーレの上に置きます。次に、メスを用いて小脳と前頭前皮質の小部分を取り除き、脳の正中線を沿って半分に切断します。片方の半球を切断した面に向け、ビブラトームのステージ上に接着します。氷冷したACSFをミクロトームチャンバーに注ぎ、溶液に酸素を供給します。関心領域全体を200から300 micronの厚さで切片にします。海馬の場合、片半球あたり約3枚から4枚のスライスが得られるはずです。プラスチック製パステールピペットを使用して、酸素化ACSFに浸した温度制御チャンバーに切片を移します。34 °Cで30分間保持します。30分経過後、切片を4% sucroseを含む4% paraformaldehydeが入った24ウェルプレートに移し、室温で20分から1時間まで固定します。固定後、スライスを1x PBSで10分間、計3回洗浄します。免疫蛍光染色の準備として、スライスウェルのPBSをブロッキング・透過化緩衝液に置換し、シェーカーを用いて室温で4〜6時間インキュベートします。ブロッキング工程の終了に合わせて、vGlut1に対する抗体をブロッキング・透過化緩衝液で1:2,000に希釈します。この希釈倍率は、使用する抗体のメーカーやロットによって異なる場合があることに注意してください。スライスを一次抗体溶液中で4℃で一晩インキュベートします。激しく動作するシェイカーを使用してください。最適な染色のためには、一次抗体および二次抗体を均一に分布させることが重要です。我々の経験では、激しく振盪させることで抗体を最も効率的に浸透させることができます。一次抗体でのインキュベーション後、前述と同様に、PBSで1回10分間の洗浄を3回行います。最後の洗浄の間、適切な二次抗体をブロッキングバッファーで1:500に希釈します。その後、切片をこの溶液中で室温にて2〜3時間インキュベートします。二次抗体は光に敏感であるため、切片を遮光して保持してください。前述と同様に切片を洗浄した後、筆を使用して24ウェルプレートから切片を慎重に取り出し、あらかじめラベルを貼ったガラススライドの上に均等に配置します。各切片の上に封入剤を1滴滴下します。次に、気泡が入らないように注意しながら、切片の上にガラスカバーガラスをそっと被せます。遮光し、室温で最低3〜4日間スライドを乾燥させます。短期間の保存は4 °Cで行ってください。長期保存の場合は、-20 °Cで保管してください。まず、10倍または20倍の対物レンズを使用して、イメージングを行う海馬の領域（本件ではCA1錐体ニューロンとシャッファー側枝軸索との間のシナプス）を特定します。その後、40倍または63倍の油浸対物レンズに切り替え、連続したニューライトと組織化された構造を確認することで、スライスの解剖学的構造が維持されていることを確認してください。参照用として、MAP2などのニューロンマーカーを使用します。1,024×1,024ピクセルの解像度で、最適な信号強度とコントラストが得られるように各チャンネルの設定を調整します。ピクセルの飽和を防ぐため、各レーザーの強度を設定してください。染色が均一な深さを評価し、少なくとも8つの等間隔な250 nm面を持つ画像スタックを取得するようにソフトウェアを設定します。次に、スライスあたり、同一の関心領域から隣接する代表的なイメージスタックを3つ撮影します。この取得を、条件あたり少なくとも3枚のスライスで、また処理群あたり6〜8匹の動物で繰り返します。興奮性シナプスは、高倍率画像内の白矢印で示されるように、vGlut1とPSD95の共局在によって同定できます。WntアンタゴニストであるDkk1を誘導して成体海馬のWntシグナル伝達を遮断すると、特にCA1の放射状層において興奮性シナプスの喪失が引き起こされます。コントロールマウスとiDkk1マウスにおける興奮性シナプスの割合を定量化したところ、iDkk1トランスジェニック動物において有意に低いことがわかりました。抑制性シナプスは、vGatとGephyrinの共局在によって特定できます。コントロール群とiDkk1マウスの間の抑制性シナプスの割合を定量化した結果、有意な差は認められませんでした。この手順を行う際は、スライスをできるだけ慎重に扱うことが重要です。このビデオを視聴することで、ex vivo脳スライスにおけるシナプス密度の評価方法について十分に理解できたはずです。

evaluation-of-synapse-density-in-hippocampal-rodent-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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海馬の齧歯動物の脳スライスにおけるシナプス密度の評価

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