フーリエ ベース回折分析のライブの線虫

このフーリエベースの回折解析の全体的な目標は、Cエレガンスが3次元空間内を自由に移動するときに、Cエレガンスの移動をリアルタイムで特徴付けることです。この手法は、溶液または運動変異体の異なる密度に対する種の応答を記述することにより、神経生物学の分野における重要な質問に答えることができます。この方法は、微視的種のフーリエ解析のベースラインとして機能します。

これには、すべての微視的な種が独自のフーリエスペクトルを持つという利点があります。この方法は、Cエレガンスの移動に関する洞察を得ることができますが、他の微生物にも適用できます。一般に、この方法に不慣れな個人は、レーザービームの下のキュベット内の線虫を見つけるのが難しいため、苦労するでしょう。

この手法のアイデアは、時間回折信号自体がノイズの多い信号から遊泳行動を学ぼうと試みたことに最初に思いつきました。まず、光学ワークベンチの左奥隅付近にヘリウムネオンレーザーを固定し、電源に接続します。レーザーとサンプルの位置の間にNDフィルターを配置し、レーザービームがフィルターを通過してサンプルに到達するようにします。

2つの前面アルミニウムステアリングミラーを使用して、NDフィルターの後の最初のミラーを固定することにより、潜望鏡を構築します。次に、2 番目のミラーを 1 番目のミラーの約 10 cm 下に固定して、レーザー ビームを操縦するスペースを確保します。ミラーの間にキュベットを挿入し、レーザービームがキュベットを垂直に移動するようにレーザービームとキュベットを位置合わせします。

次に、フォトダイオードを2番目のミラーの真向かいに固定して、センサーがミラーに向くようにします。次に、水で満たされたキュベットをスタンドに置きます。スタンドの高さとミラー1と2の角度を調整して、レーザービームがキュベットを通過し、フォトダイオードに直接ではなく近くに向けられるようにします。

レバーを使用して、スタンドがキュベットの水平面を形成していることを確認します。スタンドが水平でない場合は、水平になるまで適切な調整を行います。最後に、付属のUSBケーブルを使用してフォトダイオードをデジタルオシロスコープに接続し、コンピューターに接続します。

オシロスコープソフトウェアをロードし、サンプルレートを少なくとも8ヘルツに設定して、ワームのトラッシングサイクルを十分に解決します。薄く平らにした白金線ピックを使用して、4匹の成虫を新鮮なNGM寒天充填ペトリプレートに移します。次に、使い捨てのプラスチック製キュベットをパッケージから取り出し、隆起した側面だけに触れるように注意してください。

次に、マイクロピペットを使用して、キュベットが蒸留水で約80%満たされるまで、蒸留水をキュベットにピペットで移します。Cエレガンスが入ったシャーレを解剖スコープの下に置きます。次に、プラチナピックを使用して、成熟したCエレガンスを1つペトリ皿から取り出し、ピックをキュベットに沈めます。

必要に応じて、ピックを円を描くように動かして線虫を取り除きます。線虫は優しく取り扱っており、キュベットを振らないでください。キュベットを振ると、ワームが反応しなくなる場合があります。

キュベットに気泡が形成されるのを防ぐために、キュベットの上部にわずかにくびくまでキュベットに蒸留水を入れます。次に、キャップに水を入れ、キャップをすばやくキュベットに取り付けます。レンズペーパーを使用して、キュベットにこぼれた可能性のある水滴を取り除きます。

さらに、レンズペーパーを使用して、残っている小さな液滴を取り除きます。ヘリウムネオンレーザーをオンにし、赤いビームが生成されるように周波数設定を調整します。次に、センサーをオンにします。

キュベットを隆起した側面に持ち、線虫がキュベットのほぼ中央に来るまでゆっくりと傾けます。次に、キュベットを光学系のスタンドに置き、ミラー1からミラー2に移動するレーザービーム内にウォームを中央に配置します。次に、フォトダイオードの位置と回折パターンの中心最大値が一致しないように、フォトダイオードを回折パターンに配置します。

次に、NDフィルタを回転させて、フォトダイオードから顕著な電圧出力が得られるようにします。フォトダイオードが飽和するのを防ぐために、NDフィルターを使用して光を制限してください。平らな線は、彩度が高すぎるか、強度が不足していることを示します。

移動する回折パターンが見えたら、ソフトウェアの開始ボタンをクリックしてフォトダイオードでデータを収集し、ワームの動きを監視しながらオシロスコープを制御します。ワームがレーザービームから移動し、回折パターンが消えるまで測定を続けます。キュベットに傷がついた場合は、キュベットとワームを廃棄して、最初からやり直してください。

約20秒後、オシロスコープのソフトウェアの停止ボタンをクリックして、データ収集プロセスを停止します。各試用版のデータをカンマ区切り値またはテキスト形式で保存します。表現型ごとに少なくとも50のデータセットを収集し、試行ごとに8〜10匹の動物を使用します。

ここでは、モデル化されたシーケンシャルなウォーム運動とそれに対応する回折パターンの例を示します。モデル化された回折パターンは、質的には実験パターンに類似しており、シミュレーションが線虫を成功裏にモデル化したことを示しています。さらに、ローラーと野生型c線虫の時間的回折シグネチャーを定量的に示すことができます。

ここに見られるように、各線虫は異なる速度と振幅でスラッシュします。平均的なデジタルフーリエ変換により、回折周波数スペクトルの振幅によって線虫を識別できます。野生型のワームスペクトルは、ローラー運動スペクトルよりも低い周波数によって支配されます。

これは、2つの対向する海の動きと考えることができるw振動の例です。対照的に、ローラーはほとんどの場合、片側にcを形成し、このように見えます。周波数を調べると、w運動はより複雑で、c運動よりも二次的な低周波数が多く明らかになります。

一度習得すると、手法が適切に実行されれば、1つのデータセットを約2分で収集できます。一連のデータセットの光学系のセットアップには、約 20 分から 30 分かかります。この手順を試みるときは、Cエレガンスを慎重に取り扱って、移動の完全性を保つことを忘れないでください。

この手順に従って、トラクターの再構築や非線形解析などの他の方法を適用して、Cエレガンスの動きについて詳しく知ることができます。その開発後、この技術は、神経生物学の研究者がCエレガンスの運動変異体をより深く研究する道を開きました。このビデオを見れば、生きた線虫の回折パターンを生成する方法と、それらを分析する方法について、かなりよく理解できるはずです。

レーザーでの作業は非常に危険である可能性があるため、手順を実行する際にはレーザーを目の高さで移動させないなどの予防策を講じる必要があることを忘れないでください。