Name: 合成アミロイド β 蛋白の脳室内投与によるラットの動物モデルにおけるアルツハイマー病の貴重な模倣の確立 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 学ぶアルツハイマー病のラット動物モデル構築法。Aβ25-35と塩化アルミニウム、TGF-β1を脳室内投与し、Morris水迷路で空間記憶障害と神経病理変化を評価します。薬物スクリーニングに有用です。

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プロジェクトが河北地方自然科学基金 (号によって支えられました。C2009001007, H2014406048), 伝統的な中国医学 (号 05027)、河北地方行政と河北省の大学、中国の主要な建設プロジェクト。

このプロシージャは、1988 年 10 月 31 日の州委員会の科学および技術の中国が発行した実験動物管理の規則に従ってだった11。科学者は、設立し、機関と国立動物規制組織によって承認されたガイドラインに従う必要があります。
注: 動物・試薬: 4 ヶ月歳雄 Sprague-dawley ラット (300-350 g) はこの実験のために供給されました。すべてのラットは、グループ (4 またはケージごと 5) 温度 23 ± 1 ° C 12 時間の明暗サイクルで収容されました。食料と水は、利用可能な自由をだった。ラット 7 日間、プロシージャが実行される前に、の住宅の条件に順応しました。Aβ25 35 1 mg/mL に 1 %dmso 生理食塩水に溶解し、超音波発振器を完全に溶解するまでに 5 分間超音波処理します。AlCl3とヒトリコンビ β 1 がそれぞれ 1% と 0.1 mg/mL の生理食塩水に溶解しました。コンゴ赤、銀製硝酸塩および他の化学物質分析成績普通商業ソースから購入したと。
1. 手術
注: 20 雄 Sprague-dawley ラット側脳室と anterodorsal 視床核に合成 a β で microinjected、合成 a β 投与群として指定します。別 20 ラット同じ操作を受けたが 0.1 %dmso 生理食塩水マイクロインジェクションを受け取った、sham グループとして指定します。
<ol><li>吸入することによって 100% イソフルランとラットを anaesthetize し、脳定位装置に抑制します。</li>
	<li>手術用ハサミで、頭の頂点に毛皮を剃るし、iodophor で消毒します。頭に使い捨て手術用タオルを取り上げてください。</li>
	<li>手術柳葉とはさみ中央縦頭蓋骨に沿って頭の皮膚に切開を行います。</li>
	<li>皮下組織と筋膜を分離、出血を停止するための滅菌乾燥綿と頭蓋骨 calvarium を一掃し、前マーカーペンで印をつけます。</li>
	<li>ラットを参照して脳定位地図12;原点として前を考える 3 つのポイント、anterodorsal の視床核 (ad) をマーク (後方 (P): 前 2.0 mm; 横:l: 正中線に 1.4 mm) 固定 1 つねじ、側脳室 (LV) エリア (ヒトリコンビ β 1 を注入します。後方 (P):; 前に 0.8 mm横:l: 正中線 2.0 mm) Aβ25 35 と AlCl3 と場所を固定 2 番目のネジを注入するため (フロント (F): 前 2.0 mm; 横:l: 正中線に 1.5 mm 厚)。</li>
	<li>優しく柔軟な骨ドリルと頭蓋骨の上記の 3 つの点で示される 3 つの直径 1 mm の穴をドリル (1.5。 ステップ)。脳組織を刺しを避けるために必要なより深いを台無ししてください。</li>
	<li>出血を止めるし、繰り返し滅菌乾燥綿と頭蓋骨の表面をきれいにします。</li>
	<li>4.6 mm の深さで脳に、マイクロ注入ポンプにリンクされている針を挿入し、優しく 1 μ L を注入ヒトリコンビ β 1 (10 ng) 広告領域に。注射後の針 2 分の滞在し、針 (補足ファイル 1) をゆっくりと抜きます。</li>
	<li>広告と 2 番目のねじ固定の頭蓋骨の場所の点で示される、頭蓋骨に 2 本のネジを修正 (1.5 で指定する。 手順) を小型のドライバー。脳組織を刺しを避けるために必要なより深いを台無ししてください。</li>
	<li>高圧による消毒後ガイド カニューレにダミーのカニューレを挿入、カニューレ注入装置 (補足ファイル 2) を組み立てます。</li>
	<li>頭蓋骨の穴 (補足ファイル 3) LV エリアにラットの脳定位固定装置のカニューレ ホルダーの助けを借りて 4.6 mm で脳にステンレス鋼チューブ ガイド カニューレを挿入します。</li>
	<li>ミックス 1 mL あたり 1.5 g の割合で義歯基本水と義歯床用基材は、ガイド カニューレ プラスチック台座と皮膚感染症を回避するため全体の皮膚切開のカバーまでガイド カニューレを固定する 2 本のネジをカバーするペーストを置きます。</li>
	<li>操作の 2 日目、小動物麻酔器を用いたイソフルラン吸入とラットを anaesthetize します。ダミーのカニューレを引き出すガイド カニューレに内部カニューレを挿入し、内部カニューレを固定するネジを固定。</li>
	<li>内部カニューレにポリエチレン管のインジェクション ポンプをリンクするをセットし、1 μ L/分 Microinject Aβ25 35 または LV へ AlCl3 に注入速度を調節します。</li>
	<li>4 μ g (1 μ L) を microinject、午後のイソフルラン麻酔下で 5 日間に毎日朝と 3 μ L AlCl3 (1%) で 14 日 Aβ25 35。</li>
	<li>射出が完了後 5 分を待つ、優しく内部カニューレを引き出すし、再びガイド カニューレにダミーのカニューレを挿入します。</li>
	<li>(これは最後の Aβ25 35 の注射日に対応) 15 日目術後のカニューレの注入システムを解体します。優しく外科はさみ鉗子と義歯ベース材料ソリッドを削除、2 本のネジを外し、ガイド カニューレを抜く、betadine で傷を消毒します。骨セメントと頭蓋骨の穴を埋めるし、単純な縫合法で皮膚を縫合します。</li>
	<li>偽手術群と同じ操作を実行し、0.1 %dmso 生理食塩水を microinject します。</li>
	<li>
術後の看護
	<ol>
<li>術後後 1 檻あたり 2 匹のラットを家し、30 日のための食糧を提供します。 注: 偽運営グループ生き残った (90% の成功率の操作)、18 のラットと生き残った扱われる合成 a β のグループ (操作の 95% の成功率) で 19 ラット。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 正常モデルのラットとモリス水迷路空間記憶の評価のためのスクリーニング
<ol><li>
モリス水迷路 注: モリス水迷路は、ラットの空間記憶13を評価するために使用されました。モリス水迷路は、直径 120 cm、深さ 50 cm ステンレス鋼円形タンクです。水迷路試験は、行動神経科学 j. ヌネス14で説明されている「ゴールド スタンダード」のパラダイムに基づいて行った。<ol>
<li>食品着色料を数滴でプールの水を黒きます。</li>
		<li>31.5 cm で水と温度 23 ± の深さを維持 1 ° C</li>
		<li>水面下 1.5 cm の円形の透明なプレキシ ガラスのプラットフォームを設定します。</li>
		<li>水迷路試験中は水迷路の周りのすべての空間信号、変数を維持します。</li>
		<li>わかりやすいデータ収集のための架空の線によって 4 同じ象限にプールを分割します。</li>
		<li>水迷路の第一象限 (Q1) に隠されたプラットフォームを配置します。</li>
		<li>コンピュータ ベースのグラフィック分析ソフトウェアにリンクされている水迷路上ビデオ カメラを通じて水泳行動 (待機時間、軌道、または交差数によって測定) ラットをキャプチャします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
成功モデル合成 a β 投与ラットのスクリーニング
	<ol>
<li>手術の日 45、モリス水迷路画面の記憶障害と成功モデル ラットとスクリーニング率 (SR) を収集する連続 4 日間トレーニングを実行します。 注: SR は、各合成 a β 投与のラットの平均遅延時間として定義され、sham 群ラットは水の下で隠されたプラットフォームを見つける表面の水の 4 日目のトレーニングを迷路。隠されたプラットフォームを検索する各合成 a β 投与のラットの平均待機時間は、"a"と"B"はラットの水迷路トレーニング、次の方程式での 4 日目に隠されたプラットフォームを見つけるための偽手術群の平均待機時間。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56157/56157eq1.jpg"> SR が 1 つの合成 a β 投与ラットの 0.2 を超える頃、ラットは成功モデル ラット合成 a β 投与ラット15のメモリの障害とみなされました。日中のメモリ パフォーマンス 2 試験のデータに隠されたプラットフォームを見つけるためのラットの平均値を求めた。ラットが迷路水槽と 60 の内で隠されたプラットフォームの検索で泳ぐことができました。 そのモーリス水迷路試験のプロセスが設計された s。ネズミが 60 の内で隠されたプラットフォームを確認していないかどうか s、それからラットは、実験者の手でプラットフォームに置かれました。ラットに隠されたプラットフォームに達したとき (単独または、アシステッド)、ラットがさせた滞在 20 s。ラットだったタンクから削除され、10 の物理的な回復を許可し、s 2 の試験の間。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 神経検査
<ol><li>イソフルラン麻酔下の日 86 ポスト外科斬首 (図 1) でラットを安楽死させます。</li>
	<li>氷に脳を置いて、そっと、縫で 2 つの半球を分けます。視交叉とニューロン ヘマトキシリンとエオシン (HE)、コンゴ赤、または硝酸銀光顕微鏡観察のための 4% のホルムアルデヒドの修正の左の脳半球はステイン (セクション 4-6 を参照) を取る。電子顕微鏡観察 (セクション 7) の 2.5% グルタルアルデヒドで右半球の海馬 CA1 領域を修正します。</li>
	<li>光/電子顕微鏡試料の調製、前述の16,17として脳を処理します。</li>
</ol>4. 神経彼を汚す
<ol><li>ヒューム フードの蒸留水にグラデーション アルコール (100%、95%、90%、80%、70% アルコール) と各スライド (各 20 分) を deparaffinize します。</li>
	<li>ヘマトキシリン (0.5 %w/v)、3 分のため、スライドから非連結の色素を削除する水道水で洗い流し。</li>
	<li>1 アルコール 0.1% 塩酸で洗浄無染色核の色を削除する s。</li>
	<li>背景に明るい青まで 2 分の 0.5% アンモニア溶液に浸します。</li>
	<li>1 分 1% エオシン染色。</li>
	<li>グラデーション アルコール (70%、80%、90%、95%、100% アルコール) で 5 分間脱水します。</li>
	<li>キシレンでクリアし、メディアを樹脂製マウントをマウントします。</li>
	<li>観察し、実験的なデザインに目がくらんで人によって光学顕微鏡で海馬の中間の CA1 0.125 mm 単位および 0.0352 mm2 400 倍の倍率で大脳皮質の HE 染色の生きている神経細胞を数えます。</li>
</ol>5. コンゴ赤染色ニューロン a β 負担を試金するため
<ol><li>ヒューム フードの蒸留水にグラデーション アルコール (100%、95%、90%、80%、70% アルコール) と各スライド (20 分) を deparaffinize します。</li>
	<li>作業ソリューション (0.5 g コンゴ赤、80 mL のメチルアルコール、20 mL glycerinum) コンゴ赤染色 20 分。</li>
	<li>5 分間蒸留水ですすぎ。</li>
	<li>3 のアルカリの 80% のアルコール溶液 (0.2 g アルコール/100 mL の水酸化カリウム) ですぐに区別する s。</li>
	<li>蒸留水で 5 分ごと 2 回すすいでください。</li>
	<li>3 分のギルのヘマトキシリンで対比染色。</li>
	<li>2 分間水道水ですすいでください。</li>
	<li>アンモニア水に浸し (水道水とよく混合する水酸化アンモニウムを数滴を追加) 30 s またはセクションが青色に変わります。</li>
	<li>5 分間水道水ですすいでください。</li>
	<li>グラデーション アルコール (70%、80%、90%、95%、100% アルコール) で脱水します。</li>
	<li>キシレンでクリアし、メディアを樹脂製マウントをマウントします。</li>
	<li>観察し、実験的なデザインに目がくらんで人によって光学顕微鏡で 400 倍の倍率でコンゴーレッドで染色のセルをカウントします。</li>
</ol>6. 銀製硝酸塩の汚損ニューロン NFT 形成を試金するため
<ol><li>ヒューム フードの蒸留水にグラデーション アルコール (100%、95%、90%、80%、70% アルコール) と各スライド (20 分) を deparaffinize します。</li>
	<li>20% 硝酸銀溶液と暗闇の中 20 分のキャッピング剤に浸します。</li>
	<li>2 回、各時間に 5 分の蒸留水で洗浄します。</li>
	<li>銀アンモニア溶液に浸します。20% 硝酸銀溶液、アンモニア溶液にドロップし、ソリューションが明確に濁度からまでを追加します。同時に、15 分のガラス棒を使ってソリューションをかき混ぜるし、2 分間水酸化アンモニウム 1% 希釈に入れます。</li>
	<li>軸索の黒いブロックが見られるまで 3-7 分の現像作業液にスライドを配置します。</li>
	<li>1 分の希釈 0.1% アンモニア溶液に浸すし、1 分の水で洗い流し。</li>
	<li>処分するとチオ硫酸ナトリウム 5 %2 分と 5 分の水で洗い流し。</li>
	<li>グラデーション アルコール (70%、80%、90%、95%、100% アルコール) で脱水します。</li>
	<li>キシレンでクリアし、メディアを樹脂製マウントをマウントします。</li>
	<li>観察、実験的なデザインに目がくらんで人によって光学顕微鏡で 400 倍の倍率で硝酸銀染色用のセルを記録します。</li>
</ol>7. 海馬ニューロンの微細構造計測
<ol><li>複数のキューブ (1 mm3x 1 x 1) にラット海馬 CA1 を切り取り、4 ° C で 2 時間 2.5% グルタルアルデヒドで置く</li>
	<li>(PH 7.2 では、時間ごとに 10 分) 時間 PBS 3 つのキューブをすすいでください。</li>
	<li>4 ° C で 2 時間 1 %osmic 酸でキューブを修正します。</li>
	<li>二重蒸留水 3 でキューブをリンス (各時間 10 分) x。</li>
	<li>グラデーション アルコール 50%、70%、90% (10 分ごと)、100 %2 回 (各時間 15 分) を脱水します。</li>
	<li>酸化プロピレン 2 回 (各時間 15 分)、プロピレン酸化物: 1:1 (たびに室温で 60 分) 樹脂とプロピレン酸化物: 樹脂 1:4 (たびに室温で 60 分) で交換してください。樹脂 (120 分、室温で) に浸します。</li>
	<li>EPON 812 に埋め込むし、重合 (5 時間/35 ° C、5 h/60 ° C、5 h/80 ° C)。</li>
	<li>グリコールメタクリル セクション (1 μ m) をカット、メチレン ブルーで染色し、顕微鏡下でローカライズします。</li>
	<li>超薄切片を染色 (50 nm) 酢酸ウラン o と鉛のクエン酸と。</li>
	<li>JEM 1400 電子顕微鏡と収集画像の下を確認します。</li>
</ol>

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学習と記憶の損失が AD 患者2の主な臨床症状であることが知られています。ここで説明する手順は広告; を勉強する体内法です。我々 は、記憶障害とラット モデル4では神経の傷害を軽減する薬をテスト以前に公開されたプロトコルを適応しています。我々 のプロトコルが正常にモデルの動作、記憶障害、神経細胞傷害、a β の負担と NFT 蒸着、(今回の実験では、生存率における広告を模倣する動物の高い生存率と同様に、貴重なデータを取得するの重要な詳細を提供します操作の成功モデル率 90% 以上)。これらの成功したモデルのラットは、モリス水迷路試験で自分の空間記憶を測定する使用されました。位置決めのナビゲーション試験の結果、合成 a β がラット記憶獲得障害; を引き起こす可能性プローブ試験の結果、合成 a β がラット メモリ保存を減らすことができます。逆転のトライは、合成 a β はラットの学習障害を再れることが発見しました。これらのモリス水迷路試験データを示す合成 a β がラットの空間記憶を誘発することができます。全体的にみて、AlCl3と TGF-β 1 との組み合わせで Aβ25 35 のラット脳室内投与によるを注入、実現可能かつ信頼できる生体内で広告のような動物モデル研究所が作成されます。
以前の研究では、AD 患者における脳の容積が 10% 未満である健康な人のことを示しています。目視による様々 な萎縮大脳半球にあります。皮質の萎縮の程度は積極的に関連メモリ減損19。、組織の多数のニューロンの損失と厳しい形態病理学は直接 AD 患者20のメモリ機能を妨げます。本研究では光/電子顕微鏡観察は、合成 a β と microinjected ラットに劇的な神経病理学的変化、ニューロンの損失、および神経細胞および細胞レベル下の構造の中断を含むが表示されることを発見しました。この結果は、合成 a β により誘導されるラットの空間記憶障害を裏付ける、AD 患者の状態に似ています。
脳 β 負担と NFT 集計が考慮されている最も重要な histopathogenic 特徴広告で知られています。神経の構造を破壊、神経シグナルを邪魔、神経機能を混乱させるし、進行した認知症17は、できます。現在の動物モデルは、AD 患者状態に同意する脳の a β の負担と NFT 集計を発見しました。したがって、合成 a β 投与ラットにおける存在のニューロン損傷は、神経病理学や AD の治療戦略を研究するモデルとして使用できます。
広告モデルで薬効をスクリーニングの例: 趙ら、茎および葉 (SSF) の両方に含まれるフラボノイド オウゴン オウゴン barbata (SBF) は、ラットの記憶障害とアポトーシスを減衰させることを報告合成 a β8,9。郭ら、また SBF が NFT の集約と、Ser199、Ser214、Ser202、Ser404、および Thr231 の側で蛋白過剰リン酸化を抑制でき、合成 a β 投与ラット21 における GSK 3、CDK5、および PKA タンパクと mRNA 発現の減少を報告.同時に、香ら、アストロ サイトやミクログリアの増殖と低 Aβ1 40, Aβ1-42, SBF を抑制でき、割断酵素 1 (BACE1) β サイト アプリ合成 a β の脳における mRNA 発現ラット22も報告しています。上記の結果に基づいて、我々 の動物モデルより多くの神経細胞の機能と構造の障害を含むその他の広告のようなモデルに有利です。
他の広告のようなモデルについてラットに a β の単一脳室内投与ラットの記憶障害、ニューロンの損失、および neurogliocyte の増殖を引き起こす可能性しますが、NFT と a β 沈着23がない可能性があります。高用量アルに暴露したラット脳内記憶障害、ニューロンの損失、neurogliocyte 増殖と老人斑 (SP) と NFT 集計のコスト効果の高い動物モデル、模倣広告、高い成功率を持って表示されます。アルの高用量は、ラット肝傷害を引き起こす可能性があり、食欲不振を伴う減少重量24。高齢ラットは、別の広告のようなモデルです。高齢ラット記憶障害、神経細胞の構造/構造病理学的変化、リポフスチン沈着を示す β 負担と NFT の集計はありません。年齢の 24 ヶ月以上のラットは、このモデルの高齢者と見なされます、したがってしたがってコストは高い17,25して餌の長い期間が必要です。SAMP8 と APP トランスジェニック マウスは広告に最も近い模倣、広告を調査するため、最も理想的なモデルです。両方の動物モデルは高い値段、研究室26,27使用に限定。上記の動物モデルと比較して、合成 a β 治療動物モデルの我々 のモデルが低コスト、高パフォーマンス、それの広告を研究するための理想的なツールを作るします。
結論としては、Aβ25 35 の脳室内投与を併用した AlCl3ラットに TGF-β 1 が空間記憶障害、神経損傷、a β の負担、NFT 沈着を理解する貴重な生体内で動物モデルを提供広告の基礎となります。このモデルは、高速を提供し、高い動物と比較的簡単な実験プロトコル生き残る率高いモデル操作の成功率とより経済的であることを示したの重複率が高い。現在の動物モデル広告を模倣するための効果的なモデルであり、様々 な他の疾患を模倣する使用された自体をさらに検証することができます。

広告が主な臨床的症候群として漸進的な記憶喪失と、慢性で進行性の神経変性疾患であることが知られています。一般病理学では神経組織の萎縮、神経細胞シナプス損失と神経細胞の構造と機能障害、すべては開発と広告1,2の臨床症状に関与しています。動物の脳室内投与による a β を注入した頃、いくつかの神経毒性のイベントはニューロンの損失、カルシウム恒常性の中断、ニューロンのアポトーシスおよび活性酸素種の過剰産生3を含む脳で発生するとされます。複数の要因は、AD の発症に関与しているし、広告のより良いモデルを確立することが不可欠といえます。
生体内で模倣広告モデル Aβ25 35、AlCl3、ラット ヒトリコンビ β 1 の anterodorsal 視床核注入併用の脳室内投与を確立するための詳しいプロトコルが記載されています。このラットの modelhighly 模倣人間の神経機能と記憶障害、ニューロンの損失や被害、アポトーシス、細胞内 a β の負担、NFT 集計4,5,6など広告の形態病理発生,7,8,9.、AlCl3は可溶性 a β を防ぎますに堆積した a β とヒトリコンビ β 1 が堆積した a β の生産を促進し、広告発生10を促進します。ニューロンにいくつかの要因からこの攻撃は、広告の複数の病因に基づきです。
実験全体 86 日間のスパン:図 1動物の外科手術、動物モデルのスクリーニング、動物の空間記憶のテスト、サンプル準備の時点で、実験的なデザインのタイムラインを示しています。操作の最初の日、ヒトリコンビ β 1 は anterodorsal の視床核に microinjected だった。操作の 2 日目、Aβ25 35、AlCl3が microinjected 側脳室に毎日朝 14 の連続した日の午後、5 日間連続それぞれ。すべてのラットは、術後後 45 日間の回復を許可されました。モリス水迷路は、記憶障害と成功モデル ラット用画面にラットの空間記憶を評価するために使用されました。ラットを受けた水迷路 1 日あたり 2 試験とトレーニングの 4 日連続とトレーニングの日 4、ラットは記憶障害のモリス水迷路のパフォーマンスを評価しました。すべてのラットは動物モデルのスクリーニングの後 37日を供給する続けた。ラットの空間記憶は以上 7 日間連続、手術後 85 日 79 日からモリス水迷路の中でテストされました。すべてのラットが脳のサンプル準備のための 86 日斬首で犠牲になった。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56157/56157fig1.jpg"> 図 1。実験的なデザインのタイムライン。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56157/56157fig1large.jpg">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

<table><tbody><tr><td>Sprague-Dawley rat</td><td>Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd, China</td><td>SCXK(Jing) 2012-0001</td><td>300–350 g</td></tr><tr><td>モリス水迷路</td><td>中国医学院と北京連合医学研究所、中国</td><td>可動小</td>動物麻酔なし <td></td></tr><tr><td></td><td>RWD ライフサイエンス株式会社 中国</td><td>R580</td><td></td></tr><tr><td>脳定位固定装置</td><td>RWD ライフサイエンス株式会社 中国</td><td>68001</td><td></td></tr><tr><td>フレキシブルボーンドリル</td><td>上海ソフトロング技術開発有限公司 中国</td><td>BW-sD908</td><td></td></tr><tr><td>透過型電子顕微鏡</td><td>日本株式会社</td><td>JEM-1400</td><td></td></tr><tr><td>2チャンネルマイクロインジェクションポンプ</td><td>RWD ライフサイエンス株式会社 中国</td><td>RWD202</td><td></td></tr><tr><td>EMミクロトーム</td><td>日立製作所 中国</td><td>H-7650</td><td></td></tr><tr><td>ダミーカニューレ</td><td>RWD ライフサイエンス株式会社 中国</td><td>62001</td><td>0.D.0.64×I.D.0.0.45mm/M3.5 http://www.rwdls.com/English/Product/3985102014.html</td></tr><tr><td>ガイドカニューレ</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. 中国</td><td>62101</td><td>0.D.0.40mm/M3.5</td></tr><tr><td>内部カニューレ</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. 中国</td><td>62201</td><td>0.D.0.41×I.D.0.25mm/<img alt="Special" src="/files/ftp_upload/56157/special01.jpg">M3.5</td></tr><tr><td>ナットを締める</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. 中国</td><td>62501</td><td>0.D.5.5mm/L7.5mm/M3.5</td></tr><tr><td>固定ネジ</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. 中国</td><td>62514</td><td>M1.2×L2.0mm(100BAO)</td></tr><tr><td>ドライバーRWD</td><td>ライフサイエンス株式会社中国</td><td>62999</td><td>45 * 1mm</td></tr><tr><td>PEチューブ</td><td>RWDライフサイエンス株式会社中国</td><td>62302</td><td></td></tr>ア<tr><td>ミロイドベータ25-35</td>シ<td>グマアルドリッチ株式会社米国</td><td>SCP0002-5MG</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトトランスフォーミング成長因子-&amp;ベータ;1</td><td>PeproTech Inc. USA</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>三塩化アルミニウム</td><td>Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. 中国</td><td>3011080</td><td></td></tr><tr><td>コンゴレッド</td><td>Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. China</td><td>3010016</td><td></td></tr><tr><td>Silver nitrate</td><td>Sinopharm Chcmical Reagent Co., Ltd. China</td><td>20150720</td><td></td></tr><tr><td>Technoure Base Material</td><td>Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd.Ltd. 中国</td><td>20170609</td><td></td></tr></tbody></table>

合成アミロイド β 蛋白の脳室内投与によるラットの動物モデルにおけるアルツハイマー病の貴重な模倣の確立

Establishment of a Valuable Mimic of Alzheimer's Disease in Rat Animal Model by Intracerebroventricular Injection of Composited Amyloid Beta Protein

アルツハイマー病 (AD) はゆっくりとメモリを破壊してニューロンの損失と構造変更を伴う不可逆的、進行性の脳の病気です。世界中のアトピー患者さんの増加に伴い、病理・疾患の治療国際製薬産業の焦点となっています。したがって、研究所の広告を模倣する動物モデルの確立は、非常に重要なのです。
ここでは、ラットの動物で広告の模倣を確立するための詳しいプロトコルについて述べるモデルがアミロイド β タンパク質 25-35 (Aβ25-35) 三塩化アルミニウム (AlCl3) と anterodorsal の視床核の脳室内注入遺伝子組換えヒト成長因子 β 1 (ヒトリコンビ β 1) ラットへの変換の注入。広告の関連マーカーを測定し, を含む: 神経もつれ (NFT) 生産と神経 β 構造神経構造空間記憶。このラットのモデル空間記憶障害、神経細胞の構造と下部組織の病理学的変化、ニューロン細胞内の a β の負担、NFT 集計例を示します、神経の構造と機能障害の臨床に近い模倣アトピーの患者さん。したがって、提示された広告ラット modelprovides 広告の薬剤のスクリーニング、神経病理学、神経機能を探索するため生体内で貴重なツールです。

および Aβ25 35 の注入による凝集、原線維変化を組み合わせたラットの空間記憶障害、神経細胞の病理学的変化、神経のアミロイド β 蛋白 (a β) 負担の評価によるアルツハイマー病を模倣するプロトコルです。三塩化アルミニウムと遺伝子組換えの人間成長因子 β 1 を変換します。

Alzheimer&#39;s disease (AD) is an irreversible, progressive brain disease that slowly destroys memory and is accompanied by neuron loss and structure ...

この手法は、アルツハイマー病などの神経変性疾患分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、A-beta 25-35を塩化アルミニウムおよびリコンビナントヒト変換成長因子ベータ1と併用して脳室内投与することにより、ラット動物モデルにおいてアルツハイマー病を模倣できる点にあります。また、本手法は迅速かつ比較的簡便な実験プロトコルを提供し、動物の生存率、モデル作成の成功率、および再現性が高く、より経済的であることが示されています。この手法の意義は、この動物モデルがAD患者の状態に近い記憶障害および神経学的乱れを有しているため、ADに対する薬物の有効性スクリーニングへの応用にまで及びます。手順のデモンストレーションは、私の研究室の技術者であるCheng Jianjunが行います。麻酔をかけたラットの頭頂部の被毛を外科用ハサミで切り落とし、ポビドンヨードで消毒することから開始します。次に、外科用メスとハサミを用いて、頭蓋骨正中線に沿って頭部の皮膚を切開します。皮下組織と筋膜を剥離し、頭蓋冠を0.3%過酸化水素で拭き取り、マーカーペンでブレグマを標記します。続いて、RHTGF beta oneの注入および1本目のネジの固定に用いる視床前背側核、A-beta 25-35およびAICI3を注入する側脳室（LV）領域、そして最後に2本目のネジの固定箇所の3点を標記します。フレキシブルボンドリルを用いて、頭蓋骨上の標記された3点に直径1 mmの穴を慎重に3か所あけます。止血を行い、滅菌済みのドライコットンで頭蓋骨表面を繰り返し清拭します。次に、マイクロインジェクションポンプに接続した針を脳内の深さ4.2 mmまで刺入し、ad領域にRHTGF beta oneを1 µL緩慢に注入します。注入後2分間、マイクロインジェクション針をそのまま保持します。その後、ゆっくりと針を引き抜きます。小型のドライバーを用いて、 previously marking した点に指定された2本のネジを頭蓋骨に固定してください。スクリューを配置した後、75%アルコールに24時間浸漬して消毒したダミーカニューレをガイドカニューレに挿入し、カニューレ植込システムを組み立てます。次に、ラットの定位固定装置に取り付けたカニューレホルダーを用いて、頭蓋骨の孔を通してステンレス製チューブガイドカニューレを脳のLV領域に4.6 mmの深さまで挿入します。続いて、義歯用義歯床材と義歯床用水分を、1 mLあたり1.5 gの割合で混合します。ガイドカニューレのプラスチック製台座と、ガイドカニューレを固定するための2本のネジを覆うようにペーストを塗布します。皮膚感染を防ぐため、皮膚切開部全体を覆ってください。翌日、ダミーカニューレを引き抜き、ガイドカニューレに内部カニューレを挿入します。固定ネジを締め、内部カニューレを固定します。マイクロインジェクションポンプと内部カニューレを繋ぐポリエチレンチューブをセットし、注入速度を1 µL/minに調整します。A-beta 25-35をLVにマイクロインジェクションします。注入終了後5分間待ち、ゆっくりと内部カニューレを抜去します。次に、ダミーカニューレをガイドカニューレに再び挿入します。術後15日目に、外科用ハサミとピンセットで義歯ベース材料の固形物を除去し、ヨードホルで傷口を消毒して、カニューレ植え込みシステムを取り除きます。最後に、頭蓋骨の穴を骨セメントで埋め、単純結節縫合により皮膚を縫合します。まず、少量の黒色食用色素を加え、プールの水を黒く染めます。水深を31.5 centimetersに、水温を23 ± 1 °Cに維持してください。次に、水面下に直径1.5 centimeterの円形透明プレキシガラス製プラットフォームを設置します。次に、記述的なデータ収集を行うため、プールを仮想線を用いて4つの等しい象限に分割します。隠れたプラットフォームを、ウォーター迷路の第1象限（Q1）に設置します。最後に、コンピューターベースのグラフィックス解析ソフトウェアに接続されたウォーター迷路上のビデオカメラを用いて、ラットの遊泳行動を撮影します。これらの結果は、モーリス水迷路において、偽手術群のラットは常に自由に泳ぎ回ったのに対し、複合A-beta投与群のラットは適応的遊泳により常にプールの外周を泳ぎ回ったことを示している。記憶障害モデルラットを選別した4日間にわたり、すべてのラットにおいて隠されたプラットフォームに到達するまでの時間は漸次的に短縮した。さらに、隠されたプラットフォームに到達するまでの潜時において、複合A-beta投与群は偽手術群よりも有意に長く、複合A-betaがラットの記憶再学習障害を亢進させ得ることが実証された。1日後の記憶保持試験において、複合A-beta投与群は、偽手術群と比較して、60秒間における泳泳時間、泳泳距離、および通過回数が少なくなっていました。最後に、病理学的変化に加えて、複合A-beta投与群では偽手術群と比較して、海馬および大脳皮質におけるニューロン数も有意に減少していました。この手法に習熟すれば、適切に実施することで20～30分で完了できます。この手順を行う際は、ガイド付きカニューレが脳固定ネジから脱落しないように注意することが重要です。本手順の後、模倣したADモデルが成功したかなど、追加の疑問を解消するために迷路テストなどの他の手法を実施することが可能です。この技術の開発により、神経科学分野の研究者が生体内で神経変性疾患を探索するための道が開かれました。このビデオを視聴することで、ラットにおいて、A-beta 25-35、塩化アルミニウム、およびリコンビナントヒト変換成長因子ベータ1を併用した脳室内投与により、AD模倣動物モデルを正常に構築する方法について十分に理解できるはずです。ポリメタクリル酸メチルを扱う際は極めて危険を伴う可能性があるため、この手順を行う際は、常にマスクや手袋の着用などの予防策を講じることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Behavior

行動

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マウス海馬にオリゴマーアミロイドベータの定位注入

新規モデルにおける共病的なアルツハイマー病（AD）とストロークの状態を調べるために、3つの動作タスクは、モータ制御および認知行動の両方を評価することに記載されています。これらのタスクは、ビーム歩行タスク、シリンダータスクとモリス水迷路を含みます。...

モーターと脳卒中とアルツハイマー病のトランスジェニックラットモデルにおける海馬依存性の空間学習とリファレンスメモリ評価

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急性アルツハイマーなどの認知障害を誘発するために正常マウスにおけるアミロイドβペプチドの脳室内注射

慢性アミロイドβオリゴマー輸液の動物モデルにおける神経変性は、浸透圧ポンプを用いて抗体治療フューズによって打ち消されます

私たちは、アルツハイマー病のげっ歯類モデルにおいて単核食細胞によって脳アミロイドβ（Aβ）食作用のインシリコモデリング （q3DISM） で定量的な3Dのための方法論を開発しました。この方法は、 インビボで実質的に任意の食イベントの定量のために一般化することができます。...

定量的3Dインシリコモデリング（q3DISM）

このプロトコルは、合成と性質、組織学的解析および検出に続いてアルツハイマー病モデルを確立する大人のゼブラフィッシュでアミロイド毒性を生成する単量体のアミロイド β42...

Β42 アミロイド毒性と大人のゼブラフィッシュ脳の神経変性をモデリング

このプロトコルは、細胞を固定化するアルギネートの急速な物理的ゲル化による細胞封入方法を示す。得られたマイクロビーズは、時間をかけてアミロイドβの制御および持続的な分泌を可能にし、インビトロおよびインビボモデルで分泌されたアミロイドβの効果を研究するために使用することができる。...

アルツハイマー病のモデリングに用いられるアミロイドβ分泌アルギン酸マイクロビーズの製造

学ぶアルツハイマー病のラット動物モデル構築法。Aβ25-35と塩化アルミニウム、TGF-β1を脳室内投与し、Morris水迷路で空間記憶障害と神経病理変化を評価します。薬物スクリーニングに有用です。

合成アミロイド β 蛋白の脳室内投与によるラットの動物モデルにおけるアルツハイマー病の貴重な模倣の確立

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