Name: 非侵襲体内生物発光システムによってマウスのホストである腸管出血性大腸菌の植民地化の検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: 学ぶ 非侵襲的バイオルミネセンスイメージングを用いてマウスにおける腸管出血性大腸菌（EHEC）の植民地化を検出する方法です。生きた動物でリアルタイムに細菌の定着を可視化し、病原性メカニズムの解明に貢献します。

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我々 は、マウスに助けを感染と国立成功大学の研究所動物センターからの支援へのチー ・ チャン陳 Chi Mei 医療センター (台湾・台南) 医学研究科を認めます。この作品は科学の大臣によってサポートされ技術 (ほとんど) が CC に (最も 104-2321-B-006-019、105-2321-B-006-011、and106-2321-B-006-005) を付与します。

注意: EHEC o157: h7 はバイオ セーフティ レベル 2 (BSL-2) センター疾病管理・予防 (CDC) のバイオ セーフティの命令 (https://www.cdc.gov/) によると病原体。したがって、EHEC を含むすべての実験手順は、BSL 2 施設で実行する必要があります。実験の実行中の白衣、手袋を着用してください。公認バイオ キャビネット (BSC) で動作します。70% のエタノールの実験の手順の前後には、実験ベンチを消毒します。すべての楽器や機器の接触 (または可能性のある連絡先) EHEC が 70% エタノールや漂白剤で消毒すること。汚染された (または汚染された可能性のある) 廃棄物は密封され、オートクレーブを慎重にする必要があります。必要に応じてマスク、目の保護、手袋や、スーツを着用します。6 週齢の c57bl/6 女性マウスが購入し、研究所動物センターの国立チェン イェーテボリ大学) で維持します。動物実験は動物介護機関と使用 NCKU 委員会 (承認番号 104-039) によって承認されました。
1. Bioluciferase ラベル EHEC 菌生成
<ol><li>ミックス 50 ng デオキシリボ核酸 (DNA)、1 μ L 各 10 μ M の前方ゾーンおよび逆引きプライマー、2 μ L 2.5 mM 弱まり (dNTPs)、2 μ L バッファー、0.2 μ L の DNA ポリメラーゼ、および増幅する 20 μ L の最終巻に滅菌ダブル蒸留水 (ddH2O) × 10、反カナマイシン カセット、 nptII遺伝子24。DNA のテンプレートは、pBSL18024, 国立ナショナルバイオ リソース プロジェクト (NBRP) から購入されるからです。PCR の状態は、表 1に示すが、プライマー シーケンステーブル 2で利用可能です。</li>
	<li>キットに続く商業クローニング ベクトルに PCR の製品を縛るプロトコル (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>NsiIおよびSmaIでクローニング ベクトルからnptII遺伝子のフラグメントを消費税し、pBBR1MCS4 は、カナマイシン耐性プラスミドを作成する pAKlux29 NsiIとScaIで消化されてのクローンを作成pWF27813。</li>
	<li>プラスミド9、 SpeI-HFとScaIとクローンでの pAKlux2 を表現するルシフェラーゼluxCDABEオペロンを消費税SpeI HFおよびSmaIにカナマイシンを生成する pWF278 を消化耐性とルシフェラーゼ発現プラスミド pWF27913。 注: プラスミド抽出と摘出フラグメント精製、使用商業プラスミド抽出とゲル抽出キットそれぞれ。酵素の消化力の 100 ng の DNA、1 μ L の 10 x バッファー、各選択した制限酵素および滅菌 ddH2O 10 μ L の総ボリュームの 1 μ L を混合し、2.5-3 h の 37 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>4 ms の 2,500 V の電気穿孔法による pWF279 プラスミドを大腸菌o157: h7 EDL933 有能なセルに変換します。</li>
	<li>1 h の 37 ° C で 1 mL ルリア ベルターニカミラ (LB) 培地で変換された細菌の細胞を孵化させなさい。</li>
	<li>16-18 時間 37 ° c カナマイシンの 50 μ g/mL を添加した LB 寒天培地プレート上の細菌をプレートします。</li>
	<li>は、生体内イメージング マシン次の日プレートの発光信号を確認してください。プレートから単一コロニーをピックアップし、3 mL 16 18 h の 37 ° C で 50 μ g/mL カナマイシンを添加した LB の文化します。</li>
	<li>希釈することによって細菌のストック メディアの準備滅菌 ddH2O 30% グリセロールの解決をするために 100% グリセリン。</li>
	<li>凍結カナマイシン耐性-80 ° C で細菌文化と 30% グリセロールの解決の 1:1 の比率としてスクリュー キャップ クリオバイアルで細菌の在庫としてルシフェラーゼ プラスミドをかくまっているエシェリヒア属大腸菌o157: h7 EDL933 細菌グリセロールの最終濃度は 15% です。</li>
</ol>2. 発光 EHEC 菌経口接種に備えて
注: EHEC の作製とマウス経口実験プロシージャのタイムラインのフローチャートは図 1実験準備を支援するために提示されます。
<ol><li>ストリークエシェリヒア属大腸菌o157: h7 EDL933 細菌-80 ° C 株式からの 50 μ g/mL カナマイシンと LB 寒天培地プレート上にルシフェラーゼ プラスミドをかくまっています。37 ° C で 16-18 h のバクテリアします。</li>
	<li>一晩プレートと 220 rpm で 37 ° C のインキュベーターで 16-18 h の 50 μ g/mL カナマイシンを 3 mL の LB 培地での培養から単一コロニーを拾います。</li>
	<li>サブカルチャー流体培養基 LB の 200 rpm で 37 ° C の定温器で 2.5-3 時間を含んでいる (1: 100 希釈) カナマイシン (50 μ g/mL) に細菌。(追加 2 mL 一晩培養カナマイシン (50 μ g/mL) に 200 mL の LB 培菌など)。</li>
	<li>2.5-3 h の細菌をインキュベートし、600 光学密度値を測定値まで nm (外径600) は、0.9 に 1 間。細菌の細胞数は約 108コロニー形成単位 (CFU) の密度で/mL。</li>
	<li>遠心分離機の 4 ° C、30 分間 8,000 x g で再培養細菌</li>
	<li>細菌のペレットを撹拌せず上澄みを廃棄し、穏やかな攪拌で 100 mL 0.9% 滅菌生理食塩水入りの餌を洗浄します。</li>
	<li>2.5 および 2.6 の手順をもう一度繰り返します。</li>
	<li>その後、4 ° C、30 分間 8,000 の x g で細菌培養を遠心し、そっと上澄みを廃棄します。</li>
	<li>コンデンセート ペレットに 100 0.9% 滅菌生理食塩水入りに。例えば、200 mL の細菌は、遠心分離された場合、は、食塩水 2 mL 通常ペレットを中断するを追加します。</li>
	<li>10 倍連続希釈25まで集中して細菌をメッキすることによって (にすべき約 109 CFU/100 μ 凝縮後食塩) する CFU の菌を確認します。</li>
</ol>3. マウス経口 EHEC の
<ol><li>24 h のためのストレプトマイシン水 (5 g/L) と 6 週齢女性 c57bl/6 マウスを扱います。</li>
	<li>24 h 後強制経口投与の前にさらに 24 時間の定期的な飲料水に切り替えます。24 時間定期的に水で治療、マウス経口 EHEC のため準備が整います。</li>
	<li>100 μ L EHEC 菌で注射器を入力するには、プランジャーを手前に引きます。シリンジ内に気泡がないことを確認します。注射器の指をスナップすることによって泡を削除します。</li>
	<li>動物を慎重に持ち上げ、ケアとケージの上に置きます。</li>
	<li>慎重に、尾をマウスをつかみ、動物がケージの上部のグリップし離れて移動ましょう。</li>
	<li>そっと親指と人差し指の移動からマウスの頭を防ぐために動物の前後首のたるんだ皮膚をつかんでマウスを抑制します。</li>
	<li>強制経口投与の針を挿入し、マウスの頭は固定化と垂直に垂直にマウスを保持します。</li>
	<li>口の屋根に続くマウスの口に強制経口投与の針を挿入し、食道、胃へ移動します。</li>
	<li>挿入した針が半分またはマウスの 3 分の 2 の長さの約 10 の9 CFU セルを含む 100 μ L EHEC 菌を注入します。</li>
</ol>4. 可視化
<ol><li>経口投与後 1 ~ 2 日で発光信号を検出します。</li>
	<li>動物の発光信号を調べる前に 1.5 L/分の酸素と 2.5% イソフルランの商工会議所にそれらを置くことによってそれらを麻酔します。</li>
	<li>すべてのマウスになる無意識との移動を停止するまで、2-5 分を待ちます。動物は、体内の発光検出のため準備ができています。</li>
	<li>検出し、は、生体内イメージング システム動物の発光信号をイメージします。ソフトウェアの操作のセクション 5「データ取得」を参照してください。イメージング プロセス中にすべての動物が 1.5 L/分の酸素と 2.5% イソフルランの継続的な供給の下で。<ol>
<li>ファイルをクリックして > ライブ、および手動でマウスに焦点を当てます。</li>
		<li>露出時間とレーザーの強度を選択します。</li>
		<li>集録をクリック > をキャプチャします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ex vivoイメージング、頚部転位によってマウスを安楽死させるし、感染マウスの小腸全体を削除します。生体内イメージング システム 9 cm シャーレとイメージで腸を配置します。設定は、生体内イメージング以外 A/B としてビューのフィールドを設定と同じ詳細については、セクション 5「データ取得」を参照してください。 注: 頚部転位方法: 動物がケージをグリップできるように片方の手で尻尾をつかんでケージの上にマウスを抑制します。頭蓋底にマーカー ペンまたは親指と首の背部に対してもう一方の手の最初の指を置きます。すぐに頭を抑制しながら手や物体を進めて、尾を持っている手と後方を引き出します。 呼吸の阻止とハートビートがない確認を念入りにチェックします。</li>
</ol>5. データ集録
注: データ集録に使用するソフトウェアは、材料表に表示されます。
<ol><li>画像を取得する (図 2) ソフトウェアの取得コントロール パネルを開きます。</li>
	<li>選択「発光」「写真」と「オーバーレイ」。</li>
	<li>「自動」と露出時間をを設定します。「中」としてビニング設定します。</li>
	<li>発光と 8 の 1 として ƒ/ストップの設定は写真のため。CCD 検出器によって光量受けた ƒ/停止を制御します。</li>
	<li>画像取得に関心のあるフィールドに基づいてビューのフィールドを設定します。オプション"D"は、5 6 週齢マウスに合うし、すべて一度にそれらをイメージできます。"C"は、1 つのフィールドに 3 つの 6 週齢のマウスを映すことができます。</li>
	<li>マウス/サンプルは画像の準備ができましたら、画像の獲得のため「取得」をクリックします。</li>
	<li>取得したイメージ データを開きます。</li>
	<li>ツール パレット パネル (図 3) を開きます。</li>
	<li>ROI ツールを選択します。画像 (図 4) の発光領域の範囲に円 (最も左のもの) をお勧めします。</li>
	<li>(図 3) 表面の発光強度を測定する「測定ロア」(鉛筆のアイコン) をクリックします。ROI 測定パネルと定量値 (図 5) が表示されます。</li>
	<li>ROI 測定パネルの左上隅の値/必要な情報 (図 6) を選択し、それ以外の場合このデータ テーブルをエクスポートして .csv ファイル (図 5) として保存する「エクスポート」をクリックして計測器の構成を使用します。</li>
	<li>.Csv ファイルの発光強度の定量化として「全光束 (p/s)"列の値を使用します。</li>
</ol>

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それは、ホストまたは8,・11,・12生体内で遺伝子発現の局在を調べる EHEC ルシフェラーゼ プラスミドで形質転換が利用されていることが報告されています。ここに示すマウスモデルは、EHEC の植民地化のタイミングとローカリゼーションのマウス ホスト8検出に報告されています。それにもかかわらず、EHEC 接種マウスの量管理方法と経口用発光細菌を慎重に準備する方法の詳細プロトコルを提供します。特に、EHEC (ステップ 3.7) のマウス経口は強制経口投与針が挿入されるとき、マウスの頭の位置が重要に。位置が垂直、針を通過することは困難であろうし、マウスを傷つけることができる可能性が高い。3.8 の手順で強制経口投与の針はマウスの口の中、舌が横たわった口の外少し食道に強制経口投与針を渡す際に抵抗が発生した場合針を前進を停止し、すぐにそれを撤回します。針が食道に入っていることを確認してくださ...

EHEC o157: h7 は、汚染された水や食品を介しても急性腎障害4フス3HS2下痢1を引き起こす病原体です。出血性大腸菌病原性 enterobacterium で、人間1の消化管に定着します。EHEC は最初ホストの腸の粘膜上皮に付着するとき、彼らは、アタッチを誘導してその後を強制する (A ・ E) 病変を卑下分子注射器として機能するタイプ III 分泌システム (T3SS) を介して宿主細胞に植民地化の要因を注入します。接着 (植民地化) の5。A/E 病変形成に関与する遺伝子、上皮細胞卑下 (イ) 病原性島5の軌跡によってエンコードされます。
生物発光は光生成の化学反応、どちらのルシフェラーゼの可視光6を生成するその基質ルシフェリンを触媒します。この酵素プロセスよく酸素またはアデノシン三リン酸 (ATP)6の存在が必要です。生物発光イメージング (結合)、生きている動物7で、研究者の可視化およびホスト病原体の相互作用の量子化ことができます。バリは、発光細菌を次に移行し、さまざまな組織7に侵入すると、生きている動物の細菌感染症のサイクルを特徴付けることができます。これは、感染症の動的な進行を明らかにします。さらに、動物の細菌の負荷は、発光信号8; に関連します。したがって、それは単純で直接的な方法で実験動物の病理学の条件を推定するための便利なインジケーターです。
ここで使用されるプラスミドには、ルシフェラーゼ オペロン、 luxCDABE、菌Photorhabdus luminescens独自のルシフェラーゼ基板7,9をエンコードするからであるが含まれています。細菌にこのルシフェラーゼ発現プラスミドを変換することによって植民地化および伝染のプロセスは生きている動物のこれらの発光細菌を観察することによって監視できます。全体的にみて、バリとバクテリアの生物発光ラベルは、細菌数と場所、細菌性抗生物質/療法の治療と感染症/植民地6,における細菌の遺伝子発現を監視する研究者を許可します。7. 感染症の感染サイクルや遺伝子発現を調べるluxCDABEオペロンを発現する多くの病原性細菌が報告されています。尿路大腸菌10EHEC8,11,12,13, 急性胃腸炎起因を含むこれらの細菌エシェリヒア属大腸菌(EPEC)8,シトロバクター属囓14,15, サルモネラ16リステリア菌17、 Yersinia enterocolitica18,19、とコレラ20、文書化されています。
いくつかの実験的モデルは、EHEC の植民地化の in vitroとin vivo21,22,23の研究を容易にするために開発されています。しかし、EHEC の植民地化は、生体内で、研究に適した動物モデルの欠乏そしてこうして詳細の結果不足があります。EHEC 植民地化メカニズムは、生体内での研究を容易にする、動物を観察し、非侵襲的な方法で生きている動物の EHEC の植民地化を定量化するモデルを構築する貴重なです。
本稿では、生物発光表現するシステムを使用して生きている宿主に時間をかけて EHEC の植民地化を監視するマウス EHEC 植民地化モデルについて説明します。マウスは接種量発光ラベル EHEC とマウスで、非侵襲的生体内でイメージ投射システム13と発光信号が検出されました。2 日後に感染症、それらの細菌は、2 日後に感染後ホストの腸の植民地を提案した後彼らの腸に発光信号を示した発光ラベル EHEC 感染マウス。前のヴィヴォの画像データを示した盲腸と結腸マウスの具体的にこの植民地化であります。このマウス EHEC のモデルを使用して、発光 EHEC の植民地化がは、生体内イメージング システムのさらなる理解を促進する可能性が腸内細菌の植民地化の詳細なメカニズムの研究生活ホストで検出できます。EHEC による生理学的および病理学的変化。

<table><tbody><tr><td>シェーカーインキュベーター</td><td>YIH DER</td><td>LM-570R</td><td>バクテリアインキュベーション&nbsp;</td></tr><tr><td>オービタル振盪インキュベーター</td><td>FIRSTEK</td><td>S300</td><td>bacteria incubation&nbsp;</td></tr><tr><td>pBSL180</td><td></td><td></td><td>nptII遺伝子</td></tr><tr><td>pAKlux2</td><td></td><td></td><td>luxCDABEオペロン</td></tr><tr><td>T&の源クローニングキット</td><td>Yeastern Biotech</td><td>FYC001-20P</td><td>TAクローニング用&nbsp;</td></tr><tr><td>Nsi I</td><td>NEB</td><td>R0127S</td><td>プラスミドクローニング用&nbsp;</td></tr><tr><td>Sca I</td><td>NEB</td><td>R0122S</td><td>プラスミドクローニング用&nbsp;</td></tr><tr><td>Spe I-HF</td><td>NEB</td><td>R0133S</td><td>プラスミドクローニング用&NBSP;</td></tr><tr><td>Sma I&nbsp;</td><td>NEB</td><td>R0141S</td><td>プラスミドクローニング用&nbsp;</td></tr><tr><td>T4 リガーゼ</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td>プラスミドクローニング用&nbsp;</td></tr><tr><td>Ex</td><td>Taq TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>PCR増幅用</td></tr><tr><td>10X Ex Taq Buffer</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>PCR Amplification</td></tr><tr><td>dNTP混合物&nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>PCR増幅</td></tr><tr><td>PCR装置</td><td>への使用 バイオシステムに適用&nbsp;</td><td>2720サーマルサイクラー&nbsp;</td><td>&nbsp;PCR増幅</td></tr><tr><td>用 グリセロール</td><td>SIGMA</td><td>G5516-1L</td><td>バクテリアストック液用</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434-5KG-R</td><td>LB培地を作るための薬品、10 g/L</td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>CONDA pronadisa</td><td>Cat 1612.00</td><td>LB培地を作るための薬品、10 g/L</td></tr><tr><td>酵母エキス粉末</td><td>Affymetrix</td><td>23547-1 KG</td><td>LB培地を作るための薬品、5 g/L</td></tr><tr><td>寒天</td><td>CONDA pronadisa</td><td>Cat 1802.00</td><td>LB寒天</td></tr><tr><td>kanamycinを作るための化学物質&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>K4000-5G</td><td>抗生物質、セレシトン</td></tr><tr><td>ストレプトマイシンに使用&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>S6501-100G</td><td>抗生物質、マウスの微生物叢を排除</td></tr><tr><td>EDL933コンピテントセル</td><td></td><td></td>自家製<td>の方法は補足文書にあります&nbsp;</td></tr><tr><td>エレクトロポレーション</td><td>用</td>エレクトロポレーター マイクロ<td>パルサー</td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーションキュベット</td><td>ジーンパルサー/マイクロパルサー</td><td>1652086</td><td>エレクトロポレーション用</td></tr><tr><td>高速遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>アバンティ、J-26S XP</td><td>遠心分離用バクテリア&nbsp;</td></tr><tr><td>固定角ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>JA25.5</td><td>遠心分離用バクテリア&nbsp;</td></tr><tr><td>固定角ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>JLA10.5</td><td>遠心分離用バクテリア&nbsp;</td></tr><tr><td>ベックマン・コールター</td>の<td>遠心分離ボトル</td><td>REF357003</td><td>細菌の遠心分離に使用&nbsp;</td></tr><tr><td>遠心分離機ボトル</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>3141-0500</td><td>遠心分離細菌用&nbsp;</td></tr><tr><td>エッペンドルフバイオフォトメーター plus&nbsp;</td><td>eppendorf</td><td>AG 22331 ハンブルク</td> バクテリアC57BL/6マウス<td>のOD600値を測定するため</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>NCKU</td><td></td><td></td>実験動物センター</tr>白<tr><td>衣・</td><td>人員保護用</td>手袋<td></td><td></td>&nbsp;</tr><tr><td>イソフルラン&nbsp;</td><td>パニオン&BFバイオテック株式会社</td><td>G-8669</td><td>マウス麻酔用、医薬品グレード</td></tr><tr><td>1mlシリンジ&nbsp;</td><td></td><td></td><td>マウスの経口強制経口に使用</td></tr><tr><td>再利用可能な22 Gボールチップ給餌針</td><td></td><td>&phi;0.9 mm X L 50 mm</td> マウスの<td>経口強制経口</td></tr>使用 <tr><td>外科用&nbsp; はさみ&nbsp;</td><td></td><td></td><td>マウス実験に使用</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS 200イメージングシステム</td><td>Perkin Elmer</td><td>IVISスペクトル</td><td>に生物発光画像キャプチャに使用&nbsp;</td></tr><tr>画像<td>データの定量化に利用</td>する<td>リビングイメージソフト</td><td>Perkin Elmer</td><td>バージョン4.1</td></tr></tbody></table>

非侵襲体内生物発光システムによってマウスのホストである腸管出血性大腸菌の植民地化の検出

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

腸管出血性大腸菌(EHEC) o157: h7、これが食中毒病原体、causesdiarrhea、出血性大腸炎 (HS) と溶血性尿毒症症候群 (HUS) は、人間の腸管に植民地化します。EHEC の植民地化、体内の詳細な機構の研究を監視して定量化 EHEC 植民地動物モデルを持つことが不可欠です。ここを監視して生きている宿主の EHEC の植民地化を定量化 EHEC に発光発現プラスミドを変換することによってマウス EHEC 植民地化モデルを紹介します。発光ラベル EHEC を接種した動物と非侵襲的体内イメージング システム検出によるマウスでの強烈な発光信号を示します。1 と 2 日間は、感染症を投稿後発光信号まだ検出感染した動物、EHEC が、少なくとも 2 日間のホストで植民地化を示唆しています。また、これらの発光 EHEC がex vivo画像から具体的に、盲腸および結腸、小腸に検索を示します。このマウス EHEC 植民地化モデルは、EHEC 植民地化メカニズムの現在のナレッジを進めるためのツールとして役立つかもしれない。

生物発光ラベル EHEC を投与 (~ 109細菌細胞) 経口投与による 6 週間の古い女性 c57bl/6 マウスに。1 時間以内のマウスに EHEC の経口接種後動物は図 7に示すように、生体内イメージング システムによる発光信号について検討した.結果は、発光ラベル EHEC と強制経口投与マウスにおける強力な発光信号を示した。2 日間ポスト感染上の信号を調べた。図 8 aに示すとおり、マウス接種 2 日後に感染症は、EHEC を 2 日間でホストで植民地化を示唆した後も強烈な発光信号を示した発光ラベル野生型 EHEC EDL933。我々 は量も発光標識マウス (図 8 a) にΔrfaD (ΔrfaD) EDL933 を感染しています。この変異はリポ多糖 (LPS) に亡命した先行研究においてホストの植民地化を減らすために示されてい...

腸管出血性発光標識細菌によるエシェリヒア属大腸菌(EHEC) の植民地化のためのマウスモデルの詳細なプロトコルが表示されます。非侵襲的生体内でイメージ投射生きている動物のシステムによってこれらの発光細菌の検出は、EHEC の植民地化の私達の現在の理解を進めることができます。

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

本実験の全体的な目的は、非侵襲的な生体内イメージングシステムを用いて、マウスにおける腸管出血性大腸菌（enterohemorrhagic E.coli）の定着を検出することです。この手法は、定着などの腸管出血性大腸菌の病原性研究における重要な疑問の解決に役立ちます。この技術の主な利点は、動物を犠牲にすることなく、生存している動物内でEHECの定着を検出できることです。まず、ルシフェラーゼプラスミドを保持する E.coli O157:H7 EDL933 菌の-80 °C保存ストックを、50 µg/mLのカナマイシンを含むLB寒天プレートにストリークします。このプレートを37 °Cで16～18時間培養します。翌日のプレートから単一のコロニーをピックアップし、50 µg/mLのカナマイシンを含むLB培地3 mLに接種します。次に、培養液を37 °C、220 rpmで16〜18時間インキュベートします。翌日、前夜の培養液を1:100に希釈した液を2 mL調製し、カナマイシンを含むLB培地200 mLに接種します。培養液を37 °C、200 rpmで2.5〜3時間、または600 nmにおける光学密度（OD₆₀₀）が0.9〜1に達するまでインキュベートします。次に、再培養した細菌を8000 ×g、4 °Cで30分間遠心分離します。ペレットを乱さないように上清を除去し、緩やかに撹拌しながら100 mLの0.9%滅菌生理食塩水で細菌を洗浄します。洗浄後、細菌培養液を再度遠心分離し、静かに上清を除去します。次に、0.9%滅菌生理食塩水を用いてペレットを100倍に濃縮します。テキストのプロトコルに従ってマウスにストレプトマイシン水を24時間投与した後、シリンジに100 µLのEHEC細菌を満たします。動物をそっと持ち上げ、慎重にケージの上部に置きます。次に、マウスの尾を慎重に掴み、動物がケージの上部にしがみついて逃げようとする状態にします。親指と人差し指で、マウスの首と背中の緩んだ皮膚を掴んで、頭が動かないように優しく保定します。その後、マウスを垂直に保持し、この状態で頭部が固定されていることを確認します。動物の口にゾンデ針を挿入し、口蓋に沿って食道を通り胃に向かって進めます。針がマウスの体内に半分から3分の2ほど挿入された時点で、約10⁹ CFUの細胞を含む100 µLのEHEC菌を注入します。テキストのプロトコルに従って生物発光細胞を可視化した後、ソフトウェアのAcquisition Control Panelを開きます。ルミネッセンス、写真、およびオーバーレイを選択します。露出時間をオートに設定します。次に、ビニングをミディアムに設定します。ルミネッセンス測定ではF値を1に、写真撮影では8に設定します。F値はCCD検出器が受光する光量を制御します。マウスサンプルがイメージングの準備に整ったら、「acquire」をクリックして画像を取得します。取得した画像データを開き、ツールパレットパネルを表示します。円などのROIツールを選択し、画像上の生物発光領域を指定します。次に、鉛筆アイコンを使用して「measure ROI's」をクリックし、表面の生物発光強度を測定します。ROI測定パネルと定量値が表示されます。次に、ROI測定パネルの左隅にある「configure measurement」を使用して、必要な値や情報を選択します。または、「Export」をクリックしてこのデータテーブルをエクスポートし、csvファイルとして保存します。最後に、csvファイルのtotal flux p/s列の値を生物発光強度の定量値として使用します。この画像で示されているように、生物発光ラベルを付加したEHECを経口投与したマウスにおいて、強い生物発光シグナルが観察されました。この図では、生物発光ラベル付きの野生型EHEC EDL933を接種したマウスにおいて、感染後2日目でも強い生物発光シグナルが示されており、EHECが2日以内に宿主に定着したことが示唆されています。しかしながら、リポポリサッカライドに欠損がある変異型E.coliを感染させたマウスでは生物発光が認められず、これらのマウスへの細菌の定着数が少ないか、あるいは全く定着しなかったことが示唆された。生物発光で標識された細菌の局在を特定するため、安楽死させた動物の腸管をex vivoでイメージングした。生物発光標識EHECを感染させたマウスの臓器では、盲腸と結腸に有意な生物発光信号が認められ、これらの臓器に細菌が定着していることが示された。対照的に、LPS変異株に感染させたマウスでは、腸管組織における生物発光の減少が認められ、これはin vivoイメージングの結果と一致しています。このビデオを視聴することで、IVシステムを用いてマウスにおけるEHECの定着をモニタリングする実験方法について、十分に理解することができたはずです。

detection-enterohemorrhagic-escherichia-coli-colonization-murine-host

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

生きている動物における細菌感染症の生物発光イメージングのための方法が説明されています。病原体は、生きた動物における感染症の光学全身イメージングを可能にルシフェラーゼを発現するように変更されます。動物モデルは、ルシフェラーゼを発現する病原体に感染し、病気の結果として得られるコースは、生物発光イメージングによってリアルタイムに可視化することができます。...

マウスでイメージ細菌感染にルシフェラーゼを用いた

この記事はの管理について説明し...

生物発光細菌のイメージング<emインビボで&gt;</em

出典:バレンタイン、ME、他。Pseudomonas aeruginosaにおけるインフレーム遺伝子欠失変異株の作製と感染の単純なマウスモデルにおける病原性減衰の試験J. Vis. 経験。(2020年)このビデオでは、生物発光を使用して、マウスにおける毒性細菌株と弱毒菌株のin...

生物発光を用いたマウスにおける細菌感染動態の追跡

出典:Kuo、C.、et al。非侵襲的in vivo生物ルミネセンスシステムによるマウス宿主における腸出血性大腸菌コロニー形成の検出J. Vis. 経験。(2018年)このビデオは、動物モデルの経口接種物として使用するために、冷凍ストックからルシフェラーゼを発現する腸出血性 大腸菌 懸濁液を調製する方法を示しています。これにより、in...

生物発光性腸出血性大 腸菌 接種物の調製

出典:de Vries, C. R.ら、慢性緑膿菌創傷感染の遅延接種モデル。J. Vis. Exp.(2020年)。このビデオでは、生きたマウスモデルにおける細菌感染の進行を監視するための生物発光イメージング技術を実演しています。 luxABCDE...

マウスの細菌感染の生物発光イメージング

出典:セマン、B. G.ら グラム陰性細菌敗血症の新生児画像モデル。J. Vis.

新生マウスの感染を被覆した発光細菌を用いたモデル化

出典: Valentine, M. E.ら、『 緑膿菌 におけるインフレーム遺伝子欠失変異体の生成および感染の単純なマウスモデルにおける病原性減損の検証』。 J. Vis.

生物発光を用いたマウスモデルにおける細菌感染のリアルタイムイメージング

出典: Luyts, N. ほか。 マウスにおける尿路感染症の縦断的追跡調査およびマウスにおける治療法。 J. Vis. Exp.(2021年)。このビデオは、膀胱に注入した発光 性大腸菌...

生物発光を用いたマウスモデルにおける尿路感染症の可視化

マルチモダリティイメージングは​​、小さな動物モデルで細菌のコロニー形成を研究するための貴重なアプローチである。このプロトコルは、生物発光とマウスの感染症を概説...

の4Dのマルチモダリティイメージング<em&gt;シトロバクターrodentium</emマウスにおける&gt;感染症

本稿では、生体発光イメージングを用いた細菌負荷の解析とその後の縦方向インビボ解析を行うルクスオペロンを用いた泌尿器内細菌の脳内投与について説明する。...

生物発光イメージングを用いたマウスにおける尿路感染症の縦方向のフォローアップとその治療

マウスにおける上行性膣感染症、早産、および新生児罹患率のモデル化

学ぶ 非侵襲的バイオルミネセンスイメージングを用いてマウスにおける腸管出血性大腸菌（EHEC）の植民地化を検出する方法です。生きた動物でリアルタイムに細菌の定着を可視化し、病原性メカニズムの解明に貢献します。

非侵襲体内生物発光システムによってマウスのホストである腸管出血性大腸菌の植民地化の検出

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