Name: マウス着床前胚幹細胞の誘導 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: 学ぶマウス胚性幹細胞の誘導法。標準培養条件とフィーダー細胞を用いて、ブラストシスト段階のマウス胚から多能性幹細胞株を効率的に樹立する手法を解説。再生医療研究に応用可能です。

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ジョナタン ルーカスは、フィーダー細胞培養、動物のケアのための Servei Estabulari デ ラ UAB とビデオを記録するための Domènec ・ マルティンと技術的な援助を感謝いたします。この作品は Ministerio デ エコノミア y Competitividad AGL2014-52408-R、ジャナラリター ・ デ ・支えられているカタルーニャ 2014 SGR 524。MVC は、PIF UAB フェローシップの受益者です。

動物と Autònoma · デ · バルセロナの人間研究に関する倫理委員会、部門 d の以下のセクションに記載されている動物の使用を承認されている &#39; Ramaderia、育種釣り私ジャナラリター ・ デ ・ カタルーニャ (プロトコル #8741) の Alimentació。
 1 フィーダー細胞の不活性化とストレージ 注: ひと包皮線維芽細胞 (HFF-1) 以前 90% 胎仔ウシ血清 (FBS) と 10% ジメチル ジメチルスルホキシド (成る凍結溶液 1 mL でフリーズした。DMSO)、使用するまで液体窒素に保存されます。
<ol><li>37 ° C の水浴のバイアルを浸すことによって HFF 1 (1 mL) のセラムを解凍</li>。
	<li>極低温バイアルの解凍の内容を予め温めておいたダルベッコに追加 &#39; 更新イーグル s &#39; s 媒体 (DMEM) 10% を 1:10 に FBS 希釈</li>。
	<li>T75 フラスコで希薄化後のセル (10 mL) をシードし、37 ° C、5% CO 2 でそれらを文化します</li>。
	<li>次の日は、DMSO の残党を排除するために媒体を変更します。メディアを削除し、10% に予め温めておいた DMEM の 10 mL を追加 FBS</li>。
	<li>、タイトピロー包装文化し、文化融合の段階に達するまで、媒体ごとの 48 h を変更します。これは約 7 〜 10 日かかる場合があります</li>。
	不活化ソリューションを準備、10% を DMEM にマイトマイシン C を希釈する <li>10 μ G/ml の最終的な集中に FBS。37 ° C、5% CO 2 で 3 h の不活化ソリューションと細胞をインキュベートします</li>。
	<li>不活性化ソリューションを削除、三度と 2 mL のハンクス平衡塩ソリューション (HBSS) マイトマイシン C の残骸を除去するために細胞をすすいでください</li>。
	<li>不活化セルを解除するには、予め温めておいたトリプシン EDTA 溶液の 1 mL を追加し、37 ° C、5% CO 2 で 5 分間インキュベートします</li>。
	<li>が切断されていることを確認する倒立顕微鏡下で細胞を観察 (0.3 の開口または NA 10 × 対物)。そうでない場合は、37 ° C、5% CO 2 で、数分間インキュベートします。再び倒立顕微鏡下で細胞を確認してください</li>。
	<li>細胞塊を分離するためにソリューションをパスツール ピペット ピペットします</li>。
	<li>10 %fbs と再懸濁します DMEM の 4 つの mL を追加することによって酵素のソリューションを中和します</li>。
	<li>細胞懸濁液の因数と HBSS で 1: 100 希釈を行います。セルの数を決定する、ノイバウアーに希釈の 10 μ L を読み込む &#39; s 商工会議所。(0.45 NA で 20 × 対物) 倒立顕微鏡下で商工会議所の大きな四角形の 1 つであるセルをカウントします。
	<ol><li>4 つの大きな正方形の合計にカウントの繰り返し。N (N) のセルの合計数を計算するセルの数の平均値を = 容量希釈 x 10 4 x x カウント</li>。
	</ol></li> <li>上清 200 x g. 破棄で 5 分間サンプルの残りの部分を遠心し、凍結 1 mL あたり 10 の 6 セルの濃度の溶液にペレットを再懸濁します</li>。
	<li>因数 10 6 セル (1 mL) 各セラム チューブの懸濁液。冷凍コンテナーでセラム チューブを置き、-80 でフリーズ ° C</li>
	<li>次の日は、液体窒素でセラム チューブを格納します</li>。
</ol> 2。フィーダー細胞培養 <ol><li>導出プロセスを開始する前に 1 〜 4 日雪解けセラム 1 x 10 の 6 を含む不活化 37 で水浴の HFF 1 セル ° C</li>
	<li>で解凍 HFF 1 の 1:6 希釈加温 10 %fbs と 37 温 DMEM を ° C</li>
	<li>豚皮から予め温めておいた 0.2% のゼラチンの 500 μ L で 4 ウェル プレートのすべての井戸を埋めるし 37 ° C で 10 分間でプレート</li>
	<li>は井戸からゼラチンの 500 μ L を取り外してタイトピロー包装希釈を 500 μ l 添加します。井戸の底にタイトピロー包装の均一な分布を確実にプレートがみ合います。円形の動きを避けるために、井戸の中央に細胞が集中</li>。
	<li>少なくとも 24 h 各ウェルで不活化タイトピロー包装の単分子膜を取得する CO 2 を 37 ° C、5% でプレートをインキュベートします</li>。
	<li>次の日は (0.3 NA と 10 × 対物) 倒立顕微鏡下で細胞を観察し、接続されているが、均一を確認します。DMSO の残党を排除するために媒体を変更します。メディアを取り出して、10% に予め温めておいた DMEM を 500 μ l 添加 FBS</li>。
</ol> 3。胚のコレクションおよび文化 <ol><li>4 日採卵前に、管理 5 IU 妊馬の &#39; 6-12 週齢の雌マウスに腹腔内投与による s 血清ゴナドトロピン 。
	注: 他のマウス系統から女性を使用できますが、129S2 または B6CFAF1 株から雌を使用している我々。それにもかかわらず、とき (例えば CBA)、非寛容な株から雌と作動媒体補わなければなりません 2i と手順 4.2 で説明した</li>。
	<li>後 48 h と腹腔内投与によるひと絨毛性ゴナドトロピンの 5 IU を管理する少なくとも 8 週齢、1:1 の比率で男性と女性を仲間します。次の日、男性から女性を区切ります</li>。
	<li>採卵前日は 35 mm 細胞培養シャーレ 4 mg/ml のウシ血清アルブミン (BSA) KSOMaag 培のいくつかの 40 μ L 滴を準備し、鉱物油滴を完全にカバーするためにプレートを埋めます。媒体を平衡に CO 2 を 37 ° C、5% で皿をインキュベートします</li>。
	胚操作ピペットを準備する <li>は熱長い先端ガラス パスツール ピペット ブンゼン バーナーを使用しての薄い部分です。柔らかい、炎から引き出すし、2 つの端を離れて引っ張る。希望の長さにそれを破る。先端の内径が 100-150 μ m にする必要があります</li>。
	<li>頚部転位 45 48 h の ポストの coitum (パソコン) による雌マウスを安楽死させる</li>。
	<li>は、湾曲した滑らかな鋭いハサミで皮膚とまっすぐ鋭いハサミで腹膜を切断することによって腹腔内を公開するマウスを解剖します。ピンセットで 1 つ子宮をつかむ、まっすぐ鋭いはさみを使用して卵管を切断し、Hepes バッファー CZB 培地 (HCZB) 13 37 に ° c. その他の卵管を削除する処理を繰り返します</li>。
	2 細胞期胚を収集する時計鉗子によって行われて <li>フラッシュ HCZB 搭載 1 mL 注射器で卵管 。
	注: フラッシュの針を 30 G の注射針を準備する、最後をカットし、研磨石の鈍い先端に地面します</li>。
	<li>口のピペットなどの器具を使用して、胚をピックアップ、HCZB で洗って、胚盤胞期まで 37 ° C、5% CO 2 で事前に準備された胚培養皿にそれらを文化します。50 胚までそれぞれ 40 μ L ドロップで培養することができます。胚開発顕微鏡の下のすべての 24 h を監視します 。
	注: 代わりに、胚を 体外で 胚培養を短縮する胚盤胞の段階で収集できます。この場合、3.5 から 4.5 p. c. の日に女性を安楽死させる、子宮を解剖します。HCZB とフラッシュと</li>。
</ol> 4。幹細胞誘導 <ol>胚の播種日 派生プレートの準備 <ol><li><li>100 μ M β 2 メルカプトエタノール、1 を DMEM 培地を補うことで派生メディアの準備 x 非必須アミノ酸、血清の置換、および 10 の 20 3 U/mL LIF。</li>
		<li>に応じて、また追加 MEK 阻害剤 PD0325901 の 1 μ M と 3 μ M の GSK3 阻害剤 2i 媒体を取得する CHIR99021 です</li>。
		<li>取るから不活化タイトピロー包装 (ステップ 2.6) の単分子膜 4 ウェル プレート、インキュベーター。メディアを取り出して、予め温めておいた派生中の 800 μ L を各ウェルに追加します。インキュベーターにプレートを返します</li>。
	</ol></li> <li>透明帯除去、播種胚 <ol><li>35 mm 細胞培養シャーレ酸性 Tyrode 3 30 μ L 滴と準備 &#39; s ソリューション 14 派生中 3 30 μ L 滴。鉱物油と滴をカバーし、37 で皿を保つ ° C</li>
		<li>は、インキュベーターから胚培養皿を取る。一つずつ酸性 Tyrode 文化滴から、胚盤胞を転送 &#39; s ソリューション ドロップ操作、胚のピペットを使用しています。可能な場合のみ、拡張胚盤胞導出プロセスを開始するを選択します</li>。
		<li>は、顕微鏡下で透明帯消化を監視します。透明帯が消えると、すぐに、派生中ドロップする酸性 Tyrode を洗浄するために胚盤胞を転送 &#39; s ソリューションです</li>。
		<li>各ウェルにインキュベーターと種子 1 つ透明帯除去胚盤胞フィーダーから 4 も派生板細胞を取る</li>。
		<li>4 よく導出プレート インキュベーターと 37 ° C、5% CO 2 で文化に戻ります</li>。
	</ol></li> <li>監視幹細胞成長および媒体を変更 <ol><li>培養倒立顕微鏡 (0.45 NA で 20 × 対物) の下のすべての 24 h を監視します。幹細胞の分化、腫れの屈折細胞周囲の副産物かもさておき、フィーダー細胞を押すなどの兆候があるかどうかに注意することが重要だ</li>。
		<li>毎日、文化の媒体を変更します。インキュベーターから 4 ウェル プレートを取る、各ウェルからメディアを取り出して、使用される場合は LIF と 2 i、予め温めておいた導出培の 800 μ L を追加します。(6-8 日) 観察される増殖までの文化を維持します</li>。
	</ol></li></ol> 5。幹細胞文化およびメンテナンス <ol><li>準備 Kolle のようなハンドルおよび幹細胞操作ピペット。フォロー ステップ 250-300 μ m の先端の内径と幹細胞操作ピペットを準備するのに 3.4 Kolle のようなハンドルを準備するのにプルのパスツール ピペットの他の部分を使用します。熱し、フックを得るまで形状します</li>。
	<li>は、インキュベーター外 4 ウェル培養プレートを取るし、顕微鏡下で伸長を探します。分化細胞や副産物を囲む餌箱を押してすぐハンドルを使用します 。
	メモ: 最終的な分化、伸長を避けるためには、それは副産物の端から差別化されたすべてのセルを削除することが重要です</li>。
	<li>幹細胞操作ピペットと伸長を吸引し、50 μ L のトリプシン-EDTA ドロップで新しい料理</li>。
	<li>メスを使用して、両方の機械的および酵素の分解およびそれのためにいくつかの部分に突起をカットします</li>。
	<li>すぐにトリプシンを中和するために導出中の新鮮なドロップに伸長フラグメントを転送します</li>。
	<li>は、フィーダーの単分子膜の新しい 4 ウェル プレートに伸長フラグメントを転送します。ウェルあたり最大 10 個の断片を転送し、誘導培地で 37 ° C および 5% の CO 2 とそれらを文化します</li>。
	<li>は、mESC の樹立を検討する前に、少なくとも 6 週間の幹細胞のような文化を維持します。他のすべての日とサブカルチャー媒体を変更して週に 1 回</li>。
</ol>

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</ol>

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MESC 行派生は日常的に多くの実験室で使用されるよく知られているプロシージャが、その効率は常に多能性維持を妨げることができる複数の要因のために期待高。本稿で示す、ステップバイ ステップ、シンプルで信頼性のあるプロトコルを使用して高効率 mESC ラインを確立する方法。これらの効率は文献で報告されたものに似ています。
最大の効率を確保するため、毎日、細胞を制御することが重要ですし、毎日、以降示されたポイントだけ説明。これは細胞死と分化を促進するためにコロニーの増殖を避けるために不可欠です。これはまた細胞生存率を減らすことができるためにも、継代培養中植民地のトリプシン-EDTA への暴露を可能な限り減らすために重要です。
もう一つの重要な要因は、フィーダー細胞のソースと彼らの文化です。いくつかの研究は、マウス、マウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEF) HFF STO 線維芽細胞が均等に esc キー導出と文化15をサポートすることが実証しています。ただし、HFF は文化<sup cla...

胚性幹細胞 (ESC) は、自己更新または [特定の条件1を区別する能力を保持する着床前胚由来多能性細胞です。これらのプロパティに基づいて、esc キー、再生医療、疾患モデル作製、組織工学研究2便利なツールとなっています。
ESC は、初めて着床前マウス胚、低成功3,4マウス ESC (mESC) 線を元から派生しました。長年、導出効率残った多能性体外を維持が困難なのため、低。その上フィーダー細胞の5導出の効率を向上させる存在促進コロニーの添付ファイルと、核型安定性6、多能性維持の改善にプロトコル リードのいくつかの変更。最も重要なだった白血病抑制因子 (LIF) のまた mESC 培7、8、129S2 寛容な背景9からの胚の使用と mESC を添加した培地での培養が定義されています。血清、潜在的な差別化要因10の無料。最近では、説得力のある証拠はまた mESC 培 (2 i として知られている) するシグナル伝達経路の 2 つの小分子変調のカクテルの多能性を維持するために最善であることを示しています。マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ (MAPK) 経路を阻害することによって分化信号を減らす、PD0325901 MEK 阻害剤の GSK3β 阻害剤 CHIR99021 は、低密度で細胞の生存を高める組み合わせから成るカクテル 2i11wnt シグナル経路を活性化。
本稿では効率的に mESC 行をマウス胚盤胞に由来する単純なプロトコルをについて説明します。LIF と血清交換12導出培にフィーダー細胞に寛容な系統からの胚を培養標準の手順を従ってください。このプロトコル、mESC ラインは、2 i の中で得られたものと同等の効率で派生できます。これにもかかわらず、非寛容な系統を扱うときに多能性維持、または可能性のある問題を回避する 2 i を追加できます。

<table><tbody><tr><td>1 mLスリリンジ</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>309628</tr><tr><td>2-&β;-メルカプトエタノール</td><td>Life Technologies</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>4ウェルプレート</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>酸性チロード液&nbsp;</td><td>自家製</td><td></td><td>Nagy et al、2003のレシピを参照してください。短期保管(最大1か月)の場合は4°Cに保ちます。または、長期保管の場合は-20°Cに保ちます。溶液の効率が低下する場合は、HCl 1Mの小さな滴を追加することで酸性化する必要があります。</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes - Invitrogen</td><td>A-21200</td><td>1:500希釈。Oct4、Tuj1、&alpha;SMAおよびAFPマウス抗体の二次抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>CHIR990212</td><td>Axon Medchem&nbsp;</td><td>1386</td><td>粉末1mgごとに2.15 ml DMSOで再構成し、1 mMのストック溶液を得る。希望の量で分注し、-20°Cで保存します。凍結と解凍のサイクルは避けてください。&nbsp;</td></tr><tr><td>CryoTube</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>3754518</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>41640</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>BioWest</td><td>L0107</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>BioWest</td><td>S1810</td><td>使用前に56°Cで30分間加熱して不活化してください。C</td></tr><tr><td>フラッシングニードル</td><td>BD&nbsp;</td><td>304000</td>針の端を切り、豚の皮からゼラチンの研磨<td>石の鈍い先端に粉砕</td></tr>します <tr><td></td><td>Fluka</td><td>48724</td><td>蒸留水で0,2%で希釈し、オートクレーブします。各希釈液は1ヶ月間使用できます。</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG、Alexa Fluor 594</td><td>分子プローブ - Invitrogen</td><td>A-11037</td><td>1:500希釈。Sox2ウサギ抗体の二次抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>BioWest</td><td>L0611</td><td></td></tr><tr><td>Hepes緩衝CZB&nbsp;</td><td></td><td></td>自家製 <td>Chatot et al, 1989</td></tr><tr><td>Human chorionic gonadotropin</td><td>Divasa-Farmavic</td><td>Veterin-Corion 3000 UI</td><td>NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 mL and store at -20&ordm;Cは最長2ヶ月間。解凍したら、再び凍結しないでください。&nbsp;</td></tr><tr><td>人間の包皮の線維芽細胞</td><td>ATCC</td><td>ATCCSCRC-1041</td><td>長期保存のために液体窒素でそれらを保存することをお勧めします。</td></tr><tr><td>ノックアウトセラムリプレイスメント</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ&nbsp;10828-028</td>感<td>光性。10mlなどの少量で分注し、-20°Cで保存することをお勧めします。C(有効期限を確認してください)。凍結と解凍のサイクルを避けてください。&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>KSOMaag Evolve</td><td>Zenith Biotech</td><td>ZEKS-050</td>サプリメント<td>、4 mg / mlBSA付き。37&ordmで平衡化します。Cと5%のCO2を使用前に。</td></tr><tr><td>白血病抑制因子</td><td>Merk Millipore</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>マウス&nbsp;</td><td>Charles River/Harlan</td><td></td><td>mESCの導出に関しては、寛容株(129S2やC57BLなど)のマウスを使用することをお勧めします。しかし、近交系は胚を産生する効率が悪いです。したがって、ハイブリッドの活力を利用するために、129S2 x C57BLまたはB6CBAF1などのハイブリッド株を使用することをお勧めします。&nbsp;</td></tr><tr><td>ミネラルオイル</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td>胚を試験しました。感光性.&nbsp;</td></tr><tr><td>マイトマイシンC</td><td>Serva</td><td>2980501</td><td>粉末をMilliQ水で0.5 mg / mlで再構成します。Cは光から保護します。注意、それは有害であり、癌を引き起こす疑いがあります。&nbsp;</td></tr><tr><td>マウス抗チューブリン&β;III (Tuj1)</td><td>Biolegend</td><td>MMS-435P</td><td>1:500</td></tr>希釈 <tr><td>マウスモノクローナル抗アルファ;SMA</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td>1:200</td></tr>希釈 <tr><td>マウスモノクローナル抗AFP</td><td>R&D Systems</td><td>MAB1368</td><td>1:50希釈マウス</td></tr><tr><td>モノクローナル抗Oct3/4&nbsp;</td><td>Santa cruz</td><td>Sc-5279</td><td>1:50希釈</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸Life</td><td>Technologies</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Axon Medchem&nbsp;</td><td>1408</td><td>粉末1mgごとに2.08 ml DMSOで再構成し、1 mMのストック溶液を得る。希望の量で分注し、-20°Cで保存します。凍結と解凍のサイクルは避けてください。</td></tr><tr><td>ペトリ皿 (35mm)</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿 (60mm)</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>妊娠中の牝馬の血清性腺刺激ホルモン</td><td>フォリゴン</td><td>フォリゴン-1000 UI</td><td>NaCl 0.9% で 50 IU/ml. 1 mL で希釈し、-20&ordm で保存します。Cは最長2ヶ月間。解凍したら、再び凍結しないでください。&nbsp;</td></tr><tr><td>Rabbit policlonal anti-Sox2</td><td>Merck Millipore</td><td>AB5603</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>T75 falcon</td><td>Thermo Scientific</td><td>130190</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 10x</td><td>BioWest</td><td>X0930</td><td>HBSSで1:10希釈して1x溶液を得る</td></tr></tbody></table>

マウス着床前胚幹細胞の誘導

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

マウス胚性幹細胞 (mESC) の導出は、着床前の胚からの多能性細胞が確立されたプロセスです。これらの行は、自己更新または特定の条件の下で区別するための能力を保持します。これらのプロパティにより mESC、再生医療、疾患モデル作製、および組織エンジニア リングの研究に有用なツールです。寛容なマウス系統白血病阻害因子を添加した培地でフィーダー細胞から胚盤胞培養 mESC 行高導出効率 (60 ~ 80%) を取得するための単純なプロトコルを説明します。プロトコルは、派生メディア (2i 中) に 2 つの小分子阻害剤のカクテルの簡単な付加によって効率的に mESC 行を非感受性マウス系統から派生にも適用できます。準備とフィーダー細胞、コレクションと mESC 行のマウス胚および派生のカルチャとカルチャのカルチャに関する詳細な手順を提供しています。このプロトコルは、特殊な機器を必要としないし、基本的な哺乳類の細胞の文化の専門知識を持つ任意の研究室で実施することができます。

このプロトコルに従い以上伸長形成の 95% の文化 (図 1 a) の最初の週後達成する必要があります。6 継代後 mESC の樹立は、60-80% の平均成功の実験的複製間で変数です。2i 添加ほど向上しません結果 129S2 のバック グラウンドを持つものなど、寛容なマウス系統を操作するときが、非寛容な系統を使用するときに必要です。
マウス esc キー コロニー フラットの形をした正規の形態を示すべきである (図 1 b-C) 治療せず培養した場合のエッジを定義や 2i で培養された (図 1)。コロニー周辺分化標識の提示をする必要があります (図 1E-F</...

この資料では、効率的に派生し、胚盤胞の段階でマウス胚からの多能性幹細胞株を培養するプロトコルについて説明します。

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

幹細胞は多能性を有する特殊な細胞であり、長期的な自己複製能と、特定の条件下で三胚葉から分化した細胞を産生する能力を特徴としています。これらの特性により、幹細胞は再生医療、疾患モデリング、および動物工学において大きな可能性を秘めています。長年、研究目的の胚性幹細胞株は主にマウス胚から誘導されてきましたが、一般的にその誘導効率は低い状態にありました。このビデオでは、2iなどのシグナル伝達経路調節剤を使用した場合に得られる効率に匹敵する、十分に高い誘導効率を実現する標準的な条件下でのマウス胚性幹細胞（ESC）株の確立のための簡易プロトコルを紹介します。このプロトコルでは、ESCの誘導および培養のためのフィーダー細胞としてヒト包皮線維芽細胞を使用します。ESCの誘導プロセスを開始する前に、フィーダー細胞を不活化させる必要があります。まず、液体窒素で保存されたヒト包皮線維芽細胞の凍結保存バイアルを取り出し、37°Cの水槽に浸して融解させます。融解後、胎児牛血清を添加したDMEMで内容物を希釈します。この希釈液をFalconフラスコに播種し、コンフルエントになるまで培養します。次に、線維芽細胞を不活化するため、胎児牛血清を添加したDMEMでマイトマイシンCを希釈し、この不活化溶液中で細胞を3時間インキュベートします。次に、不活化溶液を除去し、ハンクス平衡塩溶液で細胞を3回洗浄して、マイトマイシンCの残存物を除去します。不活化したフィーダー細胞を剥離させるため、trypsin-EDTA溶液を1 mL加え、細胞を5分間インキュベートします。その後、倒立顕微鏡で細胞を観察し、培養フラスコから剥離していることを確認します。次に、パスツールピペットで細胞をピペッティングして細胞塊を解離させ、胎児牛血清を添加したDMEMを4 mL加えて酵素溶液を中和します。少量を分取して生理食塩水で希釈し、ノイバウエル型血球計数器を用いて細胞数を測定します。同時に、サンプルの残りを遠心分離します。上清を捨て、ペレットを凍結保存液で希釈し、最終濃度を10^6 cells/mLにします。懸濁液を凍結保存 vial に分注します。最後に、凍結保存 vial を凍結コンテナに入れ、-80°C で保存します。翌日、液体窒素中に保存します。誘導プロセスの開始の1～4日前に、液体窒素に保存されている不活化フィーダー細胞のクライオチューブを取り出し、37 °Cのウォーターバスで融解させます。次に、胎児牛血清を添加し、あらかじめ加温しておいたDMEMで細胞を希釈し、緩やかにピペッティングして均一な混合液にします。4ウェルプレートの各ウェルに、あらかじめ加温したゼラチン溶液を500 µLずつ加え、37 °Cで10分間保持します。その後すぐに、各ウェルからゼラチンを除去します。各ウェルに500 µLのフィーダー細胞希釈液を加え、プレートを静かに揺らして、ウェルの底にフィーダー細胞が均一に分布するようにします。細胞がウェルの中央に集中するため、円を描くような動きは避けてください。その後、プレートを37 °C、5% CO2のインキュベーターに入れ、少なくとも24時間培養します。翌日、倒立顕微鏡下で細胞を観察し、細胞が接着し、十分に分散していることを確認します。最後に、DMSOの残留分を除去するため、フィーダー細胞の培地を、胎児牛血清を添加し予熱したDMEMに交換します。胚を回収する前に、妊馬血清ゴナドトロピン5 IUおよびヒト絨毛性ゴナドトロピンを48時間の間隔で腹腔内投与し、マウス雌の超排卵を誘導します。雌マウスを雄マウスと交配させ、24時間後に分離します。2細胞期の胚を回収するために、交配から48時間後に雌マウスを安楽死させ、解剖して輸卵管と子宮角の短い部分を摘出し、HEPES緩衝CZB培地を入れたディッシュに置きます。その後、実体顕微鏡下で輸卵管をHEPES緩衝CZB培地で一つずつ洗浄し、胚を回収します。2細胞期の胚を、前日に準備した、ミネラルオイルで覆われた胚培養液を数滴滴下した培養皿に移します。胚をインキュベーター内で胚盤胞期まで培養します。24時間ごとに胚の発育状態を確認してください。胚は、in vitro 培養開始から 48 時間後に胚盤胞期に達すると予想されます。可能であれば、誘導プロセスを開始するために、拡張胚盤胞のみを選択してください。胚の播種当日に、幹細胞誘導用の培地を調製します。DMEMに2-beta-mercaptoethanol、非必須アミノ酸、およびKnockOut serum replacementを添加し、さらに白血病抑制因子（LIF）を加えます。必要に応じて、MAPK阻害剤とGSK-3阻害剤を添加し、2i培地を作成します。インキュベーターから、フィーダー細胞の単層が形成された4ウェルプレートを取り出します。培地を除去し、調製したばかりの分化誘導培地を800 µL添加します。胚盤胞をフィーダー細胞に播種する前に、透明帯を除去する必要があります。そのために、培養プレートから胚を1つ、酸性タイロード溶液のドロップに移し、透明帯が消化されるまで保持します。実体顕微鏡のフォーカスとコントラストを調整し、透明帯が完全に除去されていることを確認します。次に、透明帯除去後の胚を数滴の誘導培地で洗浄し、フィーダー細胞の単層上に播種します。残りの胚についても同様の操作を繰り返します。プレートを37°C、5% CO2条件下で培養します。倒立顕微鏡を用いて24時間ごとに培養状態を観察し、増殖を確認するとともに、アウトグロース周囲の屈折率の高い膨らんだ細胞や、フィーダー細胞を押し退けている様子など、分化の初期兆候がないかを確認します。培養液は1日おきに交換してください。そのためには、4ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、各ウェルから培地を除去して、LIFおよび（使用する場合は）2iを添加し、あらかじめ加温した分化誘導培地を800 microliters加えます。プレートをインキュベーターに戻し、アウトグロースが観察されるまで培養を維持します。胚盤胞の播種から6〜8日後にアウトグロースが観察されるはずであり、その時点で継代培養を行う必要があります。この手順では、カリング用ハンドルおよび幹細胞操作用ピペットが必要です。これらを製作するには、ロングチップのパストゥールピペットを用意し、ブンゼンバーナーで細い部分を加熱します。軟化したところでピペットを炎から離し、両端を分離するまで引き離します。太い方を幹細胞操作用ピペットとして使用します。細い方の先端を加熱し、カレット状のハンドルにするためにフック状に成形します。アウトグロースを継代させるには、実体顕微鏡下でその位置を確認します。ハンドルを使用して、アウトグロースの周囲にある分化した細胞を押し除けます。今後の分化を防ぐため、アウトグロースの端から分化した細胞を厳格に取り除くことが重要です。幹細胞操作用ピペットを用いてアウトグロースを吸引し、あらかじめ温めておいたtrypsin-EDTA溶液の液滴に移します。メスを用いて、機械的および酵素的に分散させるために、アウトグロースを数片に切り分けます。アウトグロースの断片を回収し、トリプシンの作用を中和させるため、あらかじめ温めておいた誘導培地の一滴の中に置きます。最後に、アウトグロースの断片をフィーダー細胞の単層がある4ウェルプレートに播種し、37 °C、5% carbon dioxideの条件下で誘導培地を用いて培養します。ESC株が確立したと見なされるには、幹細胞様培養を少なくとも6週間維持する必要があります。この期間中、培地を隔日で交換し、週に1回継代させる必要があります。継代数が増えるにつれて、コロニーの形態はドーム状から、より伸長し扁平な形態へと徐々に変化します。6代の継代後、マウスESC株はOct 4やSox 2などの多能性マーカーを恒常的に発現します。さらに、フィーダー細胞を除いた10%胎児牛血清添加DMEM中で培養し、ESCのin vitro分化を誘導すると、三胚葉を代表する分化マーカーが免疫蛍光法によって検出されます。ここでは、外胚葉のマーカーとしてのanti-tubulin beta-3タンパク質、中胚葉としてのalpha-smooth muscle actin、および内胚葉としてのalpha-fetoproteinの検出について示します。この簡便な手順に従うことで、60%から78%の効率でマウス胚盤胞から胚性幹細胞を誘導することができます。この手順を行う際は、ここに記載したタイミングはあくまで例示であるため、毎日または1日おきに細胞の状態を確認することが重要です。胚性幹細胞のコロニーが過剰に増殖すると、細胞の蓄積により色が濃くなり、分化しやすくなる傾向があります。このビデオを視聴することで、標準的な条件下でのマウス胚性幹細胞の誘導および培養について十分に理解できるはずです。

derivation-of-stem-cell-lines-from-mouse-preimplantation-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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マウス胚性幹細胞は、OP9-DL1共培養システムを使用してin...

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マウス着床前胚幹細胞の誘導

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