生体内でマルチ モーダル イメージングとマウス レーザー誘発脈絡膜新生血管モデルの解析

マウスのレーザー誘発脈絡膜新生血管の形態学的変化のフォロー アップの縦生体内イメージングの有用性を紹介します。

血管新生プロセスは、いくつかの一般的な眼の病状の特徴です。最も顕著なのは、滲出性加齢黄斑変性症または滲出性AMD(短時間)、増殖性糖尿病性網膜症、および未熟児網膜症です。これらを合わせると、これらの障害は世界中で合法的な失明のほとんどの例を占めており、硝子体出血や血管新生緑内障などの追加の眼合併症と関連しています。

しかし、その有病率にもかかわらず、眼の新生血管障害の治療選択肢は限られています。AMDおよび増殖性糖尿病性網膜症に関連する血管新生の現在の標準治療は、血管新生および血管新生の重要なメディエーターである血管内皮増殖因子またはVEGFに対するヒト化抗体の硝子体内注射です。しかし、疾患の進行を止め、機能的な視力を改善する効果があるにもかかわらず、硝子体内注射は費用がかかり、リスクがないわけではありません。

合併症には、感染症、眼内炎、網膜剥離、眼の出血などがあります。そのため、有効性、安全性、低コストの新たな治療選択肢の開発が急務となっています。血管新生疾患の創薬を進めるためには、小動物モデルが非常に重要です。

このようなモデルは、再現性があり、読み取り値とエンドポイントが確立され検証されている必要があり、理想的には、ポジティブコントロールとして機能する臨床的に関連する参照化合物を使用する必要があります。このプロトコルでは、マウス脈絡膜新生血管、またはCNVモデルを紹介します、これは最も一般的に使用されるモデルの1つです CNVに寄与する病態生理学的メカニズムの研究と新しい抗新生血管薬の開発。CNVモデルでは、ブルッフの膜をアルゴンレーザーで破裂させます。

これにより、脈絡膜に由来する血管新生プロセスを開始します。スペクトル領域光干渉断層撮影法(略してSD-OCT)とフルオレセイン血管造影法による縦断的in vivoイメージングを採用することで、CNVの増殖と回帰を追跡する手段が得られます。そしてそれにより、新規の医薬品介入の有効性と時間経過を評価すること。

画像処理の最近の進歩により、網膜の厚さを測定するための自動セグメンテーションが可能になり、浮腫の存在を評価するための研究者の偏見のない方法論が提供されます。ここでは、ライカマイクロシステムズの新しいInVivoVue Diverソフトウェアが、マウスCNVモデルにおける網膜層の自動セグメンテーションに有用性について解説します。最後に、網膜全マウントの組織学的解析が、このモデルにおける縦方向のin vivoイメージングをどのように補完できるかについて説明します。

1滴のトロピカミドを各眼に塗布して、瞳孔の拡張を行います。その後、動物をげっ歯類の整列段階に穏やかに配置します。マウスは目を露出するように調整され、ノーズホルダーと背中にそっと置かれた実験用テープを使用して固定されます。

次に、潤滑剤を一滴目に置いて潤いを与え、余分な液体を濾紙綿棒で慎重に取り除きます。最後に、ベースラインOCTイメージングのために、ステージをOCTデバイスの前に位置合わせします。in vivoスペクトル領域光干渉断層撮影イメージングは、網膜の異常がないことを確認するために、レーザー適用前にベースラインで実行されます。

マウスをホルダーからそっと取り外します。Viscotearsジェルを1滴カバースリップに置き、角膜を圧嘆状にします。.視神経頭を中心にマウスを向け、レーザービームを網膜色素上皮に集束させます。

視神経の周りの4時、8時、12時の位置で網膜血管を避けて、3回のレーザーショットを行います。すべてのレーザーショットの後、網膜出血がないかどうか目の硬さを検査します。前回と同様に、マウスをホルダーに位置合わせし、フルオレセイン血管造影とOCTイメージングを行い、ブルッフ膜の損傷を確認します。

フルオレセイン血管造影では、まず赤外線反射モードを使用してレーザー燃焼領域に焦点を合わせ、レーザーが投与された部位を視覚化することができます。マウスの目の位置を変えずに、マウスの体重約20グラムに対して、0.1ミリリットルの5%フルオレセインナトリウム塩を慎重に注入します。.脈絡膜のレベルと網膜のレベルで、約30秒ごとにフルオレセイン血管造影画像の撮影を開始します。

以前と同様にOCTイメージング用のアイを合わせ、イメージングを開始します。SD-OCT信号を平均化すると、このシーケンスに示すように、詳細な網膜の形態をよりよく視覚化するのに役立ちます。SD-OCTイメージングを実行したら、マウスをホルダーから慎重に取り外します。

両目に潤滑剤を塗ります。この時点で、メデトミジン、アチパメゾールのα-2拮抗薬の皮下注射によって麻酔を逆転させるか、麻酔からの動物の回復を待つかを選択できます。麻酔をかけた動物でin vivo SD-OCTおよびFAイメージングを、フォローアップの5日目、10日目、および14日目に繰り返します。

InVivoVue Diverソフトウェアによる自動セグメンテーション機能を使用して、網膜の厚さを測定します。健康な網膜の場合、網膜の総厚さは、神経線維層からRPEまでのすべての層の厚さと見なされます。健康な網膜では、この例で見られるように、自動セグメンテーションにより個々の網膜層を正確に検出できます。

CNVが存在する場所では、CNV病変部位ごとに網膜の厚さを手動で測定する必要があることは注目に値します。神経線維層からRPE層を通る架空の線まで。このシーケンスは、CNV 病変が存在する部位での手動厚さ測定のワークフローを示しています。

神経線維層は画像の上部にあり、脈絡膜は画像の下部にあります。マウスやタッチパッドを使用して、神経線維層と脈絡膜の境界を手動で決定し、ソフトウェアはこれらの座標に基づいて網膜全体の厚さを自動的に計算します。この図は、脈絡膜レベルで 20 秒ごとに撮影されたシリアル画像を示しています。

画像1は赤外線反射モードで取得しました。一方、他のものは、腹腔内フルオレセイン注射後です。画像の白い矢印は、レーザーで照射された部位を指しており、後の時点でのフルオレセインの漏れを示しており、画像18の白い矢印で強調表示されています。

この画像は、網膜レベルで取得したFAシリアルイメージングを示しています。画像18の白い矢印はレーザーで照射された部位を指しており、画像18の円で囲まれた他の2つの画像よりもフルオレセインの漏れが速く現れていることを示しています。この概要図は、SD-OCT画像の時間経過を示しています。

ベースライン時、レーザー照射直後、および5日目、10日目、14日目のフォローアップ時点。要約すると、SD-OCTおよびFAイメージングを使用したCNV病変の縦断的in vivoイメージングのプロトコルは、CNVの病理と網膜浮腫の存在の迅速で、マルチモーダルで、信頼性の高い分類を可能にします。ご関心をお寄せいただき、誠にありがとうございます。