Name: 郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-06T16:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 学ぶ成人ショウジョウバエ脳の解剖と免疫蛍光染色法。きのこ体と光受容器ニューロンの形態を可視化し、神経発生とシグナル伝達経路の研究に応用します。この技術は神経科学の発展に貢献します。

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我々 は最初の教材 SMK 脳解剖技術 Changhui 朴とたラン Vrailas モーティマーを感謝したいです。私たちも批判的に、原稿を読み取るためケン モーベリの実習グループ、特にクリス ラウンドのメンバーに感謝します。Fas2 を認識する抗体 (1 4) chaoptin (24B10) が銀行ハイブリドーマ発達研究から得られました。シーモア ・ ベンザー、南司・ コリー24,60,61抗体 24B10、DSHB に預けて、コーリー ・ グッドマン22,23,56抗体 1 4、DSHB に預けています。はえの在庫は、ブルーミントンのストック センターから得られました。図 4A に脳をイメージするオハイオ州の農業研究および開発センター (OARDC) MCIC イメージング センター共焦点顕微鏡の使用のために感謝したい、B. SMK は発育からの助成金によってサポートされる (1 R15 HD084241 01A1)。

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

上記郭清と可視化の方法はさまざまな免疫染色で使用することができ、ライブ イメージング アプリケーション。我々 は一般的な免疫染色プロトコルの概要を示しているし、個々 のきのこ体ニューロンの軸索形態を視覚化するために MARCM を使用できます 1 つの方法を強調しています。さらに、これらの一般的な手順は固定で他の頭脳領域を画像にも使用できます。 または新たに切り裂かれた大人脳48,65。ライブ イメージングは、例えば模倣66、やレポーター遺伝子エンハンサー トラップの発現パターンを解析するときより効率的なアプローチにあります。防ぐために未固定組織で GFP のライブ イメージ投射の間の細胞死からの人工物をキャプチャするには、脳必要がありますリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) または HL3 メディア48x 1 に解剖、PBS (または HL3) x 1 の橋のスライドのマウントし、未満 15 20 分ケアのイメージそれは GFP 蛍光の可視化と干渉できるので解剖脳イメージング前からできるだけ多くの気管を削除するも撮影する必要があります。
きのこ体と光受容ニューロンの形態を評価するための染色条件では比較的老舗24,61,67, これらの細胞への関心の特定の蛋白質の局在化種類は、広範なトラブルシューティングと最適化に必要があります。特に、抗体希釈、ブロック バッファー成分濃度、固定などいくつかの重要なステップは、最も再現性のある、信頼性の高い結果を生成する最適化必要があります。まず、一次抗体の最適濃度を決定する必要があります。市販抗体はしばしば推奨希釈を持って (とその濃度を使用して、まず、多くの場合最初)、これらの値はほとんど経験的に決定ショウジョウバエのティッシュの。したがって、テストは上と下の開始提案を多くの場合で、製造元の範囲がより特定の染色による一次抗体希釈液のシリーズ。一次抗体希釈精度を染色に大きな影響を持つことができ、的確に判断する必要があります時間の脳は一次抗体を含む培養しながらソリューションすることができます全体の結果にはほとんど影響によって大きく変動。たとえば、我々 は 4 ° C で 3 つ、または 4 日間、2 つの脳 Fas2 抗体一次抗体とインキュベート解剖と同様の結果を観察しています。少なくとも 2 泊をお勧めしますがまた一次抗体溶液中の脳を一晩インキュベートし、再現性のある染色を取得しました。脳組織へ二次抗体の制限非特異的結合が重要なは、脳に部屋の温度 (または 4 ° C で 1 泊) 3 h に二次抗体の孵化の時間の量を制限できます。
第二に、不要なバック グラウンド信号を除去するために追加「ブロッキング」試薬を使用する必要があります。オプションがあります 1-10% ウシ血清アルブミン (BSA) を追加するブロックやプライマリ/セカンダリ抗体ソリューションまたはショウジョウバエの胚 (を参照してください 4 ° C で一晩一次抗体の前吸着 〜 10% に NGS の濃度を増加させる68、セクション 2.9、および参照手順 3)。
深遠な違い、洗浄、抗体培養手順 (PLP と PEM、材料表に記載) など他のバッファーでティッシュの固定可能性があります一方、我々 はすべて固定用推奨バッファーとして PTN を使用して上記プロトコルを書かれている、信号の強さ。たとえば、以前の調査は示したサイクリン E は組織が、PBS で希釈した伝統的な 4% パラホルムアルデヒドで固定するとき、幼虫成虫ディスクで検出可能ですが、組織は PLP バッファー (ケン モーベリ、個人で修正されるときがはっきりと見える通信、および参照69)。バッファーの変更に加えて、コンポーネント、ティッシュの固定、蛍光にも大きく影響するため、温度、時間を変更することは染色および必要な場合経験的決定ことができます。一般に、固定時間細胞成分の十分な架橋を許可するのに十分な長さでありながら全体として細胞の形態の長期的な保守限定に架橋し蛋白質エピトープの「埋め」を防ぐために十分。ですから、当初新たに買収した一次抗体の染色条件を最適化するとき通常約 20 分固定時間制限より冷たい温度で組織を修正することはしばしば。
第一次および二次抗体の特異性だけでなく、観察された表現型の遺伝子/遺伝的背景の影響を調査するため, 蛍光抗体法実験のいくつかのコントロールが含まれます。具体的に使用されている一次抗体が興味の蛋白質を認識するかどうかを確認、このタンパク質やタンパク質を過剰発現組織に欠けているハエから組織をコントロールとして含まれている必要があります。一次抗体がハエの脳に他のエピトープを認識するかどうかを決定するため余分な精製抗原タンパク質添加を含めることもできます。最後に、任意の蛍光信号の一次抗体を省略すると、現在は選択した二次抗体による非特異的結合のレベルを表します。
遺伝的背景の貢献や染色強度または細胞の遺伝子の存在を評価するためにいくつかの重要なコントロールが含めます。たとえば、図 5の MARCM 実験で使用されるハエを含む複数の遺伝子 (hsFLP、UAS CD8 GFP、FRT82B、浴槽 &#62;、GAL80 と OK107 GAL4)、きのこ体の形態に及ぼす影響を個別に分析します。ハエの非常に最低、きのこボディ形態で OK107 GAL4 と UAS CD8 GFP の両方を含むを分析する必要があります。ヒート ショックの影響を評価する必要があります、分析によってきのこ体における Flp リコンビナーゼ生産ハエ hsFLP と FRT82B の両方を含みます。MARCM は、特定のタンパク質が自律的軸索ガイダンスを制御するかどうかの重要な洞察を提供できますが、この結論を正確に行うために必要なコントロールの数は、この技法のマイナーな制限をすることができます。それほど複雑な実験では、類似のコントロールも適用されます。例えば、 GAL4/UASシステムがすべてのニューロンの興味の蛋白質のノックダウン式に RNAi 遺伝子との組み合わせで使用されている実験を取る。この実験では、少なくとも 2 つの遺伝子がある: elav-GAL4とUAS RNAi遺伝子などのパン神経 GAL4 ドライバー。ハエが同じ場で両方の遺伝子を抱く実験条件に加えて、単独でこれらの遺伝子の各を含むハエのきのこ体神経細胞の形態を調べる必要があります。
最後に、きのこ体神経に興味の蛋白質を表現するかどうか判断する必要がある通常共同染色脳に Fas2 抗体また、 GAL4/UASシステムを使用し、興味の蛋白質を認識する抗体と組み合わせて使用される蛍光タンパク質 GFP、RFP、または膜が CD8 GFP をバインドされているようを表すこともできます。Fas2 だけきのこ体の α と β の葉を形成した軸索が認識、GAL4 駆動、膜結合型 CD8 GFP の使用が以来きのこ体神経をマーキングする場合に役立ちます。
軸索ガイダンスの欠陥は、しばしば 100% の浸透と同じ遺伝子型のも脳は、いくつかの変動を示すことがあります。したがって、きのこ体や光受容体経路で生成される欠陥の突然変異体の対立遺伝子と新しく分析、異なる対立遺伝子とアプローチの組み合わせを利用する必要があります。文献の研究のほとんどはタンパク質が軸索ガイダンスを制御する細胞自律的役割を果たしているかどうかを調査するいくつかの異なるアプローチを使用: 私) (できれば異なるニューを使用して null のホモのハエで欠陥経路の解析ll の対立遺伝子)、ii) (RNAi) によって通常のニューロンにだけ興味の蛋白質に欠けているハエの欠陥経路の解析 iii) 草分け欠陥と iv の MARCM 解析) 遺伝子のホモ null のニューロンの再発現実験を救出ハエ。理想的には、遺伝子ごとのいくつかのダース脳神経細胞形態の欠陥を分析します。
プロトコルは固定ティッシュ内の蛋白質の蛍光像定位に主に焦点をここで説明するがこの手法のいくつかの将来のアプリケーションは、画像ライブ脳組織に開発されています。25 ° C で数日間、その後培養することができます脳は、(通常の細胞培養媒体) は解剖して、一度彼らこれら体外培養方法は、さまざまな傷害70,71, 細胞軸索再生を促進するタンパク質の活性などの生物学的プロセスを調査するために開発されています。シグナル伝達ダイナミクス72と神経の開発73。

ショウジョウバエ神経系は人間および齧歯動物のそれより小さいが、その複雑さは、脊椎動物の対応を理解するための強力な親しみやすいモデルを提供します。多くのケースでは、ハエと脊椎動物のゲノムは神経系発達のメカニズムを定める非常によく似たタンパク質をエンコードします。実際には、遺伝子の多くは脊椎動物の神経の開発のため含め、ハエのオルソログ遺伝子関与しているシグナル伝達経路の制御パターン、ニューロン新生、軸索ガイダンス1,2,3、必要な ,4,5。たとえば、ネトリン哺乳類とキイロショウジョウバエ6,7,8の軸索ガイダンスに必要なリガンドであり。ネトリンだった鶏胚脳組織6から分離されたが、その後の研究によって、そのネトリンショウジョウバエ8胚中枢神経系 (CNS) の開発中に保存された役割を果たしているが明らかにしました。他の研究は、保存されたリガンドと受容体のショウジョウバエと脊椎動物の両方9の経路探索に必要な識別するために萌芽期のショウジョウバエ中枢神経系における遺伝子スクリーニングを使用しています。
中枢神経系胚のフライは過去にリガンド、受容体と軸索ガイダンス8,9に必要な細胞内シグナル伝達タンパク質を識別するために広く使用されています、一方の最近の作品の多くで方法を調査します。これらの蛋白質はまた開発の後の段階の間に経路決定を制御します。具体的には、そのコントロールの草分け、シナプス形成、軸索プルーニングおよび神経の他のいくつかの側面きのこ体 (MB) および網膜光受容ニューロンの開発 (図 1) の調査は、メカニズムに洞察力を提供して開発10、11,12,13,14,15,16,17。光受容器ニューロンは、ラミナと呼ばれる大人の脳の領域に飛ぶ網膜を接続し、延髄と脳 (18,19によって再検討されました)、きのこ体神経細胞中に視覚情報を中継するための重大である、一元的にハエの脳に位置し、学習と記憶の20,21に必要な。ケニヨン細胞と呼ばれるきのこの体の本質的なニューロンと光受容器ニューロン シナプス ターゲットを見つけるに進化上保存された拡散性と接触依存性軸索ガイダンス機構を利用します。成虫の表示だけでなく、感光体と MB ニューロンも直接で視覚化すること幼虫と蛹抗体やレポーター遺伝子22,23,24,25。ニューロン発達の異なる時点でのこれらの 2 つのセットを簡単に視覚化する能力は、神経の開発の多くの側面の見事なモデルとしての使用を推進しています。
通常の神経系発達のメカニズムを理解するためのモデルとして使用されているだけでなく最近の研究を示しているハエがさまざまな壊れやすい X シンドローム (FXS)26 を含む人間の病気の正確なモデルとしても利用できます。、知的障害者 (ID)27,28,29,30,31, その他32。たとえば、ZC3H14 の分子機能を勉強する最近人間の知的障害にリンクされて遺伝子我々 モデルを作成飛ぶ Nab230と呼ばれるフライ ZC3H14 相同のヌル対立遺伝子を使用して ID の。ハエ Nab2 を欠けている重度の記憶障害があると人間の患者で観察されるものの概説ポリ a の尾を拡張、または患者由来細胞ライン33,34。重要なは、Nab2 にまた欠けているハエは、その大人のきのこ体34, FMR135FXS 症候群遺伝子に欠けているハエで観察されるものと同様で重篤な脳形態の欠陥を表示します。したがって、ハエは、通常の脳の発達やそれを混乱させる疾患を研究する重要なモデル有機体として使用できます。
最後に、利用可能な遺伝的ツールの広大な配列と組み合わせて、動作を監視する高スループット メソッドのアクセシビリティをショウジョウバエなど複雑な行動を制御する脳の領域を識別するための選択のモデル生物学習、記憶、睡眠、求愛、口渇等36,37,38,39。ハエの遺伝学者の「ツールボックス」の中心には特に役に立つツールの 1 つは、GAL4/UA システム (図 2) です。このシステム40,41は、遺伝子または遺伝子下流の上流活性化シーケンス (UAS) の発現を増強するのに Gal4 転写活性化因子の組織特異的発現を使用します。このシステムの変更は、たとえば、正確に特定のニューロン42,43、過剰または関心44,の特定の遺伝子をノックダウンの興奮性を制御する研究者を許可している45、リアルタイムのカルシウム動態体内46を分析し、神経系統41をマークするレポーター遺伝子を表現。分裂の再結合が抑制型セル マーカー (MARCM) システム12,47モザイク解析の作成も許可と GAL4/UAS システムの組み合わせ。MARCM は、単一ニューロン トレースで軸索ガイダンス12,47に必要な細胞のシグナリングのコンポーネントを識別するために広く使用されています。これらおよび他の技術は、神経系の働きに必要な細胞メカニズムに関する貴重な洞察力の数を提供している、ほとんどが必要; 最初ショウジョウバエ脳の解剖脳を慎重に除去が頭脳の地域間の正しい脳形態と接続パターンを保持する必要です。次のプロトコルを使用して、きのこ体と光受容ニューロン例として神経集団に従って郭清と免疫蛍光染色大人のショウジョウバエ脳します。

<table><tbody><tr><td>マイクロダイセクション鉗子/ピンセット</td><td>テッドペラ</td><td>505-NM</td><td></td></tr><tr><td>シルガード皿</td><td>リビングシステム機器</td><td>DD-50-S-BLK</td><td>amazon.com から入手可能</td></tr><tr><td>Fas2</td>抗体<td>開発研究 ハイブリドーマバンク</td><td>1D4</td><td></td></tr><tr><td>チャオプチン抗体</td><td>開発研究 ハイブリドーマバンク</td><td>24B10</td><td></td></tr><tr><td>GFP抗体</td><td>アベスラボ</td><td>GFP-1010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488ヤギ抗マウス二次抗体</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488ヤギ抗ニワトリ二次抗体</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11039</td><td></td></tr><tr><td>Alexa647ヤギ抗マウス二次抗体</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21236</td><td></td></tr><tr><td>20%パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡サービス RT15713</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus スライド</td><td>ThermoFisher</td><td>99-910-01</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>ThermoFisher</td><td>12-553-454</td><td></td></tr><tr><td>Na Phosphate Buffer monobasic</td><td>Sigma</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>Na Phosphate Buffer dibasic</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigma</td><td>X100-100ml</td><td></td></tr><tr><td>マニキュア</td><td>電子顕微鏡サービス (EMS)</td> <td>72180</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ライカ S6D KL300 LED光源</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9ウェルディッシュ (スポットプレート)</td> <td>VWR</td><td>89090-482</td><td></td></tr><tr><td>ニューテーター/ロッカー</td><td>フィッシャー</td><td>22-363-152 または 88-861-041</td><td></td></tr><tr><td>35mm ディッシュ</td><td>ジェネシー・サイエンティフィック</td><td>32-103</td><td></td></tr><tr><td>シルガード</td><td>フィッシャー</td><td>50-366-794</td><td></td></tr><tr><td>キムワイプ</td><td>フィッシャー</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>企業名</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Potential Fixation Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PTN Buffer</td><td></td><td></td><td>0.1M NaPhosphate、pH 7.2、0.1% Triton-X-100、通常、0.5 L の 0.1M NaPhosphate バッファーを構成し、必要に応じて一度に 50ml を分注</td></tr>します <tr><td>PLP バッファー</td><td></td><td></td><td>2% パラホルムアルデヒド、0.01M NaI04、0.075M リジン、0.037M NaPO4、pH 7.2、0.36 g リジンを 10 ml H2O + 7.5 ml 0.1 M NaH2PO4、pH 7.2 + 2.5 ml 0.1 M Na2HPO4 に溶解します。使用直前に、この緩衝リジン溶液15 mlを50 mg NaIO4(過ヨウ素酸ナトリウム)+ 2 mlの20%高品位パラホルムアルデヒド(EMS)+ 3 ml H2O</td></tr><tr><td>PEM緩衝液</td><td></td><td></td><td>0.1M PIPES pH 7.0、2 mM MgS04、1 mM EGTAと混合し、この緩衝液は2倍ストックとして便利に作成し、8%パラホルムアルデヒド(PFA)で希釈して最終濃度4%PFA</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong)</td>を与えることができます><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Fly在庫はBloomingtonから入手可能</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>elav(c155)-GAL4</td><td></td><td>BL458</td><td>汎ニューロンGAL4</td></tr><tr><td>ドライバーw *;;OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 854</td><td>GAL4 ドライバー for all mushroom body neurons (OK107-GAL4 insertion is on the 4th chromosome)</td></tr><tr><td>y(1), w(67c23); c739-GAL4</td><td></td><td>BL 7362</td><td>GAL4 driver for alpha and beta lobes (on 2nd chromosome)</td></tr><tr><td>y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 64305</td><td>GAL4 driver for alpha and beta lobes, also contains UAS-CD8-GFP</td></tr><tr><td>w*; 201Y-GAL4</td><td></td><td>BL 4440</td><td>主にキノコ本体のガンマローブ用のGAL4ドライバー(第2染色体上)</td></tr><tr><td>y(1)、w(67c23); 201Y-GAL4、UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 64296</td><td>キノコ本体ガンマローブ用のGAL4ドライバーは、UAS-CD8-GFP</td></tr><tr><td>w*、elav(c155)-GAL4、hsFLPも含んでいます。FRTG13、Tub>Gal80 / CyO</td><td></td><td>BL 5145</td><td>MARCMストックは、第2染色体上のFRTサイトとGAL80を含む</td></tr><tr><td>w*、elav(c155)-GAL4、hsFLP、UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL5146</td><td>MARCMストック、hsFLP、汎ニューロンGAL4、およびX染色体Y(1)上のCD8-GFPを含む</td></tr> w<tr><td>*、hsFLP、UAS-CD8-GFP;;FRT82B、浴槽>GAL80 / TM3、SB(1);OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 44408</td> 第3染色体Y(1)、w *、hsFLP、UAS-CD8-GFP<td>を反転するためのMARCMストック</td></tr><tr><td>;FRT40A、浴槽>GAL80;OK107-GAL4</td><td></td><td>BL44406</td><td>第2染色体を反転するためのMARCMストック</td></tr><tr><td>w*、hsFLP、tub>GAL80、FRT19A;UAS-CD8-GFP/CyO;;OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 44407</td> X染色体Y(1)<td>を反転するためのMARCMストック</td></tr>、<tr><td>w *;UAS-CD8-GFP/CyO</td><td></td><td>BL 5137</td><td>GFPは細胞表面を標識します(CD8は膜貫通タンパク質です)</td></tr><tr><td>y(1)、w *;FRTG13、UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 5139</td> MARCMストックは、第2染色体y(1)、w *、hsFLP、UAS-CD8-GFP<td>上のFRTサイトとCD8-GFPを含んで</td></tr><tr><td>います。Pin(1)/CyO</td><td></td><td>BL 28832</td><td>MARCM ストック、X 染色体 w* 上に hsFLP と CD8-GFP が含まれています</td></tr><tr><td>。FRTG13、Tub>GAL80</td><td></td><td>BL 5140</td><td>MARCMストック、第2染色体</td></tr><tr><td>y(1)、w *;にFRTサイトとGAL80が含まれています。FRT82B、Tub>GAL80</td><td></td><td>BL 5135</td><td>MARCMストック、FRT部位と3番染色体上のGAL80を含む</td></tr></tbody></table>

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

神経系の開発には、いくつかのシグナル伝達経路と制御ネットワークによって調整されますイベントの一連が含まれます。これらの経路に関与するタンパク質の多くは哺乳類とミバエショウジョウバエ、似たような組織化原理がこれらの開発中に存在することを示唆しているように、他の真核生物の間保存されました。生物。重要なは、ショウジョウバエは、神経新生、分化、軸索誘導、シナプス形成を含む哺乳類に必要なプロセスを制御する細胞・分子メカニズムを識別するために広く使用されています。ハエは、様々 な人間の神経疾患をモデルに正常に使用されているも。ここで順を追ってレーザーマイクロダイ セクション、固定、および大人のショウジョウバエ脳内のタンパク質の蛍光ローカリゼーションのプロトコルについて述べる。このプロトコルでは、2 例の神経集団、きのこ体神経および網膜光受容体に焦点を当てし、抑制型セル マーカー (MARCM) を用いたモザイク解析を使用して個々 のきのこ体ニューロンをトレースするオプションの手順が含まれています。野生型と変異型の両方の脳からサンプル データが軸索ガイダンス欠陥の採点基準の簡単な説明と共に表示されます。このプロトコルは、きのこ体光受容器ニューロン、他のショウジョウバエの脳と他の頭脳領域内の蛋白質の局在化の形態を調査するため 2 つの確立された抗体を強調表示することができます。このプロトコルを使用して調査しました。

このプロトコルは、郭清と大人のショウジョウバエの染色について説明します脳の組織。具体的には、このプロトコルでは、神経の開発の多くの側面の基礎となる原則を明らかに正確に使用することができます例の神経細胞サブセットとしてショウジョウバエのきのこ体と光受容ニューロンの使用を強調表示します。

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

このショウジョウバエ脳解剖プロトコルの全般的な目的は、免疫蛍光染色、GFPタグ付きタンパク質の局在解析、およびex-vivo培養実験など、幅広い用途に使用可能な成虫からの無傷な脳を取得することです。この手法は、特定のタンパク質やシグナル伝達経路の役割、および脳発達過程における神経接続パターンの確立など、発生生物学や神経科学の分野における重要な疑問への回答に寄与します。本手法の主な利点は、一度習得すれば、成虫の脳の特定領域における形態学的欠損を免疫学的に同定するための、迅速かつ効果的な方法が得られる点にあります。ショウジョウバエの頭部から外骨格を除去するには、細心の注意と習熟が必要であるため、この手順の習得は困難な場合があります。動作はゆっくりと慎重に行い、 dissector のアームがぶれないよう十分に固定する必要があります。実際の実験で目的の遺伝子型の解剖を行う前に、赤目のハエ、次に白目のハエを用いて練習することをお勧めします。解剖の準備として、麻酔をかけた目的のショウジョウバエを、冷却したメタルパッド上または氷上のペトリ皿に置きます。あるいは、二酸化炭素を放出するフライパッドを使用してください。次に、解剖皿の中央に少量のPTNを滴下し、PTNの気泡を作ります。次に、実体顕微鏡下で、均一な照明を用いて視野をPTN気泡で満たします。その後、ハエの腹側が上になるように操作し、腹部を持って1匹ずつPTN内へ移します。個体をPTNに完全に浸し、解剖の全工程をPTNに浸した状態で実施します。2本目のピンセットで口吻（こうふん）を掴み、頭部を体から引き離します。時折、口吻だけが取れて頭部が体に付着したままになることがあります。その場合は、片方の網膜の内側端を掴み、外側に向かって力を加えて頭部を取り除いてください。腹部と胸部を取り除きます。この工程では、頭部をPTN内に保持しておくことが極めて重要です。中枢脳からVNCへの接続については、この方法では解析できないことが明らかです。次に、クチクラにある中央の穴の縁で左視網膜の内側端を掴み、ピンセットをゆっくりと互いに正反対方向に引きます。この際、白い紐状の気管に覆われた不透明な構造物である視葉を破裂させないように注意してください。視網膜が剥離すると、張力がわずかに低下します。脳の損傷を防ぐため、各眼の内側端を掴み、非常にゆっくりとピンセットを広げることが極めて重要です。急いで操作を行うと、脳の形態が変化したり、脳組織を損傷したりする可能性があります。ここに示すように、それぞれのピンセットで角皮を掴み、非常にゆっくりと反対方向に引っ張ってください。正しく行えば、角皮が脳組織から分離し、脳がそのままの状態に保たれます。このステップでは、非常に鋭利なピンセットが必要です。次に、周囲のクチクラを慎重に少しずつ除去します。しつこく付着しているクチクラを除去する際は、残っているVNCを掴んで脳を固定すると、脳を潰すことを防ぐのに役立ちます。最後に、P200ピペットを使用して、解剖した脳を固定および免疫染色のためのPTNで満たしたプレートのウェルに移します。顕微鏡下で、P200ピペットを用いて、同じ遺伝子型の解剖した脳を10～15個、PTNで希釈した4%paraformaldehydeを満たした0.5 milliliterマイクロ遠心チューブに移します。その後、室温で緩やかに揺らしながら、脳を20分間インキュベートします。固定後、脳をチューブの底に沈ませてから、固定液を除去します。次に、1回あたり500 µLのPTNを用いて、素早く2回洗浄を行います。脳がチューブ内で沈降したら、すぐにPTNを交換してください。次に、室温で穏やかに撹拌しながら、PTNを用いて3回の長時間の洗浄を行います。これらの洗浄後、脳をPTN中で4°Cにて一晩保存することができます。最後のPTN洗浄後、脳を0.5 mLのブロッキング液に入れ、室温で穏やかに撹拌しながら、少なくとも30分間インキュベートします。ブロッキング溶液を除去した後、ブロッキング溶液で希釈した一次抗体を加え、4°Cで2日間、穏やかに攪拌しながら脳組織をインキュベートします。5回のPTN洗浄工程を用いて一次抗体を除去し、その後、二次抗体を適用します。これらの抗体を組織とともに、遮光しロッキングしながら室温で3時間インキュベートします。脳を二次抗体溶液でインキュベートした後、PTN洗浄手順を適用します。各洗浄後にサンプルをホイルで覆い、最後に可能な限り緩衝液を取り除いて終了します。次に、蛍光抗退色封入剤を75 µL加え、ピペットチップ内で脳組織と封入剤を一度だけ出し入れして混ぜ合わせます。チューブをアルミホイルで包み4 °Cで数日間保存することも可能ですが、理想的にはそのまま封入操作に移行してください。脳組織を封入するために、ブリッジスライドを作成します。正電荷コートスライドグラスの上に、2枚のベースカバーガラスを約1 cm間隔で配置します。この際、正電荷コート面が上を向いていることを確認してください。次に、マニキュアを用いてカバーガラスをスライドグラスに固定し、次へ進む前にマニキュアを完全に乾燥させます。次に、スライドを実体顕微鏡下に置き、カバーガラスの間のスペースに脳と培地をピペッティングします。脳の視認性を高めるため、照明を適切に調整してください。続いて、脳を吸い込まないように注意しながら、スライド上の余分な封入剤を吸引除去します。次に、余分な封入剤を吸い取ります。これにより、脳をより正確に配置できるようになります。続いて、ピンセットを用いて、触角葉が上を向くように脳を格子状に並べます。次に、脳の上にカバーガラスを載せ、上部のカバーガラスとベースのカバーガラスが接している端をネイルポリッシュで密封します。続いて、中央の空隙に新鮮な封入剤を滴下して充填し、毛細管現象によって封入剤がカバーガラスの下に引き込まれるようにします。空隙が満たされたら、透明なネイルポリッシュを使用して完全に密封します。記述された手法は、キノコ体を含む成体脳内のほぼあらゆる構造の可視化に使用できます。脳のこの領域は、学習と記憶に必要です。キノコ体は、fasciculin 2タンパク質を認識する抗体を用いることで容易に可視化できます。このタンパク質は、α葉およびβ葉、ならびに中央に位置する楕円体で高度に発現しています。この手法により、キノコ体ニューロンの適切な軸索誘導に必要な複数の細胞プロセスが特定されました。これらのプロセスの破綻は、脳の中線領域を横切る不適切な軸索投射やα葉の欠損など、多様な変異表現型を引き起こします。これらの変異表現型は不完全浸透であることが多いため、複数の脳を調べる必要があります。軸索誘導におけるタンパク質の自律的な役割を調べるために、非蛍光の野生型背景において、個々のGFP陽性の変異体または野生型ニューロンの軸索誘導決定を可視化するMarkham法を用いることも可能です。ここで述べる手法により、成体ショウジョウバエ脳のほぼすべての領域を、信頼性と再現性をもって可視化することができます。ここでは、キノコ体ニューロンに焦点を当てました。本プロトコルのテキスト版では、視葉の可視化についても実証しています。他の研究では、同様の手法を用いて、pars intercerebralis、時計ニューロン、触角葉投射ニューロンなど、多くの部位の可視化が行われています。習得すれば、適切に行った場合に各脳を3〜5分で解剖することができます。この手順を行う際は、顕微鏡の近くで腕を固定することが重要です。また、ゆっくりと動作させ、クチクラの小さな破片を一つずつ取り除くことも重要です。速く動かしすぎると、下層の脳組織に不要な損傷を与える可能性があります。また、免疫蛍光法に基づいた顕微鏡実験に解剖した脳を使用することに加え、脳組織をさらなる追加実験に利用することも可能です。

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Developmental Biology

発生生物学

この記事では、三齢ショウジョウバエの幼虫から中枢神経系を解明する方法を示します。...

キイロショウジョウバエの幼虫中枢神経系の解剖

このプロトコルは、次の3つについて説明します...

開発と大人の準備ショウジョウバエ</emライブイメージングのための>脳と網膜

幼虫、蛹および成人の解剖と免疫組織化学<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;網膜

このビデオでは、成虫のハエの無傷の脳をブリッジスライドの下に埋込む方法を説明し、蛍光顕微鏡法のために免疫染色された脳に対して行われるプロトコールを示しています。...

成虫ショウジョウバエの脳のマウント:共焦点イメージング用のスライドを準備する方法

このビデオでは、成体のショウジョウバエの脳を解剖し、分離する方法を説明しています。これは、キューティクル、目、気管組織によって隠されてしまう臓器を視覚化するために必要な手順です。この例のプロトコールは、ショウジョウバエの神経生物学における免疫染色およびイメージング法に使用できる高品質の調製物をもたらす詳細なデモンストレーションを示しています。...

ショウジョウバエ成人の脳解剖:ハエの神経生物学の方法

このビデオは、突然変異したショウジョウバエの脳のキノコ体の表現型欠損を視覚化するための詳細な免疫染色プロトコルを示しています。このプロトコルには、キノコ体の適切な形態学的および機能的発達を促進する軸索誘導に関与するタンパク質であるFas2に対する抗体を使用することが含まれます。...

免疫染色によるショウジョウバエ脳のキノコ体ニューロンの可視化

ショウジョウバエの成体構造は、虚数円盤と呼ばれる袋のような構造に由来します。これらのディスクの解析により、組織決定、コンパートメント境界の確立、細胞増殖、細胞運命の仕様、平面細胞の極性など、多くの発生過程に関する洞察が得られます。このプロトコールは、光/蛍光顕微鏡用の架空ディスクを調製するために使用されます。...

解剖や成虫の免疫染色からキイロショウジョウバエ

大人ショウジョウバエの脳は神経回路、高次脳機能、および複雑な疾患を研究するための貴重なシステムです。小さなハエの頭から全脳組織を分析するための効率的な方法は、脳ベースの研究を促進します。ここでは、よく保存された形態を有する成人の脳の簡単な、ワンステップ解剖プロトコルを記述します。...

大人のホールマウントの準備のためのシンプルなワンステップ解剖プロトコル<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;ブレインズ

ここでは、ショウジョウバエメラノガスターで3つの単純な傷害誘発軸索変性(軸索死)アッセイを行い、切断された軸索とそのシナプスの形態学的および機能的保存を評価するプロトコルを提供する。...

ショウジョウバエメラノガスターにおける軸索死における軸索とそのシナプスの形態学的および機能的評価

このプロトコルは、イメージングのために幼虫および成虫の ショウジョウバエ...

視葉可視化のためのショ ウジョウバエ の幼虫および成虫の脳の解剖、免疫組織化学、およびマウント

この研究では、斬首、固定、凍結切片、蛍光染色、免疫染色、およびイメージングを含む組織処理の簡略化されたプロトコルを提示します。これらは共焦点および多光子イメージングに拡張できます。この方法は、複雑な解剖に匹敵する有効性を維持し、高度な運動能力の必要性を回避します。定量的な画像分析は、広範な調査の可能性を提供します。...

脳蛍光染色および免疫染色を強化するための ショウジョウバエ 頭部の直接凍結切片

学ぶ成人ショウジョウバエ脳の解剖と免疫蛍光染色法。きのこ体と光受容器ニューロンの形態を可視化し、神経発生とシグナル伝達経路の研究に応用します。この技術は神経科学の発展に貢献します。

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

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