郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン
November 6th, 2017
このプロトコルは、郭清と大人のショウジョウバエの染色について説明します脳の組織。具体的には、このプロトコルでは、神経の開発の多くの側面の基礎となる原則を明らかに正確に使用することができます例の神経細胞サブセットとしてショウジョウバエのきのこ体と光受容ニューロンの使用を強調表示します。
このショウジョウバエの脳解剖プロトコルの全体的な目標は、免疫蛍光法、GFPタグ付きタンパク質局在化、ex-vivo培養実験など、幅広いアプリケーションで使用できる成虫のハエから無傷の脳を得ることです。この方法は、特定のタンパク質やシグナル伝達経路の役割、脳の発達におけるニューロンの接続パターンの確立など、発生生物学や神経科学の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、一度習得すると、成人の脳の特定の領域の形態学的欠陥を免疫学的に特定するための迅速かつ効果的な方法を提供することです。
フライヘッドから外骨格を取り除くには多大な注意と練習が必要なため、この手順を学ぶのは難しい場合があります。あなたの動きはゆっくりと慎重に行う必要があり、ディセクタの腕は安定を保つためにしっかりと支えられなければなりません。実際の実験のために関心のある遺伝子型を実際に分析する前に、赤目のハエ、次に白目のハエで練習することをお勧めします。
解剖の準備をするには、麻酔をかけた目的のハエを冷たい金属パッドの上に置くか、氷の上に座っているシャーレに置きます。または、二酸化炭素を排出するフライパッドを使用します。次に、解剖皿の中央にPTNを少量入れて、PTNの泡を作ります。
次に、実体顕微鏡下で、均一な照明下で視野をPTNバブルで満たします。次に、ハエが腹を上にするように操作し、腹部からPTNにハエを移します。動物をPTNに完全に浸し、PTNに沈めた解剖全体を行います。
2対目の鉗子で、吻をつかみ、頭を体から引き抜きます。時折、テングは取り除かれますが、頭は体に取り付けられたままになります。これが発生した場合は、片方の網膜の内側の端をつかみ、横方向の力を加えて頭を取り除きます。
腹部と胸部を捨てます。このステップでは、ヘッドをPTNに保つことが重要です。中枢脳からVNCへの接続は、この方法では明らかに分析できません。
次に、キューティクルの中央の穴の端にある左網膜の内側の端をつかみ、鉗子を互いに直接引き離してゆっくりと引き離し、白い糸状の気管で覆われた不透明な構造である視葉の裂け目を防ぎます。網膜が解離すると、緊張がわずかに減少します。脳が裂けるのを防ぐためには、各目の内側の端をつかみ、鉗子を非常にゆっくりと引き離すことが非常に重要です。
動きが速すぎると、脳の形態が変わったり、脳組織が損傷したりする可能性があります。ここに示すように、鉗子の各ペアでキューティクルをつかみ、非常にゆっくりと反対方向に引っ張ります。正しく行われれば、キューティクルは脳組織から分離し、脳は無傷のままになります。
このステップには、非常に鋭い鉗子が必要です。次に、周囲のキューティクルを一つずつ丁寧に取り除いていきます。頑固にくっついているキューティクルを取り除きながら、脳が潰れないように残ったVNCを掴むことで脳を固定するのを助けることができます。
最後に、P200ピペットを使用して、解剖した脳をPTNで満たされたプレートのウェルに移し、固定と免疫染色を行います。顕微鏡下で、P200ピペットを使用して、同じ遺伝子型の10〜15個の解剖された脳を、PTNで希釈した4%パラホルムアルデヒドで満たされた0.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。その後、室温でゆっくりと揺さぶりながら脳を20分間インキュベートします。
固定後、脳がチューブの底に落ち着くのを待ってから、固定液を取り除きます。次に、1回の洗濯で500マイクロリットルのPTNで2回のクイックウォッシュを行います。脳がチューブに落ち着いたらすぐにPTNを交換します。
次に、室温で穏やかに攪拌しながらPTNで3回の長時間の洗浄を行います。これらの洗浄後、脳はPTNで摂氏4度で一晩保存される場合があります。最後のPTN洗浄液を取り除いた後、脳を0.5ミリリットルのブロッキング溶液に室温で少なくとも30分間、穏やかに攪拌しながらインキュベートします。
ブロッキング溶液を除去した後、ブロッキング溶液で希釈した一次抗体を添加し、脳を4°Cで2日間、穏やかに攪拌しながらインキュベートします。5回洗浄PTN洗浄レジメンを使用して一次抗体を除去します。そして、二次抗体を塗布します。
これらの抗体を室温で3時間組織とインキュベートし、ロッキングで光から遮蔽します。二次抗体溶液で脳をインキュベートした後、PTN洗浄レジメンを適用します。洗浄のたびにサンプルをホイルで覆い、できるだけ多くの緩衝液を除去して仕上げます。
次に、75マイクロリットルの蛍光色退色防止封入剤を追加し、ブレインと培地をピペットチップに一度だけ出し入れします。その後、チューブをホイルで包み、摂氏4度で数日間保管することができますが、理想的には、直接取り付けを進めます。頭脳を取り付けるには、ブリッジスライドを作成します。
2つのベースカバーを約1cm離して、正に帯電したスライド上に配置します。正に帯電した面が上を向いていることを確認してください。次に、カバースリップをマニキュアでスライドに接着し、ポリッシュを完全に乾かしてから続行します。
次に、スライドを実体顕微鏡の下に置き、カバースリップの間のスペースに脳と培地をピペットで入れます。脳の視覚化を向上させるために、照明を必ず調整してください。次に、スライドから余分な封入剤を吸引し、脳にならないように注意します。
その後、残った余分な封入剤を吸い取ります。これにより、脳をより正確に配置できるようになります。次に、鉗子を使用して、脳をグリッドパターンに向け、触角葉を上に向けています。
次に、カバースリップを脳の上に置き、マニキュアを使用して、ベースカバースリップに取り付けられているトップカバースリップの端をシールします。次に、センターキャビティに新しい封入剤を滴下してロードし、毛細管現象によってメディアをカバースリップの下に引き込むことができます。キャビティが満たされたら、透明なマニキュアを使用して完全に密封します。
記載された方法は、キノコ体を含む成体脳内のほとんど全ての構造を視覚化するために用いることができる。脳のこの領域は、学習と記憶に必要です。キノコの体は、ファシクリン2タンパク質を認識する抗体を使用して簡単に視覚化できます。
このタンパク質は、アルファローブとベータローブ、および中央に位置する楕円体に高度に発現しています。この技術により、キノコ体ニューロンの適切な軸索誘導に必要な複数の細胞プロセスの同定が可能になりました。これらのプロセスの混乱は、脳の正中線領域を横切る不適切な軸索の投影やアルファ葉の欠落など、さまざまな変異表現型を引き起こします。
これらの突然変異表現型はしばしば不完全浸透性であるため、複数の脳の検査が必要です。軸索経路探索におけるタンパク質の自律的な役割を調べるために、マーカム法を使用して、非蛍光野生型バックグラウンドの個々のGFP陽性変異体または野生型ニューロンの軸索誘導決定を視覚化することもできます。ここで説明する方法は、成体のショウジョウバエの脳の仮想領域の信頼性と再現性のある視覚化を可能にする。
ここでは、キノコ体のニューロンに着目しました。このプロトコルのテキストバージョンでは、視ローブの視覚化も示しています。他の研究では、同様の手法を使用して、大脳間部、時計ニューロン、触角葉投影ニューロンなどを視覚化しています。
習得すると、適切に実行されれば、各脳を3〜5分で解剖できます。この手順を試みるときは、顕微鏡の近くで腕を安定させることを忘れないでください。また、ゆっくりと移動し、キューティクルの小さな片を一度に1つずつ取り除くことも重要です。
動きが速すぎると、下にある脳組織に望ましくない損傷を与える可能性があります。解剖した脳を免疫蛍光顕微鏡法による実験に使用するだけでなく、脳組織を他の実験にも使用することができます。
概要
このプロトコルは、成体のDrosophila melanogasterの脳組織の解剖と免疫染色を記述し、特にキノコ体と光受容ニューロンに焦点を当てています。神経発生の原理を明らかにすることを目的としています。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 発生生物学
- 免疫染色技術
背景
- Drosophilaの脳の解剖は、神経連結性を研究する上で重要です。
- 免疫蛍光はタンパク質の局在化とシグナル伝達経路を明らかにすることができます。
- 脳の形態を理解することは発生生物学にとって不可欠です。
- 技術には、脳組織を傷つけないようにするための精密さが必要です。
研究目的
- 成体のDrosophila脳を解剖するための信頼できる方法を提供すること。
- 神経発生と連結性の研究を容易にすること。
- 形態学的欠陥の免疫学的同定を可能にすること。
使用方法
- PTN溶液に浸した脳の解剖。
- 鉗子を使用して昆虫の外骨格から脳組織を慎重に分離すること。
- 解剖した脳の固定と免疫染色。
- 顕微鏡下での観察のために脳を載せること。
主要な結果
- 成体のDrosophila脳の無傷の解剖に成功。
- 神経可視化のための効果的な免疫染色プロトコル。
- 神経の形態と連結パターンに関する洞察。
- 様々な実験応用におけるこの方法の有用性の実証。
結論
- このプロトコルは神経科学研究のための貴重なリソースを提供します。
- 解剖技術の習得は正確な結果を得るために不可欠です。
- 将来の研究ではこれらの方法を基に神経機能を探求することができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-fidelity visualization of neuronal subpopulations in adult Drosophila brains, supporting mechanistic studies of neurodevelopmental pathways conserved in mammals. By providing a reliable method to assess axonal guidance and neuronal morphology, it aids in target validation and phenotypic screening for neurotherapeutic discovery. The approach contributes to predictive confidence in preclinical models by linking genetic perturbations to quantifiable structural phenotypes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through visualization of protein localization in defined neuronal circuits.
- Operational Value: Supports biological de-risking by revealing morphological consequences of genetic or pharmacological perturbations.
- Predictive Value: Facilitates assessment of target engagement via immunostaining of pathway-specific markers in mushroom body and photoreceptor neurons.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible brain preparations suitable for high-content imaging and quantitative phenotypic analysis.
- Scalability: Allows processing of multiple genotypes in parallel, supporting screening campaigns for modifiers of neuronal defects.
- Quantitative Output: Enables scoring of axonal guidance defects, providing measurable endpoints for compound or genotype comparison.
Translational & Preclinical Research
- Disease Modeling: Supports investigation of human neurodevelopmental disease mechanisms using Drosophila as a phenotypic discovery system.
- Mechanistic De-risking: Clarifies roles of conserved signaling pathways in axon pathfinding and synaptic connectivity.
- Translational Continuity: Enables cross-species validation of targets identified in fly models through conserved neuroanatomical readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, bridging genetic screening to phenotypic validation and informing lead identification through mechanistic insight into neuronal development pathways.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling visualization of protein expression and localization in specific neuronal populations.
- Screening: Produces assay-ready tissue samples with consistent morphology for immunofluorescence-based readouts.
- Analytics: Generates quantitative imaging data on axonal projection patterns and structural defects for comparative analysis.
- Translational Research: Connects findings to mammalian neurodevelopment through conserved neuronal architecture and protein function.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for neurobiological assessment across multiple projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in neuronal phenotype interpretation.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility in neuroanatomical assessments across laboratories and studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, mechanism-based phenotypic data on neuronal targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on phenotypic severity and penetrance in validated neural circuits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery and fluorescence microscopy for reliable brain dissection and staining.
- Dependent on access to stereo microscopes, fine forceps, and antibody-compatible reagents for fixation and imaging.
- Necessitates standardization of dissection timing, fixation duration, and washing protocols to ensure inter-experiment consistency.
- Adaptation across neuronal subtypes may require optimization of antibody penetration and blocking conditions.
- Practical limitations include tissue fragility and the need for skilled handling to avoid mechanical artifacts during preparation.
