流れの Cytometry ベースの医薬品スクリーニング システム神経膠芽腫幹細胞の細胞分化を促進する小さい分子の同定に関する研究

本手順の全体的な目的は、膠芽腫幹細胞のアストログリア分化を促進する薬剤を、低分子化合物ライブラリーからスクリーニングすることです。この手法は、膠芽腫幹細胞を未分化状態で維持するために必要なシグナル伝達経路は何かという、がん幹細胞分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。本手法を適切に実行することで、膠芽腫幹細胞の分化を促進する低分子化合物を容易に特定することが可能になります。

この技術の意義は、膠芽腫幹細胞の割合を減少させることで再発の可能性を下げられるため、エーラーズ・ダンロス膠芽腫の治療へと展開される可能性があります。また、この手法は、別のレポーター構築物を用いることで、他の細胞系統への分化誘導の設定にも適用可能です。本報告は、神経膠腫幹細胞に分化を強制する薬剤をスクリーニングするためのハイスループットアプローチを確立した初めての事例です。

患者由来のがん細胞を用いてレンチウイルス粒子を扱う操作は、極めて危険を伴う可能性があります。したがって、血液媒介性病原体を取り扱うための標準的な手順に常に従ってください。まず、6ウェルプレートの各ウェルに、2 mLの完全神経幹細胞増殖培地を用いて、100万個の膠芽腫幹細胞（GSC）を播種します。

次に、感染多重度（MOI）を5として、レンチウイルスレポーターを用いて細胞を導入します。細胞とウイルスの混合液に、最終濃度が8 µg/mLとなるようにポリブレンを2 µL加え、37 °C、5% CO2の条件下で一晩インキュベートします。インキュベーション後、未結合のウイルスを除去するために増殖培地を交換します。

細胞を360 ×gで5分間遠心分離します。次に、培地を注意深く吸引し、細胞を6ウェルプレートに再播種します。その後、細胞をさらに24時間インキュベートします。

全培養液から0.5 millilitersを回収します。室温で360 times Gで5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。細胞を0.5 millilitersの新鮮な神経幹細胞増殖培地で再懸濁します。

プレートをインキュベーターに戻し、少なくとも72時間かけて増殖させます。解離試薬を200 µL加え、37 °Cに設定したウォーターバスで5分間インキュベートします。ピペッティングで穏やかに上下に混ぜ、細胞を解離させます。

解離した細胞にHBSSを800 µL加え、細胞の接着や凝集を最小限に抑えます。次に、各細胞懸濁液200 µLを96ウェルプレートの各ウェルに分注します。フローサイトメトリーを用いて、緑色蛍光タンパク質を発現している細胞の割合を測定します。

各データ収集において、生存細胞を少なくとも10,000個記録してください。すべてのフローサイトメトリー解析では、親株の非導入細胞またはベクター導入済みの非蛍光細胞を用いて、ベースライン蛍光を設定してください。個々のサブクローンの選択および増殖を行うには、96ウェルプレートの各ウェルに、神経幹細胞培地 100 µLを用いて、0.7 cells/well の密度で細胞を播種してください。

これらのクローンを11日間培養します。直径100 µm以上のニューロスフィアを確認してください。ニューロスフィアが自己複製能を持つ膠芽腫幹細胞に由来するかどうかを遡及的に判断するために、以前にこのカットオフサイズを決定しています。

異なる神経膠腫（グリオブラストーマ）細胞モデルを使用する場合、このカットオフサイズを最適化する必要があるかもしれません。FITCフィルターを備えた蛍光顕微鏡下で細胞を観察し、細胞の約1%から5%がGFP陽性である単一のニューロスフェアが含まれるウェルに印を付けます。マーキング後、フローサイトメトリー解析に十分な細胞数が得られるまで、個々のクローンを拡大培養します。

レポータークローンにGFP陽性細胞が1%から5%含まれていると想定し、各クローンから0.5 millilitersを回収し、GFP陽性細胞の正確な割合を決定するために同量の非形質導入コントロール細胞を合わせて回収します。室温で360 times Gにて5分間遠心分離して細胞をペレット化した後、上清を吸引除去します。各ペレットに200 microlitersの解離試薬を加え、37 degrees Celsiusに設定したウォーターバスでチューブをインキュベートします。

インキュベーション後、細胞を20〜30回ほどピペッティングして、単一細胞懸濁液にします。次に、細胞の付着や凝集を最小限に抑えるため、HBSSを800 µL加えます。その後、各細胞懸濁液を200 µLずつ、96ウェルプレートの各ウェルに分注します。

最後に、フローサイトメトリーを行い、各測定で少なくとも10,000個の生存細胞を記録します。コロニー形成能を評価するために、細胞を20〜30回ほどトリチュレーションして、分化レポーターサブクローンの単一細胞懸濁液を調製します。次に、これらの細胞を、96ウェルプレートに1ウェルあたり約5〜500個の密度で、100 µLの完全神経幹細胞増殖培地を用いて播種します。

これらの細胞を9〜11日間培養します。光学顕微鏡下でニューロスフィアを確認してください。少なくとも1つの大きな単一ニューロスフィアが含まれているウェルを陽性と判定します。

親細胞である非導入細胞およびGFP陽性のレンチウイルス導入細胞をコントロールとして、解析した総ウェル数と陽性細胞数をELDAオンラインインターフェースに入力します。スクリーニングを開始するには、96ウェルプレートの各ウェルに、完全神経幹細胞増殖培地99 µLで懸濁した細胞5000個を播種します。その後、12チャンネルピペッターを用いて、最終濃度2 µMに希釈したライブラリー化合物またはDMSOコントロールを細胞に添加します。

細胞を72時間インキュベートします。次に、12チャンネルピペッターを用いて各ウェルに細胞解離試薬を150 microliters添加し、37 degrees Celsiusで20分間インキュベートします。その後、12チャンネルピペッターを用いて各ウェルの細胞を20から30回ほど緩やかにピペッティングし、単一細胞懸濁液になるまで分散させます。

次に、フローサイトメトリーを行い、GFAP:GFPレポーターを発現している細胞の割合を決定します。まず、前方散乱光（FSC）および側方散乱光（SSC）から細胞サイズと生存率を判定し、生存細胞集団をゲートします。その後、生存細胞集団の中からGFP陽性細胞を判定します。

コントロールと比較してGFP陽性細胞の割合が標準偏差の3倍以上増加したものをポジティブヒットと見なしますが、これはユーザーの stringent（厳格さ）の好みに合わせて調整可能です。GFAP:GFPを低レベルおよび高レベルで発現しているHSR-GBM1 GSCサブクローンの代表的な画像を示します。患者由来ニューロスフィア株において、GFAP:GFP発現陽性のサブクローンをフローサイトメトリーにより選択しました。

ここでは、GFAP:GFP低値はクローン内のGFP陽性細胞が5%未満であることを示し、GFAP:GFP高値はクローン内のGFP陽性細胞が75%超であることを示します。これらの結果は、ELDAによって判定されたGFAP低値サブクローンのin vitro自己複製能が、GFAP高値のサブクローンよりも高いことを示しています。したがって、GHサブクローンはGLサブクローンよりも分化が進んでいると考えられます。

最後に、GSCにおいてアストログリア分化を誘導可能な薬剤を特定するため、薬剤ライブラリのスクリーニングを行いました。その結果、GFAP:GFPリポーターを発現する細胞の割合を有意に増加させる12種類の薬剤が見出されました。この手法に習熟すれば、適切に実施することで数週間で完了させることができます。

本手順に続き、alamarBlueアッセイ、半凝固剤培地を用いたコロニー形成アッセイ、側腹部または頭蓋内へのゼノグラフト注入などの他の手法を実施することで、in vitroでの細胞増殖およびコロニー形成能に対する選択的薬剤の影響や、in vivoでの腫瘍形成能といった追加の疑問を検討することが可能です。このビデオを視聴することで、膠芽腫幹細胞においてアストログリア分化を誘導できる化合物を特定する方法について、十分な理解が得られるはずです。