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著者は、アルニム Jenett、Aljoscha ナーンサイ、アドバイスのルービン研究室の他のメンバーと未発表試薬および共焦点画像を生成するため Janelia 飛ぶ光プロジェクト チームの共有をありがちましょう。著者も原稿のコメントをガリア研究室のメンバーに感謝します。

1。 多色 FlpOut (MCFO) 実験用のハエの準備 注:、MCFO 技術と呼ばれる Flp を介した停止カセット切除 (FlpOut) の修正バージョンを指します。MCFO ハエの遺伝子を運ぶ熱ショック プロモーター (hsp)-Flp リコンビナーゼや UA の下で別の記者を制御します。各レポーターから成っているエピトープ タグを 10 枚でにおける (myr) スーパー フォルダー緑色蛍光蛋白質 (sfGFP) の共通バックボーン (e.g。、HA、旗または V5) が挿入されています。結果の非蛍光性タンパク質は、名前付き &#34; スパゲッティ モンスター受けた &#34; (smGFPs) 14 と異なるエピトープ タグに対して特定の抗体を使用して検出することができます。
<ol><li>クロス MCFO カセットと hsp Flp (hsp Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG、10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) (材料表参照) 適切なグリア GAL4 ドライバー行へ飛ぶ.
	<ol><li>Hsp が 25 ° C でアクティブになって、いくつかの細胞が非特異的ラベル付けにつながる再結合を受ける可能性がありますは、水漏れしたため、システムを避けるために 18 ° C の交点を設定します。F1 世代を取得する 18 の ° C で約 20 日間を待ちます。熱後 (手順 2 を参照) に衝撃を与える、25 ° C ( 図 3) でハエを維持します</li>。
	</ol></li></ol> 2。衝撃を熱 注: 挿入部位によって hsp Flp の効率は異なります; したがって、最適な熱衝撃時間が最適化するようにしました。このプロトコルでは、hsp Flp が X 染色体に挿入された MCFO フライのストックが使われています (材料の表 を参照してください).
<ol><li>転送の子孫ステップ 1.1 十字架 (F1 世代ハエ、3-4 日古い) 食品と熱を含む新しいバイアルには、37 の ° C の水浴中で彼らを驚かせた 。
	注: 若いハエ (1-2 日古い)、熱衝撃に非常に敏感。1 または 2 の治療による死亡率を減らすためにヒート ショックを実行する前より多くの日を待ちます。F1 世代のいくつかは熱ショックなしのコントロールとして飛ぶ使用します</li>。
	<li>熱ショック時のストレスによる死亡率を減少させるために食物と一緒に普通のバイアルにハエを維持します。女性と男性、別のバイアル</li>。
	<li>均一熱ショックのように水に全体のバイアルを浸すことを確認してください。適切な出発点として多く GAL4 ドライバー行とグリア細胞の疎ラベルに 5-8 分ショックを使用します。ショック期間に各ドライバーおよび実験 (短いまたは長い熱衝撃時間が必要になる場合があります) の最適化しなければなりません</li>。
	<li>熱衝撃から回復するハエを許可するために数分間ベンチに水平にバイアルを置く熱ショック後 。
	注: バイアルを変更する必要はありません</li>。
	<li>25 ° C でハエを維持し、解剖 (手順 3 と 4 を参照してください) に最適な記者式の熱ショック後の日が 2 以上</li>。
</ol> 3。解剖準備およびソリューション <ol><li>、解剖の日は、20% パラホルムアルデヒド (PFA) 2 %pfa 解を得るための 20 μ L で S2 細胞培養液 180 μ L を混合することによって 200 μ L の PCR チューブに新鮮な固定液を準備します。前に、解剖中に氷の上固定液を維持します 。
	注意: PFA は毒性があり注意して処理する必要があります 。
	注: を混ぜて 2% 溶液の代わりに 4 %pfa ソリューションを準備する 200 μ L の PCR チューブで 20% パラホルムアルデヒド (PFA) の 40 μ L 160 μ L の S2 細胞培養培地</li>。
	<li>最適な染色結果最大管あたり 8-10 脳の遺伝子ごとの 1 つの PCR チューブを使用します</li>。
	<li>ソリューションを洗う大人の脳の準備: 0.5% 0.5% ウシ血清アルブミン PBS でトリトン X-100 。
	注: 染色液 1% トリトン X-100 を必要ことがあります。トリトン X-100 の高濃度増加抗体の組織への浸透と、深い組織 (大人の ショウジョウバエ 脳におけるシナプス領域 など) の内側にある染色領域する必要がある</li>。
	<li>ブロック ソリューションを準備: 3% ヤギ血清, 3% 通常ロバ血清と 0.5 %pbs でトリトン X-100</li>。
	<li>洗浄ソリューションとブロッキング液成人の脳を数週間の 4 ° C で保存ことができます</li>。
	<li>氷の上の深いうつ病井戸ガラス板を置くし、フィル各次のソリューションとも: pbs と S2 細胞培養培地使用の 70% エタノール 1 つ</li>。
</ol> 4。大人の脳解剖 <ol><li>3 cm の皿を解剖顕微鏡のステージ上の位置し、冷たい S2 細胞培養培地でそれを埋めます。解剖手順中に組織が健康な状態であることを確認するこの中にすべての解剖を実施します 。
	注: ブラック シリコーン (イメージ) で良い背景のコントラストを提供する複数のミリメートルと並んで解剖皿を使用し、解剖時に鉗子を保持します</li>。
	<li>CO 2 と目的遺伝子型のハエを麻酔します</li>。
	<li>鉗子、翼で飛ぶをつかむ 30 の冷たい 70% エタノールで洗うと s 追加 30 冷 PBS とし、s.</li>
	<li>S2 細胞培養液で満たされている井戸の深い不況に、フライを転送します</li>。
	<li>同じ遺伝子型のすべてのハエについて同じ手順を繰り返します、解剖、組織を保持するまで冷たい S2 細胞培養培地でそれらを維持します 。
	注: 麻酔だけで S2 セル培地の培養時間が長く約 30 分の時間内に解剖することができますハエの数はティッシュを傷つけることがあります</li>。
	<li>鉗子でハエをつかむし、顕微鏡下で S2 細胞培養培地でその場が水没します</li>。
	<li>は、体の残りの部分から頭をデタッチします。体を破棄し、S2 細胞培養液中に浸漬頭を維持します。解離の全体の持続期間のための鉗子で頭を保持するために非常に重要です。組織を損傷することがなく取得することは困難であろう頭にフロートする起動する場合</li>。
	<li>は、すべての回で、少なくとも 1 つの鉗子で頭を押しながら 1 つ目を引いて、郭清を開始します。鉗子の先端は避けるために網膜のすぐ下の損傷の下に組織されていることを確認します。もう片方の目を抜くし、脳が表示されるまでにキューティクルを削除を開始します</li>。
	<li>は、すべての気管組織と脳の周りの表皮組織がきれいに表示されますまでを削除します。最適な染色結果を得る脳の周りのすべての気管組織を削除することを確認します。組織は固定し、染色する準備が整いました</li>。
	<li>タイム固定ステップするために PFA ソリューションに転送する前に冷たい S2 解剖脳細胞の培維持します</li>。
</ol> 5。大人の脳の染色 < ol> <li>は、室温 (RT) で PFA ソリューションに P10 ピペットと分離脳を転送します。組織の損傷を避けるためには、鉗子を郭清後脳を転送するため使用しないでください。200 μ L PCR チューブ、nutator ですべての手順を実行します</li>。
	<li>の手順をすべて P200 ピペットと古いソリューションを破棄する前にチューブの底に解決する脳を可能。組織を吸引せず、上澄みを削除してください。露光量から組織を保護します</li>。
	<li>修正 2% の 200 μ L で脳 S2 細胞培養培地の 1 時間または 4% PFA PFA 30 分。再現性を高めるためにサンプル間同じ固定にしてください</li>。
	<li>3 (またはそれ以上) を洗う洗浄ソリューションでは、成人の脳の 200 μ L で 15 分の後は、30 分間ソリューションをブロックの 200 μ L で組織をブロックします。解決を妨げるの長い培養時間可能です</li>。
	<li>200 μ L の総ボリュームで大人洗脳ソリューションで希釈した一次抗体と脳が 4 ° C で一晩加温 。
	注: インキュベーション時間は、使用される抗体の種類によって異なる場合があります。長い孵化必要があります。
	<ol><li>3 MCFO マーカーのラベルは、アンチの頭脳を孵化させなさい-HA (1: 500)、反フラグ (DYKDDDDK epitope) (1: 100) と反 V5 一次抗体</li>。
		<li>プライマリ直接された抗体は通常プライマリ + セカンダリの組み合わせの代わりにされる可能性があります (e.g。、反-V5:DyLight 549 (レバレッジ))。この場合、二次抗体と直接標識抗体を処理します 。
		注: 各遺伝子型の染色の特異性を確認するためのコントロールとして、いくつかの脳をしてください。一次抗体の孵化をスキップし、次の手順に進みます</li>。
	</ol></li> <li>洗浄ソリューション (ステップ 3.3) 成人の脳の 200 μ L で 3 回 1 h の組織を洗うし、洗濯ソリューション一晩 4 で大人の脳で希釈した二次蛍光体の抱合体/プライマリ直接共役抗体とそれらを孵化° C、200 μ L の総ボリュームで常温では、4 h 注: 適切な抗体の例: AlexaFluor 488 (1: 250) 反-V5:DyLight 549 (レバレッジ) と DyLight (1: 100) 647-標識抗体</li>。
	<li>の 1 h アダルト洗脳で 200 μ L の PBS 一晩で 4 ° C または RT で 1-2 時間の最終的な洗浄に続いて、ソリューションの 200 μ L で 3 回脳を洗う; PBS の最終的な洗浄ステップ トリトン X-100 の痕跡を削除し、必要があります。最適な染色結果。ガラス coverslips に耐フェード エージェントでメディアをマウントで脳をマウントします</li>。
</ol> 6。脳のイメージング用マウント はさみを使用して適切なサイズに <ol><li>トリム イメージングのスペーサー。高分解能顕微鏡の 2 つのガラス coverslips 間標本とイメージングのスペーサーをサンドイッチします 。
	注: イメージング スペーサーは薄い (0.12 mm 厚) 供試体圧縮なしの実装可能皮およびガラス coverslips または顕微鏡のスライドする棒を接着スペーサー</li>。
	<li>使用鉗子は 1 つの表面から接着性ライナーを取り外してガラス カバーガラス (22 mm × 60 mm) の表面にスペーサー、ダウン、接着面を適用します。メディアをマウントの 10 μ L を新しいガラス基板に適用します</li>。
	<li>で、P10 のピペットは、メディアをマウントの横にある、coverslip に 200 μ L 管から脳を転送します。一緒に組織ソリューションで脳を維持するためにいくつかの PBS を転送します</li>。
	<li>で、P10 のピペットは、PBS の量を制限しようとすると、メディアをマウントのドロップに PBS から脳を移動します。イメージングのスペーサーと coverslip でメディアをマウントで標本を転送します。見本をカバーするのに十分なメディアをマウントを使用します</li>。
	<li>は、スペーサーの上から他の接着性ライナーを取り外して、標本上にガラス基板を追加します。鉗子の先端でシール接着領域の上穏やかな圧力を適用します。すぐにマウントされている組織を画像または後で分析のための-20 ° C でスライドを保存します</li>。
</ol> 7。画像取得 <ol><li>40 X を用いた共焦点顕微鏡共焦点蛍光画像の取得スタック (NA = 1.2、水浸漬) 目的または 63 X (NA = 1.4、オイルの液浸) 目的 (ピクセル サイズ = 1,024 x 1,024 xy 平面で共焦点の 2 つのセクション間の距離 = 0.5 μ m)。検出器ゲインとない飽和ピクセルとピクセル値は、画像内に存在するように各チャネルのオフセットを調整します。これは情報の損失を回避し、検出器のダイナミック レンジの使用を保証します 。
	注: 3 D イメージングは時間がかかるため、測定値は別の場所で同時に複数のサンプルをスキャンすることによって自動化できます。水浸対物レンズで蒸発を防ぐには、屈折率 n と特別な油浸漬媒体を使用して = 1.33</li>。
	<li>チャネル色相と輝度の調整に変更、最大密度予測の共焦点スタックを処理し、標準的な画像解析ソフトウェアを使用して対照的 (材料の表 を参照してください).</li>
</ol>

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</ol>

作者は、競合または競合する興味を持ちます。

このプロトコルでは、高解像度で興味の組織内の別のセル型の形態を研究する簡単で効率的な方法について説明します。MCFO を用いた異なるエピトープ タグで複数の記者は多色確率ラベル (図 2) の組み合わせで使用されます。Brainbow/Flybow15,16,17などの他のメソッドと同様に、MCFO よりラベル多様化マーカー共発現による細胞間相互作用研究のためのセル境界の視覚化を許可します。たとえば、3 つの記者、7 つの潜在的なマーカーの組み合わせが可能です。以前のラベル付け方法と比較して、MCFO 技術は、細胞密度17をラベリングのより正確かつ簡単コントロールを示しています: 単一細胞ラベリングより困難である場合は、デフォルトのマーカーを明示 Flybow 1.0 ハエFlybow 2.0 ハエより複雑なシステムを作る 2 つの異なる Flp...

グリア細胞、神経系 (NS) の非神経細胞集団はニューロンの静的なフレームワークを提供するために長い間信じられていた、したがって詳細に至りませんでした。ただし、ヒトでは、グリアは NS (~ 90%) のセルの大部分を構成する、アストロ サイト、オリゴデンドロ サイト、ミクログリア、シュワン細胞を含むいくつかの異なるカテゴリに分類されます。ショウジョウバエグリアは、NS で細胞の約 10% を構成します。興味を持って、その形態と機能が脊椎動物1,2で見つけられるそれらに非常に類似します。その形態には、血液脳関門 (BBB) アストロ サイト様細胞、神経鞘、上皮形成が含まれます。
ショウジョウバエ中枢神経系 (CNS) は次の主構造体で構成されています:; 神経細胞の細胞体を含む皮質領域ハーバーのシナプス接続 neuropils接続別 neuropiles; 小規模および大規模な軸索路(図 1) 中枢神経系と感覚器官や筋肉を接続する末梢神経。すべてのこれらの解剖学的構造に関連付けられているグリア細胞が見つかった: 皮質領域、アストロ サイトのようなグリア細胞 (ALG), 脊髄グリア細胞 (EG) 構造の領域、脊髄グリア細胞の皮質グリア (CG) は中央軸索路と周辺機器に関連付けられているも神経 (EGN)、そして最後に、グリア細胞シートのような 2 つ、perineurial グリア (PG) と subperineurial (SPG)、これは一緒に全体の NS (図 2) をカバーする連続した層を形成します。
前の研究は、そのグリアを示されている; NS の開発に重要な役割を果たすインスリン様ペプチドを全身循環に反応して神経細胞の数を監視、ニューロン、グリア-ニューロン乳酸シャトルなどに栄養サポートを提供して貪食3,4で死にかけている神経細胞を排除,5,6成熟した NS でグリア BBB を維持、神経伝達物質を取るとイオンの恒常性を維持、マクロファージできません、BBB に違反し、動物の行動の6と同様、シナプスの活性を調節するので、NS で主要な免疫細胞として機能。,7,8,9,10,11。
グリア細胞のサブタイプが異なるが特殊な機能を実行するかどうか重要な未解決の問題に残る。ただし、成体における特にグリア細胞の体系的なゲノム解析は、その操作に対応する遺伝的ツールの欠如によって妨げられています。ここでは、複雑な細胞間相互作用を研究するセル形状の効率的かつ簡単な評価を可能にする手法を提案します。この手法は、大人のショウジョウバエ脳グリア細胞サブタイプが異なる形態を特徴付けるに適用されていますが、ニューロン12,13 を研究に使用される特定の GAL4 ドライバー、に応じて合わせることができます。、混ざり細胞と原則としていかなる任意の発達段階内の任意組織。

<table><tbody><tr><td>ウォーターバス</td><td>グラント</td><td>GD100</td><td></td></tr><tr><td>PCRチューブ</td><td>サルスタット</td><td>72.737.002</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>デュモン</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>解剖皿 30 mm x 12 mmm</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>70543-30</td><td>ガラス解剖皿</td></tr><tr><td>パイレックス3 窪み ガラススポットプレート</td><td>コーニング</td><td>7223-34</td><td>ガラス解剖プレート</td></tr><tr><td>シルガード ブラック</td><td>シルガード、シグマ・アルドリッチ</td><td>805998</td><td>ホームメイド チャコール</td></tr><tr><td>ExpressFive S2 細胞培養培地</td><td>Invitrogen</td><td>10486-025</td><td></td></tr><tr><td>20% PFA</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>15713</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>ロス</td><td>3051.3</td><td></td></tr><tr><td>正常なヤギ血清</td><td>ジャクソン研究所</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>ノーマルロバ血清</td><td>Jackson Laboratories</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ HAタグ</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>C29F4</td><td>一次抗体、希釈 1:500</td></tr><tr><td>ラット FLAG-tag</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-06712</td><td>一次抗体、希釈 1:100</td></tr><tr><td>マウス V5-tag:DyLight 549</td><td>AdSerotec</td><td>0411</td><td>コンジュゲート抗体、希釈率 1:200</td></tr><tr><td>抗ウサギ AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td>二次抗体、希釈 1:250</td></tr><tr><td>抗ラット DyLight 647</td><td>Jackson Laboratories</td><td>712-605-153</td><td>二次抗体、希釈 1:100</td></tr><tr><td>Vecta Shield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>SlowFate Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S36937</td><td></td></tr><tr><td>Secure Seal Spacer</td><td>Grace Biolabs</td><td></td><td>ご注文の会社にお問い合わせください</td></tr><tr><td>顕微鏡カバーガラス 22 X 60 mm</td><td>マリエンフェルド</td><td>101152</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡カバーガラス 22 x 22 mm</td><td>Roth</td><td>H874</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡、ライカ MZ6</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査顕微鏡 LSM710</td><td>ツァイ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ス イマーソル</td><td>ツァイス</td><td>518 F</td><td>蛍光顕微鏡用浸漬油、ハロゲンフリー</td></tr><tr><td>Immersol</td><td>Zeiss</td><td>W 2010</td><td>水浸対物レンズ用浸漬液、ハロゲンフリー</td></tr><tr><td>R56F03-GAL4 (EG)</td><td>ブルーミントン ストック センター</td><td>39157</td><td>GAL4 ドライバー</td></tr><tr><td>R86E01-GAL4 (ALG)</td><td>ブルーミントン ストック センター</td><td>45914</td><td>GAL4 ドライバー</td></tr><tr><td>hspFlpPestOpt;UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5</td><td>ブルーミントンストックセンター</td><td>64085</td><td>UASレポーター (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)</td></tr><tr><td>フィジー (Image J)</td><td></td><td></td><td>画像解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>Multi Time</td><td>Macro Zeiss</td><td></td><td>自動スキャン用ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

多色 flpout 技術の高分解能単一細胞の形態とショウジョウバエにおけるグリア細胞の細胞間相互作用の研究への応用

Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

セルには、異なる形態と複雑な解剖学的関係が表示されます。細胞彼らの隣人との対話の方法相互作用は細胞のタイプ間または特定の種類の内であっても異なる?彼らは空間のルールの種類が従うか。このような基本的な質問体内への回答は、これまでのところ高解像度 1 つのセルのラベルのためのツールの欠如によって妨げられています。ここでは、多色 FlpOut (MCFO) を用いた単一細胞をターゲットに詳細なプロトコルを提供しています。このメソッドは、3 つ異なるタグ記者 (HA、旗、V5) UA 制御の下で 2 つの FRT サイト (FRT-停止-FRT) に挟まれた転写ターミネーターで静かに保管されているに依存します。熱衝撃パルスは、個々 の細胞における FRT 停止 FRT カセットをランダムに削除する熱衝撃波の Flp リコンビナーゼの発現を誘導する: 式は、GAL4 ドライバーを表すセルでのみ発生します。これは、高解像度で個々 の細胞の形態の可視化を可能にする特定の細胞型の別様に着色されたセルの配列に します。例として、MCFO 技術は大人のショウジョウバエ脳グリア細胞サブタイプが異なる形態を視覚化するための特定のグリア GAL4 ドライバーと組み合わせることができます。

このセクションでは、大人のショウジョウバエ脳における MCFO 技術を使用して得られる結果の例を示しています。メソッドの概略図を図 3に示します。3 異なる膜タグ記者 (myr smGFP HA、myr smGFP フラグ myr smGFP V5) UA コントロールの下で、2 つの FRT サイト (FRT-停止-FRT) に挟まれた転写ターミネーターが黙っていた。熱衝撃パルスは、個々 の細胞における FRT 停止 FRT カセットをランダムに削除する Flp リコンビナーゼの発現を誘導します。これは使用される GAL4 ドライバーで指定された特定のセル型の別様に着色されたセルの配列に します。
全体的に七色が可能。図 4と図 5</st...

細胞は異なる形態を表示し、様々 な彼らの隣人との相互作用を確立します。このプロトコルでは、単一細胞の形態を明らかにする、老舗の Gal4/UA 式システムを使用して、細胞間相互作用を調査する方法について説明します。

多色 FlpOut 技術の高分解能単一細胞の形態とショウジョウバエにおけるグリア細胞の細胞間相互作用の研究への応用

Cells display different morphologies and complex anatomical relationships. How do cells interact with their neighbors? Do the interactions differ between ...

この手法の全体的な目的は、複雑な解剖学的組織における単一細胞の形態を可視化し、それによってショウジョウバエにおける細胞間相互作用の研究を簡略化することです。本手法は、ショウジョウバエを用いて複雑な形態や細胞間相互作用に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法の主な利点は、あらゆる組織およびあらゆる発生段階における単一細胞形態の研究に適応させることができる点にあります。手順の実演は、当研究室の技術者であるAnja Kieserが行います。MCFO法は、標準的なFlpOut法を以下のように変更したものです。熱ショックFLPリコンビナーゼと異なるレポーターは引き続きUAS制御下にありますが、各レポーターは、エピトープタグのコピーが挿入されたミリストイル化superfolder GFPという共通のバックボーンを持っています。得られた非蛍光タンパク質はスパゲッティモンスターGFPと命名され、抗体を用いて同定されます。欠損数に応じて、異なる組み合わせのエピトープが発現します。HSPプロモーターは25°Cでわずかに活性を持つため、完全に不活性となる18°Cで交配を行います。その後、F1世代が得られるまで約20日間待ちます。F1の雌と雄を分けて別々のバイアルに入れます。ヒートショックを行うため、彼らが3〜4日齢になった時に、まず新鮮な餌の入ったバイアルに移します。若いショウジョウバエは、ヒートショックを与えるには繊細すぎることがあります。次に、バイアルを37 °Cの恒温水槽に移します。均一にヒートショックを与えるため、バイアルを深く浸してください。グリア細胞の疎らなラベル化（sparse labeling）を行うには、まず5分から8分間のヒートショックを行い、その後で最適化します。最適なヒートショック時間は、標的細胞を疎らにラベル化する時間であり、その時間は使用する特定のGAL4ドライバーによって異なります。ヒートショック後、バイアルをベンチ上に水平に置き、数分間冷却させます。次に、同じバイアルを用いて、ショウジョウバエを25°Cで維持し始めます。2日後にはレポーターの発現が最適となり、ハエを解剖することができます。準備として、3つのディープデプレッションウェルを氷上に置きます。1つのウェルに70% ethanolを、もう1つにPBSを、さらに1つにS2細胞培養液を満たします。次に、黒色のシリコンを敷いた3 cmの解剖用ディッシュに、冷やしたS2を入れます。組織の健全性を維持するため、すべての解剖操作はS2中で行います。ここで、二酸化炭素を用いてハエを麻酔します。次に、ピンセットまたは羽ペンを用いて、ハエを冷えた70% ethanolに約30秒間浸し、続いて冷えたPBSに約30秒間浸した後、冷えたS2に移します。このようにして、解剖するすべてのハエを洗浄します。通常、1つの遺伝子型につき最大10匹のハエで十分です。その後、30分以内にすべての脳を摘出します。まず、頭部を身体から切り離し、身体を廃棄します。解剖の間はずっと、空いている方の手で頭部を保持し続けてください。そうしないと、再び固定することが非常に困難になります。次に、網膜の直下の組織のみを掴んで、片方の眼球を抽出します。次に、もう一方の目を外して、脳と周囲の組織を露出させます。続いて、脳組織がきれいに見えるまで、脳周囲のすべての気管組織と残っている角皮を取り除きます。最適な染色結果を得るためには、すべての気管組織を除去する必要があります。これで脳を固定する準備はすべて完了です。解剖した脳を冷たいS2溶液中に保持しながら、すべての脳の解剖を進めてください。最適な染色のために、マイクロ遠心チューブ1本あたり最大10個の脳を準備するようにしてください。分離した脳をP10ピペットチップを用いて、固定液が入った200 µLマイクロ遠心チューブに移します。ピンセットで脳を直接扱わないでください。組織は遮光してインキュベートしてください。溶液の移送時に脳を吸引しないように注意してください。固定剤を除去するため、洗浄液を用いて15分間の洗浄を3回以上行います。次に、ブロッキング液で組織を30分以上ブロッキングします。続いて、ブロッキング液を洗浄液で希釈した一次抗体に交換し、脳組織を4°Cで一晩インキュベートします。一次抗体を除去するために、洗浄液を用いて1時間の洗浄を3回行います。次に、洗浄液に溶解した蛍光標識二次抗体を加え、脳を4°Cで一晩、または室温で4時間インキュベートします。未結合の抗体を完全に洗い流すため、洗浄液で1時間の洗浄を3回行った後、PBSでさらに長時間の洗浄を行います。次に、脳を封入します。イメージング用スペーサーを付けたカバーガラスを2枚用意します。スペーサー内およびもう1枚のカバーガラス上に、抗退色剤を含む封入剤を10 µL滴下します。次に、P10ピペットを使用して脳をカバーガラス上に移し、PBSと共に培地の隣に配置します。組織を乾燥させないように注意してください。続いて、ピペットを用いて脳を封入剤の中へ慎重に移動させ、最後にスペーサー内の培地へと移し、ピンセットで配置を整えます。次に、スペーサーの粘着ライナーを取り除き、カバーガラスを取り付けます。ピンセットで軽く押さえてカバーガラスを固定し、直ちにイメージングを行うか、後で解析するためにスライドを-20°Cで保存します。上述の方法を用いて、FRT部位に挟まれた転写ターミネーターにより、3種類の異なる膜標識リポーターがサイレンシングされています。動物にヒートショックを加えると、FLPリコンビナーゼが発現してターミネーターをランダムに除去し、その結果、異なる組み合わせのリポーターが発現します。全体として、これらの異なるリポーターの組み合わせにより7種類の異なる色が提示されるため、複数の単一細胞の形態を個別に可視化し、研究することが可能です。EG-GAL4およびALG-GAL4を用いて、さまざまなヒートショック時間を検討しました。単一細胞標識の解析を脳の触角葉領域で行った。EG-GAL4ドライバーは、触角葉の表面をすべて包み込んでいる鞘状グリア細胞で発現した。対照的に、ALG-GAL4によって標的となるアストロサイト様グリアは、触角葉の大部分において重複しない領域をカバーしていた。このビデオを視聴することで、溶液中の単一細胞を標識する方法について十分な理解を得ることができます。ショウジョウバエを用い、原理的にはGAL4 UISバイナリーシステムを適用可能なモデル生物において、細胞間の複雑な解剖学的関係を理解することが目的です。この手順を初めて行う際は、まずヒートショック時間を最適化し、最高の results を得るために染色プロトコルの各ステップを可能な限り正確に遵守することが重要です。

application-multicolor-flpout-technique-to-study-high-resolution

Research

JoVE Journal

Behavior

行動

我々は、共焦点顕微鏡で蛍光染料を使用して、ライブハエの幼虫の小説インサイドアウトの組織調製物におけるグリア -...

ライブの視覚化ショウジョウバエ</em蛍光色素で>グリア - 神経筋接合部

ここでは、GFPタグ付きのグリア細胞とペアライブ顕微鏡分析を使用して開発をショウジョウバエの眼にグリア細胞の遊走を調べるためのプロトコルについて説明します。...

ショウジョウバエの眼成虫ディスクに付属してグリア細胞の移行のイメージングを生きる

ショウジョウバエの血球は胚の全体にわたって分散させる。このプロトコルは、蛍光標識した血球で胚を使用してこれらの移行をマウントし、イメージする方法を示します。...

のライブイメージングキイロショウジョウバエ胚性血球移行

シングルショウジョウバエ個眼の解剖とイメージング

このビデオでは、グリア細胞のシングルセルイメージングのためのトランスジェニックショウジョウバエ脳の免疫蛍光染色を実演しています。脳は、グリア特異的な組換え酵素システムの制御下で、抗原性エピトープのさまざまな組み合わせと融合した膜標的タンパク質を発現します。単離および固定された脳は、抗原エピトープに特異的な一次抗体で染色され、続いて蛍光色素標識二次抗体で染色されます。この標識により、さまざまな脳領域にわたる異なるグリア細胞亜集団の同時イメージングが可能になります。...

グリア細胞のシングルセルイメージングのためのショウジョウバエ脳の免疫蛍光染色

我々は、中枢神経系における単一ニューロンを標識するための技術（CNS）の提示...

の中枢神経系における単一細胞のラベリング<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

このプロトコルは、無傷の幼虫の脳のコンテキストで生細胞イメージングを行うために使用合理化された方法を説明します。ライブセルイメージングのアプローチは、一貫して、以前に見落とされたメカニズムを暴く、非対称神経幹細胞分裂の研究だけでなく、他の神経と発達過程のための非常に貴重である。...

のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経芽細胞

このプロトコルは、郭清と大人のショウジョウバエの染色について説明します脳の組織。具体的には、このプロトコルでは、神経の開発の多くの側面の基礎となる原則を明らかに正確に使用することができます例の神経細胞サブセットとしてショウジョウバエのきのこ体と光受容ニューロンの使用を強調表示します。...

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

初期のショウジョウバエの胚では、多くの細胞小器官は運動性である。原則として、それらは特定の蛍光プローブを介して生きたまま画像化することができるが、卵殻は胚への直接適用を妨げる。このプロトコルは、マイクロインジェクションを介してそのようなプローブを導入し、次いで粒子画像速度測定を介してバルクオルガネラ運動を分析する方法を記述している。...

ショウジョウバエ胚における脂質含有細胞小器官の細胞骨格依存性トラフィッキングの可視化

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eGFPタグ付きタンパク質を用いた ショウジョウバエ 光受容体細胞における膜タンパク質トラフィッキングの研究

Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization(EASI-FISH)は、拡大顕微鏡法と蛍光in...

Expansion-assisted iterative Fluorescence In Situ Hybridizationを用いたInsact Drosophila Brainにおける遺伝子発現のマルチプレックス検出

学ぼう　MCFO技術によるDrosophilaの単一細胞形態可視化とグリア細胞の細胞間相互作用解析。Gal4/UAS系を用いた発生生物学研究に応用可能な高分解能ラベリング法です。

多色 FlpOut 技術の高分解能単一細胞の形態とショウジョウバエにおけるグリア細胞の細胞間相互作用の研究への応用

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