多色 FlpOut 技術の高分解能単一細胞の形態とショウジョウバエにおけるグリア細胞の細胞間相互作用の研究への応用

この技術の全体的な目標は、複雑な解剖学的組織における単一細胞の形態を視覚化し、ショウジョウバエの細胞細胞相互作用の研究を簡素化することです。この方法は、ショウジョウバエを用いた複雑な形態や細胞細胞の相互作用に関する重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、あらゆる組織およびあらゆる発生段階での単一細胞形態の研究に適応できることです。

その手順を実演するのは、当研究室の技術者であるAnja Kieserです。MCFO 手法は、標準の FlpOut 手法を次のように変更します。ヒートショックFLPリコンビナーゼと異なるレポーターはUASの制御下にありますが、各レポーターはエピトープタグのコピーが挿入されたミリストイル化スーパーフォルダーGFPの共通のバックボーンを持っています。

得られた非蛍光タンパク質はスパゲッティモンスターGFPと命名され、抗体で同定されます。切除の数に応じて、異なるエピトープの組み合わせが発現されます。HSPプロモーターは摂氏25度でわずかに活性があるため、摂氏18度でクロスをセットアップします。

その後、F1世代を入手するまで約20日待ちます。F1の雌と雄を別々のバイアルに選別します。それらを熱ショックするには、最初に生後3〜4日後に生鮮食品のバイアルに移します。

若いハエは、ヒートショックを受けるには繊細すぎることがあります。次に、バイアルを摂氏37度の水浴に移します。それらを深く沈めて、均一な熱ショックを確保します。

グリア細胞のスパース標識では、5〜8分間の熱ショックから始めて、その後最適化します。最適なヒートショック時間は、ターゲット細胞をまばらに標識し、その関係は使用中の特定のGAL4ドライバーに依存します。ヒートショックの後、バイアルをベンチに数分間水平に置き、冷まします。

次に、同じバイアルでハエを摂氏25度に維持し始めます。2日後、レポーターの表現が最適になり、ハエを解剖することができます。準備として、3つの深い窪み井戸を氷の上に置きます。

1つのウェルに70%エタノールを、1つのウェルにPBSを、もう1つをS2細胞培養培地で満たします。次に、冷たいS2で黒いシリコンで裏打ちされた3センチの解剖皿をロードします。組織を健康に保つために、S2で全体の解剖を行います。次に、ハエに二酸化炭素を麻酔します。

次に、鉗子または羽毛を使用して、ハエを冷たい70%エタノールに約30秒間入れ、続いて冷たいPBSに約30秒間入れてから、冷たいS2に移します。したがって、解剖するすべてのハエを洗います。通常、1つの遺伝子型のハエは最大10匹で十分です。さて、30分以内に、すべての脳を解剖します。

まず、頭を体の他の部分から取り外し、体を捨てます。解剖全体を通してオフハンドで頭を保持したままにしておくと、頭をつかむのが非常に難しくなります。次に、網膜のすぐ下にある組織だけをつかんで片方の目を引き出します。

次に、もう一方の目を引き抜いて、脳と周囲の組織を露出させます。次に、脳組織がきれいに見えるまで、脳の周りに残っている気管組織と残りのキューティクルをすべて取り除きます。最適な染色結果を得るためには、すべての気管組織を切除する必要があります。

これは、脳を固定するための準備に必要なすべてです。解剖した脳を冷たいS2に保ちながら、すべての脳の解剖を進めます。最適な染色のために、マイクロ遠心チューブごとに最大10個の脳を準備するようにしてください。P10ピペットチップを使用して、単離された脳を固定溶液を含む200マイクロリットルの微量遠心チューブに移します。

鉗子を使用して脳を扱わないでください。光から保護された組織をインキュベートします。溶液の移し替え中に脳を誤嚥することは避けてください。

固定剤を取り除くには、洗浄液で15分以上洗浄します。次に、組織をブロッキング溶液で30分以上ブロックします。次に、ブロッキング溶液を洗浄液で希釈した一次抗体と交換し、脳を摂氏4度で一晩インキュベートします。

一次抗体を除去するには、洗浄液中で1時間洗浄を3回行います。次に、二次蛍光色素標識抗体を洗浄液に添加し、脳を摂氏4度で一晩または室温で4時間インキュベートします。結合していない抗体を完全に洗い流すには、洗浄液で1時間洗った後、PBSで長時間洗ってください。

次に、脳をマウントします。想像上のスペーサーで2枚のカバースリップを準備します。スペーサーと予備のカバースリップに、10マイクロリットルの封入剤と退色防止剤を塗布します。

次に、P10ピペットを使用して、脳をカバースリップに移し、PBSと一緒に培地の隣に堆積させます。ティッシュを乾かさないでください。次に、ピペットを使用して脳を慎重に封入培地に移し、最後にスペーサー内の培地に移動して鉗子で配置します。

次に、スペーサーの粘着ライナーをはがし、カバースリップを貼り付けます。鉗子を使用してカバースリップを少しの圧力で固定し、すぐにイメージングを進めるか、スライドをマイナス20°Cで保存して後で分析します。記載された方法を用いて、3つの異なる膜タグ付きレポーターは、FRT部位に隣接する転写ターミネーターによって沈黙を保たれる。

動物が熱ショックを受けたとき、FLPリコンビナーゼが発現し、ターミネーターがランダムに除去され、レポーターのさまざまな組み合わせが発現されました。全体として、異なるレポーターの組み合わせは7つの異なる色を提供するため、複数の単一細胞の形態を個別に視覚化して研究することができます。EG-GAL4とALG-GAL4で様々な熱衝撃時間を試験しました。

単一細胞標識は、脳の触角葉領域で分析されました。EG-GAL4ドライバーは、触角葉の表面にすべて被覆されたグリア細胞を被覆して発現しました。これに対し、ALG-GAL4が標的とするアストロサイト様グリアは、触角葉の重ならない領域をほとんど覆っていました。

このビデオを見れば、溶液中の単一細胞を標識する方法を十分に理解できるはずです。ショウジョウバエを使用して、原則として、バイナリシステムGAL4UISが適用される可能性のあるモデル生物で、それらの複雑で解剖学的な関係を理解するために。この手順を初めて試すときは、まず熱ショック時間を最適化し、最良の結果を得るためには、染色プロトコルの1つのステップをできるだけ踏むことを覚えておくことが重要です。