麻痺、視神経脊髄炎自己抗原アクアポリン 4 の T 細胞特定のマウスの視覚系障害の誘導

本プロトコルの全体的な目的は、アクアポリン4特異的T細胞の養子移殖によって中枢神経系（CNS）自己免疫疾患を誘導し、その結果としてCNSおよび動的な視覚システムに及ぼす影響をモニタリングすることである。この手法は、視神経脊髄炎およびその他の炎症性視覚障害における、一般にAQP4として知られるアクアポリン4特異的T細胞の役割に関する重要な疑問の解決に寄与する。光干渉断層計の主な利点は、非侵襲的な方法で網膜損傷の縦断的なモニタリングが可能であることである。

手順のデモンストレーションを行うのは、私の研究室のリサーチアソシエイトであるSharon Saganと、RE Greens LaboratoryのフェローであるAndreas Cruz Haransです。まず、2つのオス・ルアーロック接続部を持つ3方ナイロン製ストップコックを、プランジャーのないガラス製ルアーロックシリンジに取り付けます。ストップコックのレバーをシリンジ側に切り替えてストップコックを閉じ、シリンジの開口部が上を向くように配置します。

ボルテックス後、ペプチドとComplete Freund's Adjuvant溶液を等量ずつシリンジに加え、ガラスプランジャーをシリンジに再度挿入します。プランジャーを固定したまま、ストップコックが上を向くようにシリンジを反転させ、レバーを未使用のメス側コネクションに切り替えます。慎重にプランジャーを押し下げ、シリンジ内の余分な空気を除去します。

溶液がストップコックの2番目のオス側ルアーロック接続部に満たされます。次に、プランジャーを完全に挿入した2本目のガラス製シリンジを、その2番目のオス側ルアーロック接続部に装着します。乳剤を作成するために、2本のシリンジ間で溶液を往復させるよう交互にプランジャーを押し下げ、約2分間この操作を行い、その後、溶液の粘度に目に見える変化が現れるまで約10分間冷却します。

非常に硬い白色のエマルションが形成された場合は、溶液をすべて一方のシリンジに転送し、空になったシリンジを新しい1 mmのルアーロックシリンジに交換します。新しいシリンジにエマルションを満たします。ストップコックからシリンジを取り外し、25ゲージの針を取り付けます。

エマルションの均質性を水滴テストで確認するため、エマルションを1滴、少量の水が入ったシャーレに落とします。エマルションが分散しない場合は、注入に適しています。その後、ドナーのAQP4ノックアウトマウスの下腹部の両側、および腋窩内側の胸壁の両側に、それぞれ1回ずつ皮下注射を行います。

免疫から10〜12日後、1匹目のマウスの鼠径部から頸部にかけて、および各後肢に沿って皮膚に正中切開を加えます。皮膚を腹膜から剥がし、ボードにしっかりと固定します。次に、鼠径リンパ節と腋窩リンパ節を採取し、完全培地を入れたペトリ皿の中のセルストレーナーに組織を配置します。

すべてのリンパ節を回収したら、氷上の新鮮な完全培地を含む50 mLコニカルチューブにセルストレーナーを設置し、滅菌済みの5 mLシリンジプランジャーの平坦な端を用いて、リンパ節細胞をフィルターメッシュに押し出します。20 〜 30 mLの完全培地でメッシュを洗浄して細胞の回収を促進し、続いて2回の遠心洗浄を行います。2回目の遠心後、ペレットをT細胞用培地に再懸濁して細胞数をカウントします。

適切な濃度の抗原、リコンビナントマウスinterleukin 23、およびリコンビナントマウスIL-6を細胞に添加し、このTh17分極化混合液を含む細胞懸濁液を、12ウェルプレートの各ウェルに2 mLずつ分注します。その後、プレートを5% CO2を含む37 °Cの加湿インキュベーターで72時間培養します。分極化の3日目に、各ウェルの培養物を数回ピペッティングして分極化した細胞を剥離させ、氷上の50 mLコニカルチューブに回収して細胞数をカウントします。

PBSで2回洗浄した後、細胞をPBSで1×10⁸ cells/mLの濃度に希釈し、旋回させて細胞懸濁液を静かに混ぜ合わせます。回収から1時間以内に、細胞を1 mLシリンジに移し、各レシピエント動物の尾静脈から細胞200 µLを静脈内投与します。その後、PBS 200 µLに希釈したB pertussis toxin 200 ngを、各マウスに直ちに、および2日後に腹腔内投与します。

光干渉断層撮影（OCT）によるレシピエント動物の生体内網膜イメージングを行うため、撮影の5分前に、1%トロピカミドを各眼に1滴ずつ点眼して瞳孔を散瞳させ、ヒートマットをオンにします。マウスをイメージングシリンダー上に配置し、それに合わせて麻酔ガスの流量を調整します。眼を湿潤状態に保ち、屈折の連続性を確保するために0.3%ヒドロキシプロピルメチルセルロースで眼を保護し、検査対象の眼にカスタムコンタクトレンズを装着します。

赤外線眼底画像をガイドとして、ビームが視神経乳頭に中心的に当たるよう注意しながら、コンタクトレンズを装着した眼にレーザーを向けます。高解像度モードで25回のBスキャンを行い、30回の平均化Aスキャンから画像をラスタライズします。両眼の撮像が完了した後、コンタクトレンズを眼科用ゲルに置き換え、マウスを保温されたリカバリーケージに戻します。

モジュール式イメージングソフトウェアを使用して取得した画像を解析し、自動セグメンテーションを行うには、まず内境界膜および内網状層に対応するセグメントを手動で修正し、網膜内層の境界を正確に表すようにします。次に、網膜神経線維層および神経節細胞層が網膜内層の境界内に収まっており、かつ互いに重複していないことを確認します。病原性T細胞エピトープを含むAQP4ペプチドによる皮下免疫は、野生型T細胞の応答と比較して、AQP4ノックアウトマウスの排泄リンパ節において強力な増殖性T細胞応答を誘発します。

個々のV beta発現のフローサイトメトリー解析により、病原性T細胞エピトープを含むAQP4ペプチド特異的なT細胞が固有のTCRレパートリーを利用していることが示され、また選択的な過剰増殖が認められたことから、これらの決定因子に対する病原性T細胞応答は、通常、胸腺でのネガティブセレクションによって制御されていることが示唆された。分極化T細胞の注入から約6～9日後、レシピエントマウスのほぼすべてに、尾の垂れ下がりや後肢麻痺を含む中枢神経系（CNS）自己免疫疾患の臨床症状が現れた。また、Th17分極AQP4特異的T細胞は、Th1分極AQP4特異的T細胞よりも重篤な臨床疾患を誘発した。

例えば、このマウスでは、Th17分極化AQP4ペプチド特異的T細胞の投与後、完全な後肢麻痺が進行しました。AQP4ペプチド特異的Th17細胞によって誘発される臨床疾患は、中枢神経系（CNS）実質および髄膜への単核球の浸潤に関連しており、さらに視神経炎も伴います。これは、内網膜層の腫脹と厚みの増加として認められ、マウスが疾患から回復するにつれてベースラインに戻ります。このビデオを視聴することで、AQP4標的自己免疫の誘発およびモニタリング方法について十分に理解でき、視神経脊髄炎におけるT細胞の関与を解明するためのさらなる研究が可能になります。