Name: 麻痺、視神経脊髄炎自己抗原アクアポリン 4 の T 細胞特定のマウスの視覚系障害の誘導 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 学ぶAQP4特異的T細胞の受動的移入によるCNS自己免疫疾患誘導法と、光干渉断層撮影を用いた網膜損傷の非侵襲的モニタリング技術。視神経脊髄炎の病態理解に有用です。

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ガシーレンカージャパン ジャクソン慈善財団、Maisin 財団全国多発性硬化症協会 (RG 4768、RG 5179 と RG 5180) サポートは S.S.Z. に、国立衛生研究所 (RO1 AI073737、RO1 NS092835-01) によって提供されました。

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S. a. サガン、A. クルス エランス ・、c. m. スペンサー、PP の Ho、L. Steinman、A.J. グリーン、R.A. ソーベル開示報告なし。S. s. Zamvil は、神経学、神経免疫学、Neuroinflammationの副編集長で国際機関誌社会諮問委員会のメンバーであります。彼は臨床調査のジャーナル、免疫学ジャーナルおよび神経学的な科学のジャーナルの編集委員を務めて、国立衛生研究所の助成金審査委員会の創立会員をされています健康 (NIH) の臨床神経免疫と脳腫瘍 (CNBT) のセクションおよび国立多発性硬化症協会 (NMS) を検討します。彼はコンサルタントとして役立ったが、ビオゲン Idec、EMD Serono、ジェンザイム、ノバルティス、ジェネンテック/ロシュ、テバ製薬株式会社から謝礼金を受け取ったと務めてまたはデータ安全性モニタリング ・ ボードのリリー、BioMS、テバ、Opexa 治療を提供しています。現在、博士 Zamvil は、NIH、NMS、Maisin 財団、バイオジェンとセルジーンから研究助成金サポートを受け取ります。

AQP4 は、2005年3NMO IgG の主なターゲットとして識別されました。その後、中枢神経系の自己免疫の AQP4 対象動物モデルを確立することが重要になることが認められました。このようなモデルは、AQP4 固有 T および B 細胞が中枢神経系の自己免疫疾患の開発に参加する方法を調査して、NMO の治療薬候補をテストする役に立つかもしれません。ただし、野生型マウスのエピトープは 2010 年13、それらの抗原に応答する T 細胞で初めて報告されました AQP4 特異的 T 細胞の同定の臨床的または組織学的疾患14,17を発生していません。AQP4 に対する免疫反応に基づく中枢神経系の自己免疫疾患のモデルを生成することができないときに 2015年まで謎に残ったジョーンズら25は、AQP4-/-マウスからドナー AQP4 p135 先読み 153 T 細胞が WT マウスにおける中枢神経系の自己免疫疾患の臨床的および組織学的徴候を引き起こすことができることを発見しました。関心の AQP4 p135 153 は親和性が高い17MHC II (- Ab) をバインドと予測されます。1 つだけ他 AQP4 アミノ酸シーケンス、201-220 は、バインド - Abと同様の高い親和性と予測されます。確かに、その AQP4 の p135 153 ・ p201-220 両方引き出す AQP4-/-、しかしない WT、マウスで堅牢な増殖を観察しました。ここでは、我々 はどのように 1 つを分離でき、AQP4-/-マウスから encephalitogenic Th17 AQP4 p135 153 と p201-220-反応性 T 細胞の拡大を示しています。WT 受信者マウスに転送、ドナー AQP4 反応性 Th17 細胞誘導麻痺、脊髄と視神経の単核細胞浸潤を伴っていた。求心性の視覚システムの損傷は AQP4 抗体陽性 NMOSD26症例でよく知られています。ここでは、AQP4 反応やモグ反応性 Th17 細胞による視神経の炎症だったを見ました。AQP4 固有 Th17 細胞は、光 perineuritis を誘導に対しモグ固有 Th17 細胞は重症視神経炎を誘導しました。シリアル 10 月 AQP4 固有とモグ特異的 T 細胞による視神経の炎症を監視に使用する技術も説明しました。他の研究者は、ATCA の発症機構に焦点を当てた独自の研究を進めるためにはここで説明したプロトコルを適用することができるはずです。
1 つは簡単に我々 のプロトコルで 3 つの潜在的な落とし穴を回避できます。ATCA の最初、養子の転送には、AQP4-/-ドナーのマウスから AQP4 特異的 T 細胞の使用が必要です。具体的には、ドナー WT AQP4 p135 153 特異的 T 細胞では、受信者の WT マウスの ATCA は発生していません。第二に、AQP4-/-マウス (プロトコル手順 1.5) の予防接種前にペプチド/CFA エマルジョンのドロップで「水テスト」を実行することが重要です。乳剤はする必要がありますそれが皮下注射に適した水に分散されず。エマルジョンの分散は、エマルジョンをもう一度混ぜて、再び寒さ水テストを繰り返します必要があります 1 つ。最後に、中枢神経系活性ドナー抗原特異的 T 細胞は T 細胞を安静時よりもより効率的に中枢神経系の自己免疫疾患を誘発します。1 つは、視覚的に養子転送ドナー T 細胞を収穫する前に光の顕微鏡の下でそれらの文化を検査しました。急速に細胞分裂を容易に識別のクラスターを形成できます。また、文化には、活性化 T 細胞多くにはが含まれて、メディアはオレンジや黄色、pH の減少によるピンクから移行があります。プロトコルの手順 3 で説明した 1 つは3H-チミジン取り込みによってドナー AQP4 プライミング リンパ節 T 細胞増殖の活性化を評価することも。
我々 の発見は、2 つの病原性 AQP4 T 細胞エピトープ (1) 予測される高親和性 MHC II をバインドし、(2) AQP4-/-、ない WT でも強力な増殖反応を誘発する、マウスは、これらの要因を対象とする T 細胞は、通常を示唆しています。胸腺の負の淘汰17によって制御されます。AQP4 p135 153 と AQP4-/-マウスの p201 220 の認識のために利用する TCR レパートリーがユニーク (図 2) また、胸腺髄質上皮細胞によって仲介されたクローンの削除に一貫しています。他の免疫寛容のメカニズムは通常 AQP4 に対する免疫応答を抑制するかもしれない。私たちの最初の報告の17、それに続く別のグループは、AQP4 p201 220 に、encephalitogenic T 細胞決定27が含まれていることをまた示した。Α/β (TCRα-/-) T 細胞欠損マウスが AQP4-/- CD4 と再構成されたとき+ T 細胞、encephalitogenic AQP4 固有の T 細胞の応答では、しかしない、AQP4 固有体液性応答の意味を引き出すことはでしたWT マウス AQP4 特異 B 細胞応答、AQP4 固有の T 細胞の応答のようは、負の選択が適用されます。確かに、AQP4 特異的 T 細胞による ATCA と WT マウスで観察されなかった、脊髄軸索と、Rgc の損失は、病原性の特定の AQP4 抗体の関与を必要があります。それは明らか AQP4 をターゲットとした中枢神経系の自己免疫のマウス ・ モデルは通常 AQP4 特異的 T 細胞および B 細胞の免疫を制御する免疫寛容のメカニズムについての詳細を学ぶように進化をし続けます。
AQP4 をターゲットとした中枢神経系の自己免疫の他のモデルも開発6,16,をされている28,29,30。各は、NMO の病態に関連する特定の側面を勉強のための利点があります。AQP4 特異的 T 細胞は、WT ラット6,16,29で識別されています。それら AQP4 特異的 T 細胞が自己免疫の中枢神経系の組織学的変化を引き起こされるが、マウスの観察と同様に、WT ラット AQP4 特異的 T 細胞が発生しない臨床病気の重要なサイン。したがって、WT マウスの T 細胞と B 細胞の AQP4 固有免疫応答を制限する耐性のメカニズム、ラットの運用も。関係なく、1 つは病気の病因に関与するメカニズムを研究するためのマウスモデルを使用しての力を過小評価しないでください。ノックアウト、トランスジェニックとレポーター マウスの富を有利にすることができます。また、自己免疫疾患のいくつかの基本的な発見は EAE マウスモデルを使用して行われたことを認識すべき。デモその T 細胞クローンの自己抗原のための特定することができます自己免疫疾患31,32, T 細胞共刺激が引き起こす自己免疫33の役割との発見の同定を仲介するなど、th17 細胞分化34発達経路は最初マウス EAE モデルを使用して記述されていた。私たちが開発した ATCA のマウスモデルを使用して、1 つになりました生体内で病原性の AQP4 特定の免疫反応の発展と規制を検討するための手段 NMO の病態に重要な洞察力を提供する必要があります。

Optica 視神経脊髄炎 (NMO) は、中枢神経系 (CNS) 引き起こす自己免疫炎症性脱髄性疾患まひ状態および永続的な神経障害1につながる視覚的な損失の再発エピソードです。NMO は、2液性の自己免疫疾患をする抗体 (Igs) アクアポリン-4 (AQP4)、アストロ サイト3,4に豊富に発現水チャネルをターゲットに関連付けられている、主に現在考えられています。しかし、中枢神経系の炎症は AQP4 Ig5,6の CNS エントリーの前提条件です。したがって、それだけで抗 AQP4 Igs の譲渡による NMO のモデルを確立することはなかった。NMO 患者に (1) 病原性の AQP4 固有 Igs である IgG11,2所見、サブクラス7 (2) T 細胞が NMO 病変8,9 (3) NMO で識別される T 細胞依存性免疫グロブリンが関連付けられています。特定の MHC II 遺伝子を持つ (例えば HLA DR17 (DRB1 * 0301))10、および (4) 炎症性反応 AQP4 博士-制限 Th17 細胞が NMO 患者11,12すべての展開は AQP4 特異的 T 細胞が重要な役割であることを示すNMO の病態。したがって、AQP4 特異的 T 細胞 NMO の病態に貢献するかもしれない方法を決定するための動物モデルを開発することが重要です。
数年前、複数の AQP4 T 細胞エピトープは、野生型 (WT) マウス13,14とラット15で識別されました。AQP4 反応性 T 細胞が素朴な受信者ラット15,16opticospinal 炎症を引き起こすことができることがわかった中、CNS 疾患の重要な臨床症状は認められなかった。同様に、AQP4 T 細胞エピトープ14,17, を含むペプチドと WT マウスの免疫を直接、または炎症性 T 細胞それら要因17をターゲットの転送し、臨床症状が発生していない組織、または中枢神経系の自己免疫の証拠。
最近では、それは親和性の高い18AQP4 ペプチド (p) 135 153 または MHC II (- Ab) をバインドする予測 2 つの要因、p201 220 C57BL/6 AQP4 欠損 (AQP4-/-) マウスの予防接種を認め、強い CD4 を誘発+ T 細胞応答17。対照的に、これらの 2 つのペプチドは WT マウスでのみ控えめな反応を引き出した。さらに、AQP4-/-マウスの T 細胞によるこれらの要因の認識に使用される T 細胞受容体 (TCR) レパートリーはユニークだった。総称して、AQP4 の認識を T 細胞が胸腺の負の淘汰によって調節されていることが示唆されました。AQP4 p135 153 または p201-220-固有 AQP4-/-ドナーのマウスから Th17 細胞による素朴な受信者 WT マウス; のほぼ 100% で麻痺これは、T 細胞、B 細胞、単球の opticospinal 浸潤と関連付けられました。シリアル opticospinal コヒーレンストモグラフィ (OCT) は、動的視覚システムの関与を示した。AQP4 をターゲットとした CNS の T 細胞性自己免疫 (ATCA) を持つマウスは、麻痺とビジュアル系の傷害から回復しました。ミエリン オリゴデンドロ サイト糖タンパク質 (モグ) p35-55-特定の T 細胞による、永続的な臨床病気につながったフイブロネクチンと対照をなして単独で T 細胞による ATCA は軸索損失または網膜神経節細胞 (Rgc) の削減に関連付けられてでした。我々 の結果では、複数の病原性 AQP4 T 細胞決定があることが明らか。ATCA のこの新しいモデルはそれらの細胞が CNS の発火を誘発する方法と彼らが AQP4 特異 B 細胞と抗体 NMO の病態を促進するために協力する方法を学習、病原性の AQP4 特異的 T 細胞の開発を制御するメカニズムを調べる場合に役立ちます.
本報告を誘導し、T 細胞による ATCA を評価に使用するプロトコルについて述べる。まず、予防接種、培養 T 細胞、th17 細胞の分極のため病原性 AQP4 特異的 T 細胞、偏波とそれらの T 細胞の養子の転送を確認する流れフローサイトメトリー解析を生成するための技術に。私たちは、臨床的および組織学的病と受信者のマウスの視覚システム障害を監視するシリアル 10 月の使用を評価するために使用方法を説明します。

<table><tbody><tr><td>M. tuberculosis H37Ra</td><td>BD Difco</td><td>231141</td><td>Dessicated, killed M. tuberculosis</td></tr><tr><td>Incomplete Freund's Adjuvant</td><td>BD Difco</td><td>263910</td><td></td></tr><tr><td>AQP4 peptide p135-153</td><td>Genemed</td><td>カスタム合成</td><td>ペプチド配列:LVTPPSVVGGLGVTMVHGN</td></tr><tr><td>AQP4ペプチドp201-220</td><td>Genemed</td><td>カスタム合成</td><td>ペプチド配列:HLFAINYTGASMNPARSFGP</td></tr><tr><td>MOGペプチドp35-55</td><td>Genemed / Auspep</td><td>カスタム合成</td><td>ペプチド配列:MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK</td></tr><tr><td>3ウェイストップコック</td><td>Kimble</td><td>420163-4503</td><td></td></tr><tr><td>HyCloneウシ胎児血清(特性評価済み)</td><td>GEヘルスケアライフサイエンス</td><td>SH30071</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウスIL-23</td><td>R&Dシステムズ(バイオテクネ)</td><td>1887-ML</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウスIL-6</td><td>R&Dシステムズ(バイオテクネ)</td><td>406-ML</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウスIL-12</td><td>R&D Systems (BioTechne)</td><td>419-ML</td><td></td></tr><tr><td>チミジン [Methyl-3H]</td><td>PerkinElmer</td><td>NET027</td><td></td></tr><tr><td>ガラス繊維フィルターマット</td><td>PerkinElmer</td><td>1450-421</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス抗体</td><td>eBioscience (Affymetrix)</td><td>[各種]</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスTCR V&β;スクリーニングパネル</td><td>BD Biosciences</td><td>557004</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 固定可能な死細胞染色</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>[各種]</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (16%)</td> <td>電子顕微鏡 科学</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>GolgiPlug BD</td><td>Biosciences</td><td>555028</td><td></td></tr><tr><td>ホルボール 12-ミリスチン酸 13-酢酸 (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>イオモマイシン(カルシウム塩)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>百日咳毒素 B. 百日咳</td><td>List Biological Laboratories</td><td>181</td><td></td></tr><tr><td>10% ホルマリン</td><td>VWR</td><td>89370-094</td><td></td></tr><tr><td>可変流量蠕動ポンプ</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-2</td><td></td></tr><tr><td>フォーム生検パッド、長方形</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-038-221</td><td></td></tr><tr><td>イソセシア (イソフルラン、USP)</td><td>ヘンリー・シャイン アニマルヘルス</td><td>050033</td><td>NDC : 11695-0500-2</td></tr><tr><td>トロピカミド点眼液、USP (1%)</td> <td>Akorn</td><td></td><td>NDC: 17478-102-12</td></tr><tr><td>Spectralis Diagnostic Imaging Platform</td><td>ハイデルベルクエンジニアリング</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

麻痺、視神経脊髄炎自己抗原アクアポリン 4 の t 細胞特定のマウスの視覚系障害の誘導

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

それが認識される中、アクアポリン 4 の (AQP4)-特定の T 細胞と抗体に関与して発症オプティカ視神経脊髄炎 (NMO)、人間の中枢神経系 (CNS) 自己免疫性脱髄疾患、両方と AQP4 対象モデルの作成中枢神経系の自己免疫疾患の臨床的および組織学的症状は、挑戦的な証明されています。AQP4 ペプチド (WT) マウスを野生型の予防接種は、これらの T 細胞は、素朴な受信者マウスに病気を転送できませんでしたが T 細胞の増殖を誘発しました。胸腺によってコントロールされて AQP4 エピトープに対する T 細胞の反応性を示唆、AQP4 欠損 (AQP4-/-) マウスの免疫応答の勉強時に、p201-220、ペプチド (p) 135 153 2 つ小説 AQP4 T 細胞エピトープが指定された最近では、負の淘汰。AQP4-/- th17 細胞 T 細胞脊髄と視神経の主に髄膜炎症に関連付けられていた p135 153 または p201 220 受信者の WT マウスで麻痺誘導を仕掛ける円偏波。炎症周囲視神経と網膜内層 (IRL) の関与は、シリアル光コヒーレンストモグラフィ (OCT) の変化によって明示されました。ここで、我々 はモデルを作成するこの新しい生体内で病原性の AQP4 特異的 T 細胞と彼らが B に協力する方法の開発を可能にするメカニズムを研究することができますとり入れ AQP4 をターゲットとした中枢神経系自己免疫 (ATCA) の使用方法を説明します。NMO の病態のセルします。

このプロトコルでは、C57BL/6 AQP4-/-マウスからドナー T 細胞を使用しました。これら 2 つのペプチド誘導くらい弱い T 細胞に対し、病原性 T 細胞エピトープを含む、AQP4 p135 153 と p201-220、これらのマウスの皮下接種はドレイン リンパ節 (図 1)、強い増殖性 T 細胞反応を誘発WT マウスで増殖します。比較では、AQP4 p91-110、免疫非病原性 AQP4 T の細胞決定の13、またはモグ p35-55、実験的自己免疫性脳脊髄炎 (EAE)22,23 を引き起こす T 細胞を活性化するミエリン ペプチドを含む ,24, 誘発 AQP4-/-と WT マウスの T 細胞増殖の同じような大きさ。流れの cytometry の汚損によって TCR 使用率の分析の個々 の Vβ または Vβ の家族を示した AQP4-/-マウスから p135 153- と p201-220-特定の T 細胞がユニークな TCR レパートリーを利用します。選択的ハイパー増殖 AQP4 p135 153 と AQP4-/-マウスだけでなく、ユニークな TCR 使用率 (図 2)、p201 220 の胸腺負定め通常病原性 T 細胞応答これらの決定要因に、示されています。選択は、このプロトコルで AQP4-/-ドナー T 細胞を使用しての重要性を強調します。
ATCA の誘導の養子転送前に AQP4 ペプチドされたマウスからリンパ節細胞の体外培養 3 日間 th17 細胞や Th1 偏光条件で。程度ドナー CD4 の偏波+ T 細胞は細胞内サイトカイン染色 (ICS) によって確認され、フローサイトメトリー (図 3) を用いています。2 x 107ドナー AQP4 ペプチド特異的 T 細胞を静脈内注入した素朴な受信者マウス。約 6 日後ほぼ受信者マウスの 100% はぐったりの尾と後肢の麻痺 (図 4) を含む中枢神経系の自己免疫疾患の臨床徴候を開発しました。AQP4 特異的 T 細胞の th17 細胞偏極による Th1 偏光 AQP4 特異的 T 細胞よりもより厳しい臨床病。Th17 AQP4 ペプチド特異を受信し、完全な後肢麻痺 (麻痺) を開発した代表的なマウスは、ビデオ 1に表示されます。EAE を開発したモグ固有 Th17 細胞の投与後のマウスとは異なり受信者マウスは AQP4 固有 Th17 細胞による臨床病気から回復しました。モグ p35 固有 55 Th17 細胞による惹起、AQP4 p135 153 固有でによる臨床病や Th17 細胞 p201-220 CNS の実質および髄膜 (図 5) の単核細胞の浸潤と関連していた。豊かな AQP4 固有 Th17 細胞による中枢神経系の自己免疫の実質のより髄膜病変。
組織学的評価とシリアル 10 月 AQP4 特定によって視神経の関与を示したし、モグ固有 Th17 細胞は単核球細胞の存在によって特徴付けられた両方の引き起こされた視神経炎症。AQP4 固有 Th17 細胞は、光 perineuritis を引き起こされるに対し、MOG 固有 Th17 細胞誘導重症視神経炎 (図 5) です。シリアル OCT を使用すると、視神経の炎症腫脹によって明らかになった、AQP4 固有または特定のモグ Th17 細胞 (図 6) による臨床疾患の網膜内層 (IRL) 厚みが増加します。AQP4 th17 細胞による中枢神経系の自己免疫疾患、臨床病気から回復 IRL 厚さマウスとしてベースラインに返されます。対照的に、モグ固有 th17 細胞による EAE の永続性は IRL の菲薄化と対応し、先ほど我々 説明した17、網膜神経節細胞の損失と関連していた。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig1.jpg"> 
図 1: AQP4 p135 153 と p201 220 AQP4-/-マウスがなく、WT マウスで堅牢な T 細胞の増殖を引き出します。接種した sc の CFA で示されたペプチドです。11 日後、リンパ節の除去、ないのいずれかの抗原または予防接種用ペプチドを培養します。3H-チミジン取り込み (平均 ± 5 実験の代表的な SEM) によって増殖を測定しました。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig2.jpg"> 
図 2: AQP4-/-マウスから AQP4 特異的 T 細胞を利用一意の TCR レパートリー 。AQP4-/-と WT マウスは、示されたペプチドで免疫しました。11 日後、リンパ節除去し、予防接種に使用されるペプチドで培養されました。セルを収穫されました。TCR Vβ 利用したフローサイトメトリーで分析した (意味 ± SEM は、n = 5)。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig3.jpg"> 
図 3: ドナー AQP4 特異的 T 細胞の炎症性偏光。AQP4 p135 153 または p201-220、接種後 11 日間リンパ節細胞収穫, 非偏光条件、Th1 や Th17 偏光条件で予防接種に使用されるペプチドで培養された.Th17 細胞や th1 細胞の分極によって調べた ICS とフローサイトメトリー IL 17 の IFN-γ、それぞれ。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig4.jpg"> 
図 4: Th17 偏光 AQP4 特異的 T 細胞誘導 WT 受信者マウスで麻痺します。WT 受信者マウスは、AQP4-/-マウスから 2 x 107ドナー Th17 偏光 AQP4 p135 153 または p201 220 特異的 T 細胞を受け取った。モグ特異的 T 細胞の th17 細胞偏光はポジティブ コントロールとして提供しています。8 実験の結果が (n = 5/グループ)。* p &#60; 0.05 * * p &#60; 0.01 * * * p &#60; 0.001。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig5.jpg"> 
図 5: AQP4 固有 Th17 細胞は WT マウスで opticospinal 炎症を誘発する。受信者のマウスは 2 x 107ドナー Th17 AQP4 p135 153 または p201-220-先読み Th17 細胞 AQP4-/-マウスや Th17 モグ p35-55-特定の細胞を受け、10 日後が犠牲になった。脊髄と視神経組織が準備され、H に染まった &#38; E/LFB 炎症、脱髄の証拠を評価するには、それぞれ。結果は、5 マウス/グループの代表です。スケールバー = 50 μ m.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig6.jpg"> 
図 6: 縦断的網膜 10 月、AQP4 固有 Th17 細胞による視神経の炎症を監視できますWT 受信者マウスは、0 日目に 2 × 107ドナー Th17 偏光 AQP4 p201-220-特定やモグ p35-55-特定の T 細胞を受け取りました。10 月 0 日目 (T 細胞の管理) の前に検討されたとし、日 4、7、8、9 10 11 14 と 21。IRL の厚さは、測定 (平均 ± SEM) だった。統計は、単純なコントロールとの比較を示します。結果は、3 実験 (5 マウス/グループ) の代表です。* p &#60; 0.05 * * p &#60; 0.01 * * * p &#60; 0.001。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

ここでは、アクアポリン 4 (AQP4) 伝による麻痺と opticospinal の炎症を誘発するプロトコルを提案-WT マウスに AQP4-/-マウスから特定の T 細胞。さらに、シリアルの光干渉断層計を使用して視覚システムの機能不全を監視する方法を示します。

麻痺、視神経脊髄炎自己抗原アクアポリン 4 の T 細胞特定のマウスの視覚系障害の誘導

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

本プロトコルの全体的な目的は、アクアポリン4特異的T細胞の養子移殖によって中枢神経系（CNS）自己免疫疾患を誘導し、その結果としてCNSおよび動的な視覚システムに及ぼす影響をモニタリングすることである。この手法は、視神経脊髄炎およびその他の炎症性視覚障害における、一般にAQP4として知られるアクアポリン4特異的T細胞の役割に関する重要な疑問の解決に寄与する。光干渉断層計の主な利点は、非侵襲的な方法で網膜損傷の縦断的なモニタリングが可能であることである。手順のデモンストレーションを行うのは、私の研究室のリサーチアソシエイトであるSharon Saganと、RE Greens LaboratoryのフェローであるAndreas Cruz Haransです。まず、2つのオス・ルアーロック接続部を持つ3方ナイロン製ストップコックを、プランジャーのないガラス製ルアーロックシリンジに取り付けます。ストップコックのレバーをシリンジ側に切り替えてストップコックを閉じ、シリンジの開口部が上を向くように配置します。ボルテックス後、ペプチドとComplete Freund's Adjuvant溶液を等量ずつシリンジに加え、ガラスプランジャーをシリンジに再度挿入します。プランジャーを固定したまま、ストップコックが上を向くようにシリンジを反転させ、レバーを未使用のメス側コネクションに切り替えます。慎重にプランジャーを押し下げ、シリンジ内の余分な空気を除去します。溶液がストップコックの2番目のオス側ルアーロック接続部に満たされます。次に、プランジャーを完全に挿入した2本目のガラス製シリンジを、その2番目のオス側ルアーロック接続部に装着します。乳剤を作成するために、2本のシリンジ間で溶液を往復させるよう交互にプランジャーを押し下げ、約2分間この操作を行い、その後、溶液の粘度に目に見える変化が現れるまで約10分間冷却します。非常に硬い白色のエマルションが形成された場合は、溶液をすべて一方のシリンジに転送し、空になったシリンジを新しい1 mmのルアーロックシリンジに交換します。新しいシリンジにエマルションを満たします。ストップコックからシリンジを取り外し、25ゲージの針を取り付けます。エマルションの均質性を水滴テストで確認するため、エマルションを1滴、少量の水が入ったシャーレに落とします。エマルションが分散しない場合は、注入に適しています。その後、ドナーのAQP4ノックアウトマウスの下腹部の両側、および腋窩内側の胸壁の両側に、それぞれ1回ずつ皮下注射を行います。免疫から10〜12日後、1匹目のマウスの鼠径部から頸部にかけて、および各後肢に沿って皮膚に正中切開を加えます。皮膚を腹膜から剥がし、ボードにしっかりと固定します。次に、鼠径リンパ節と腋窩リンパ節を採取し、完全培地を入れたペトリ皿の中のセルストレーナーに組織を配置します。すべてのリンパ節を回収したら、氷上の新鮮な完全培地を含む50 mLコニカルチューブにセルストレーナーを設置し、滅菌済みの5 mLシリンジプランジャーの平坦な端を用いて、リンパ節細胞をフィルターメッシュに押し出します。20 〜 30 mLの完全培地でメッシュを洗浄して細胞の回収を促進し、続いて2回の遠心洗浄を行います。2回目の遠心後、ペレットをT細胞用培地に再懸濁して細胞数をカウントします。適切な濃度の抗原、リコンビナントマウスinterleukin 23、およびリコンビナントマウスIL-6を細胞に添加し、このTh17分極化混合液を含む細胞懸濁液を、12ウェルプレートの各ウェルに2 mLずつ分注します。その後、プレートを5% CO2を含む37 °Cの加湿インキュベーターで72時間培養します。分極化の3日目に、各ウェルの培養物を数回ピペッティングして分極化した細胞を剥離させ、氷上の50 mLコニカルチューブに回収して細胞数をカウントします。PBSで2回洗浄した後、細胞をPBSで1×10⁸ cells/mLの濃度に希釈し、旋回させて細胞懸濁液を静かに混ぜ合わせます。回収から1時間以内に、細胞を1 mLシリンジに移し、各レシピエント動物の尾静脈から細胞200 µLを静脈内投与します。その後、PBS 200 µLに希釈したB pertussis toxin 200 ngを、各マウスに直ちに、および2日後に腹腔内投与します。光干渉断層撮影（OCT）によるレシピエント動物の生体内網膜イメージングを行うため、撮影の5分前に、1%トロピカミドを各眼に1滴ずつ点眼して瞳孔を散瞳させ、ヒートマットをオンにします。マウスをイメージングシリンダー上に配置し、それに合わせて麻酔ガスの流量を調整します。眼を湿潤状態に保ち、屈折の連続性を確保するために0.3%ヒドロキシプロピルメチルセルロースで眼を保護し、検査対象の眼にカスタムコンタクトレンズを装着します。赤外線眼底画像をガイドとして、ビームが視神経乳頭に中心的に当たるよう注意しながら、コンタクトレンズを装着した眼にレーザーを向けます。高解像度モードで25回のBスキャンを行い、30回の平均化Aスキャンから画像をラスタライズします。両眼の撮像が完了した後、コンタクトレンズを眼科用ゲルに置き換え、マウスを保温されたリカバリーケージに戻します。モジュール式イメージングソフトウェアを使用して取得した画像を解析し、自動セグメンテーションを行うには、まず内境界膜および内網状層に対応するセグメントを手動で修正し、網膜内層の境界を正確に表すようにします。次に、網膜神経線維層および神経節細胞層が網膜内層の境界内に収まっており、かつ互いに重複していないことを確認します。病原性T細胞エピトープを含むAQP4ペプチドによる皮下免疫は、野生型T細胞の応答と比較して、AQP4ノックアウトマウスの排泄リンパ節において強力な増殖性T細胞応答を誘発します。個々のV beta発現のフローサイトメトリー解析により、病原性T細胞エピトープを含むAQP4ペプチド特異的なT細胞が固有のTCRレパートリーを利用していることが示され、また選択的な過剰増殖が認められたことから、これらの決定因子に対する病原性T細胞応答は、通常、胸腺でのネガティブセレクションによって制御されていることが示唆された。分極化T細胞の注入から約6～9日後、レシピエントマウスのほぼすべてに、尾の垂れ下がりや後肢麻痺を含む中枢神経系（CNS）自己免疫疾患の臨床症状が現れた。また、Th17分極AQP4特異的T細胞は、Th1分極AQP4特異的T細胞よりも重篤な臨床疾患を誘発した。例えば、このマウスでは、Th17分極化AQP4ペプチド特異的T細胞の投与後、完全な後肢麻痺が進行しました。AQP4ペプチド特異的Th17細胞によって誘発される臨床疾患は、中枢神経系（CNS）実質および髄膜への単核球の浸潤に関連しており、さらに視神経炎も伴います。これは、内網膜層の腫脹と厚みの増加として認められ、マウスが疾患から回復するにつれてベースラインに戻ります。このビデオを視聴することで、AQP4標的自己免疫の誘発およびモニタリング方法について十分に理解でき、視神経脊髄炎におけるT細胞の関与を解明するためのさらなる研究が可能になります。

induction-paralysis-visual-system-injury-mice-t-cells-specific-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質と不活性化結核菌の組み合わせを注入することにより、マウスモデルで実験的な自己免疫性脳脊髄炎を誘発する方法を示しています。このモデルにより、研究者は疾患のメカニズムを研究し、治療的介入をテストすることができます。...

マウスモデルにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導

このビデオは、ミエリン由来のペプチドにアジュバントを注入して自己反応性T細胞を活性化し、脳に移動することにより、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を誘発する方法を示しています。百日咳毒素は、血液脳関門の透過性を高めるために投与され、これらのT細胞や他の免疫細胞が脳に入ることを可能にします。これらの免疫細胞は脱髄を引き起こし、神経伝達の障害とEAEの発症につながります。...

マウスモデルにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の生成

このビデオでは、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を使用して多発性硬化症のマウスモデルを確立しています。マウスにニューロンペプチドとアジュバントを含むエマルジョンを注入すると、自己反応性T細胞を活性化する免疫応答が引き起こされます。これに続いて、百日咳毒素(PTX)を注射して血液脳関門の透過性を高め、自己反応性T細胞が脳に浸潤できるようにします。この浸潤は、最終的にミエリン損傷をもたらすシグナル伝達カスケードを開始し、多発性硬化症の脱髄状態を模倣しています。...

このビデオでは、アクアポリン-4を標的とする活性化Th17細胞をマウスモデルに移すことにより、麻痺を誘発する手順を示しています。中枢神経系では、活性化されたTh17細胞がアクアポリン-4を発現するアストロサイトと相互作用し、免疫応答を引き起こしてマウスの尾部と四肢の麻痺を引き起こします。...

アクアポリン-4特異的Th17細胞の移植によるマウスモデルにおける麻痺の誘導

このビデオは、百日咳毒素とミエリン模倣ペプチドおよびアジュバントを含む接種物の投与を通じてマウスモデルの運動機能障害を評価するプロセスを示しています。その後、運動機能を評価するためのトレッドミルテストを行い、免疫活性化と脱髄による神経損傷を評価します。...

実験的自己免疫性神経炎マウスモデルにおける運動機能の評価

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実験的自己免疫性脳脊髄炎の成体マウスにおけるガラス脊髄窓の埋め込み

この原稿は、実験的な自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルの誘導と採点の方法、およびさまざまな疾患段階におけるフローサイトメトリーと定量的PCRをそれぞれ使用して、リンパ節、脾臓、血液、脊髄の免疫細胞分布とmRNAサイトカインレベルの評価を説明しています。...

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このレポートは、Freund 完全アジュバント、百日咳毒素との組み合わせでゼロ (P0)180 199ペプチド ミエリン蛋白を用いた実験的自己免疫性炎 (EAN) を正常に誘導するために単純な方法をについて説明します。機能的障害とこの EAN...

機能と神経病理学的評価の c57bl/6 マウスの実験的自己免疫性視神経炎を誘導するための単純なアプローチ

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細胞ベースのアッセイによるひと血清抗アクアポリン 4 免疫グロブリン G の検出

本プロトコルは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質を使用し、臨床スコアリングシステムを使用して疾患プロセスをモニタリングするマウスモデルにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘発を記載しています。実験的自己免疫性脳脊髄炎関連症状は、マウス大腿骨マイクロコンピューター断層撮影分析とオープンフィールドテストを使用して分析され、疾患プロセスを包括的に評価します。...

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学ぶAQP4特異的T細胞の受動的移入によるCNS自己免疫疾患誘導法と、光干渉断層撮影を用いた網膜損傷の非侵襲的モニタリング技術。視神経脊髄炎の病態理解に有用です。

麻痺、視神経脊髄炎自己抗原アクアポリン 4 の T 細胞特定のマウスの視覚系障害の誘導

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