麻痺、視神経脊髄炎自己抗原アクアポリン 4 の T 細胞特定のマウスの視覚系障害の誘導

このプロトコルの全体的な目標は、アクアポリン 4 特異的 T 細胞の養子移行により中枢神経系または CNS 自己免疫疾患を誘発し、結果として生じる CNS および動的視覚系への影響を監視することです。この方法は、視神経脊髄炎における特定のT細胞であるAQP4、およびその他の炎症性視覚障害における、一般にAQP4として知られているアクアポリン4の役割に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。光干渉断層撮影の主な利点は、網膜損傷の縦方向モニタリングを非侵襲的に行うことができることです。

この手順を実演するのは、私の研究室の研究員であるSharon Saganと、RE Greens LaboratoryのフェローであるAndreas Cruz Haransです。まず、2つのオス型ルアーロック接続を備えた3ウェイナイロンストップコックを、プランジャーなしでガラス製のルアーロックシリンジに取り付けます。ストップコックレバーをシリンジの方に切り替えてストップコックを閉じ、シリンジの開放端を上に向けて

ボルテックス後、1対1の容量のペプチドと完全なフロイントのアジュバント溶液をシリンジに加え、ガラスプランジャーをシリンジに再挿入します。プランジャーを所定の位置に保持し、ストップコックが上を向くようにシリンジを反転させ、レバーを未使用のメス接続に切り替えます。プランジャーを慎重に押し下げて、シリンジから余分な空気を取り除きます。

このソリューションは、ストップコックの2番目のオス型ルアーロック接続を満たします。次に、プランジャーを2番目のオスのルアーロック接続に完全に挿入した状態で、2番目のガラスシリンジを取り付けます。エマルジョンを作成するには、プランジャーを交互に押し下げて2つのシリンジの間に溶液を約2分間通過させ、溶液の粘度に目に見える変化が見られるまで溶液を約10分間冷却します。

非常に硬い白色エマルジョンが形成された場合は、すべての溶液をシリンジの1つに移し、空のシリンジを新しい1mmルアーロックシリンジと交換します。新しいシリンジにエマルジョンを入れます。ストップコックからシリンジを取り外し、25ゲージの針を取り付けます。

エマルジョンの一貫性を水でテストするには、エマルジョンを一滴ずつ小さな皿の水に排出します。エマルジョンが分散しない場合は、注入に適しています。次に、各ドナーAQP4ノックアウトマウスを下腹部の各側面と、脇の下の内側にある胸壁の各側面に1回皮下注射します。

予防接種の10〜12日後に、鼠径部から首まで、そして最初のマウスの各脚に皮膚の正中線切開を行います。皮膚を腹膜から引き離し、ボードにしっかりと固定します。次に、鼠径リンパ節と腋窩リンパ節を採取し、完全な培地が入ったペトリ皿内の細胞ストレーナーに組織を置きます。

すべてのリンパ節を採取したら、氷上に新鮮な完全な培地が入った50ミリリットルの円錐管にセルストレーナーを置き、滅菌済みの5ミリリットルのシリンジプランジャーの平らな端を使用して、リンパ節細胞をフィルターメッシュに押し込みます。メッシュを20〜30ミリリットルの完全培地ですすいで細胞の回復を促進し、その後2回の遠心分離洗浄を行います。2回目の遠心分離後、ペレットをT細胞培地に再懸濁してカウントします。

適切な濃度の抗原、組換えマウスインターロイキンマウス23、および組換えマウスIL-6を細胞に加え、このTh17分極混合物中のウェルあたり2ミリリットルの細胞を12ウェルプレートの各ウェルに加えます。次に、プレートを加湿した摂氏37度のインキュベーターに5%CO2を入れて72時間置きます。分極の3日目に、各ウェルの培養物を数回粉砕して分極した細胞を取り除き、氷上の50ミリリットルの円錐形チューブにプールしてカウントします。

PBSで2回洗浄した後、細胞をPBSの10〜8細胞/mLの濃度の1倍に希釈し、細胞懸濁液を渦巻かせて穏やかに混合します。採取後1時間以内に、細胞を1ミリリットルの注射器に移し、200マイクロリットルの細胞を尾静脈を通じて各レシピエント動物に静脈内投与します。次に、各マウスをすぐに腹腔内に注射し、2日後に200マイクロリットルのPBSで希釈した200ナノグラムの百日咳毒

光干渉断層撮影法によるレシピエント動物のin vivo網膜イメージングのために、イメージングの5分前に、片眼あたり1%トロピカミドの1滴で瞳孔を拡張し、ヒートマットをオンにします。 マウスをイメージングシリンダーに置き、それに応じて麻酔の流れをリダイレクトします。0.3%ヒドロキシプロピルメチルセルロースで目を保護して湿潤に保ち、屈折の連続性を確保し、検査する目にカスタムコンタクトレンズを置きます。

赤外線眼底画像に導かれて、ビームが視神経乳頭の中心に来るように注意しながら、レンズで覆われた目にレーザーを向けます。高解像度モードで25回のBスキャンを実行し、30回の平均Aスキャンから画像をラスタライズします。両眼をイメージングした後、コンタクトレンズを眼科用ジェルと交換し、マウスを温かい回復ケージに入れます。

自動セグメンテーション用のモジュール式イメージングソフトウェアを使用して取得した画像を解析するには、まず、内側の限界膜と内側の網状層に対応するセグメントを手動で補正して、内側の網膜層の限界を表します。次に、網膜神経線維と神経節細胞層が内側の網膜層の範囲内に存在し、それらが重なっていないことを確認します。病原性T細胞エピトープを含むAQP4ペプチドによる皮下免疫は、野生型T細胞応答と比較して、AQP4ノックアウトマウスのドレナージリンパ節において強力な増殖性T細胞応答を誘発します。

個々のVβ発現のフローサイトメトリー解析により、病原性T細胞エピトープを含むAQP4ペプチドに特異的なT細胞が独自のTCRレパートリーを利用し、これらの決定因子に対する病原性T細胞の応答が胸腺のネガティブセレクションによって通常調節されていることを示す選択的過剰増殖が実証されています。分極T細胞注射の約6〜9日後、レシピエントマウスのほぼ全員が、足を引きずる尾部や後肢麻痺などのCNS自己免疫疾患の臨床徴候を発症しました。Th17分極AQP4特異的T細胞は、Th1分極AQP4特異的T細胞よりも重篤な臨床疾患を誘発します。

例えば、このマウスは、Th17分極AQP4ペプチド特異的T細胞の投与後に完全な後肢麻痺を発症しました。AQP4ペプチド特異的Th17細胞によって誘発される臨床疾患は、CNS実質および髄膜への単核細胞の浸潤、ならびに視神経の炎症にも関連しており、これはさらに、マウスが病気から回復するにつれてベースラインに戻る内側の網膜層の腫脹および厚さの増加によって証明される。このビデオを見た後、AQP4を標的とした自己免疫を誘導および監視する方法を十分に理解しているはずであり、これにより、T細胞が視神経脊髄炎にどのように関与しているかを理解するためのさらなる研究が可能になります。