Name: クロマチン免疫沈降 (チップ) プロトコル低豊富な胚サンプル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: 学ぶ 低豊度ニワトリ胚サンプル用のChIPおよびChIP-seqライブラリ調製プロトコル。ヒストン修飾の結合プロファイルを解析し、脊椎動物ゲノムの機能注釈を向上させる方法です。発生生物学研究に有用です。

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著者は、このプロトコルの確立の間に彼の優秀なテクニカル サポート 1 月アペルをありがとうございます。Rada イグレシアス研究室で作業に支えられて CMMC 学内資金、DFG 研究助成 (RA 2547/1-1、RA 2547/2-1、および TE 1007/3-1)、カタルーニャ ・ オープン大学上級研究員グループ Grant、および CECAD グラント。

<ol><li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li>
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<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+chromatin+signature+uncovers+early+developmental+enhancers+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans.</a> Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).</li>
<li>Creyghton, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K27ac+separates+active+from+poised+enhancers+and+predicts+developmental+state%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 107 (50), 21931-21936 (2010).</li>
<li>Benayoun, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K4me3+breadth+is+linked+to+cell+identity+and+transcriptional+consistency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">H3K4me3 breadth is linked to cell identity and transcriptional consistency.</a> Cell. 158 (3), 673-688 (2014).</li>
<li>Rehimi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenomics-Based+Identification+of+Major+Cell+Identity+Regulators+within+Heterogeneous+Cell+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Epigenomics-Based Identification of Major Cell Identity Regulators within Heterogeneous Cell Populations.</a> Cell Rep. 17 (11), 3062-3076 (2016).</li>
<li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li>
<li>Valouev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+transcription+factor+binding+sites+based+on+ChIP-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data.</a> Nat Methods. 5 (9), 829-834 (2008).</li>
<li>Dahl, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+histone+H3K4me3+domains+in+mouse+oocytes+modulate+maternal-to-zygotic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition.</a> Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nat Biotech. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPmentation%3A+fast%2C+robust%2C+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+reprogramming+of+the+histone+modification+H3K4me3+in+early+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development.</a> Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dynam%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Dev Dynam. 195 (4), 231-272 (1951).</li>
<li>Ho, J. W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+metazoan+chromatin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of metazoan chromatin organization.</a> Nature. 512 (7515), 449-452 (2014).</li>
<li>Calo, E., Wysocka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+enhancer+chromatin%3A+what%2C+how%2C+and+why%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Modification of enhancer chromatin: what, how, and why?</a> Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).</li>
<li>Spitz, F., Furlong, E. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors%3A+from+enhancer+binding+to+developmental+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcription factors: from enhancer binding to developmental control.</a> Nat Rev Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).</li>
</ol>

著者には、開示すること、競合する金銭的な利益はありません。

エピゲノム チップ seq を使用してヒストン修飾のプロファイリングは、異なる携帯電話4,5,18で脊椎動物のゲノムの機能アノテーションを改善するために使用できます。これらエピゲノム プロファイルは使用できます、他のものの間でエンハンサー エンハンサー (すなわち、アクティブ、プライミング、または構え)、規制の状態を定義し、異なる生物の主要な細胞アイデンティティ レギュレータを定義する要素を識別するためにまたは病理学的コンテキスト (例えば、広い H3K4me3 プロモーター ドメインおよびスーパー エンハンサー)6,7,9,10、<sup ...

ヒストン翻訳後修飾は、転写、複製 DNA 修理1,2,3など、さまざまなクロマチンに依存するプロセスに直接関与しています。さらに、異なるヒストン修飾を示す正 (などH3K4me3 と H3K27ac) または負 (例えばH3K9me3 と H3K27me3) 遺伝子の発現との相関と広く定義することができます活性化または抑圧的なヒストンをマークしたようそれぞれ2,3。その結果、全体的なヒストン修飾マップ、エピゲノム マップとも呼ばれますが、機能的脊椎動物のゲノム4、5の注釈に強力で普遍的なツールとして浮上しています。たとえば、遠位規制エンハンサーを識別できるように基づく系列クロマチンの特定の存在 (例えば、アクティブなエンハンサー: H3K4me1 と H3K27ac)、近位プロモーター領域からそれらを区別する (など活性プロモーター: H3K4me3)6,7,8。その一方で、主要な細胞アイデンティティの規定する機能を持つ遺伝子、通常、広範なクロマチン ドメインそれぞれ根本的な遺伝子の転写活性アクティブまたは非アクティブの状態に応じて H3K4me3 と H3K27me3、マーク9 で発見します。 ,10。同様に、主要な細胞アイデンティティ遺伝子発現クラスター化エンハンサー (すなわち、超エンハンサー) 広範な H3K27ac マーク ドメイン11として識別することができます複数のと空間的に制御する頻繁にようであります。
現在、ヒストン修正図を生成する技術を使用してチップ seq チップ (チップ マイクロ アレイに結合) などの従来のアプローチと比較して高い解像度、ノイズ、大きい範囲、および下位以下の少ないアーティファクトを提供しますコスト12。それにもかかわらず、エピゲノム マップ チップ seq 技術を使用しての世代が関心のサンプル チップを正常に実行する能力と大抵関連付けられるその固有の限界あります。伝統的なチップ プロトコルは通常細胞の培養系にこの法の適用性線またはセル範囲が制限簡単に分離できます生体内で(例えば、血液細胞) 細胞の数百万を必要です。ここ数年で低細胞数と互換性のあるチップ プロトコルの修正の数は説明13,14,15,16をされています。ただし、これらのプロトコルを次世代シーケンス (すなわち、チップ seq) と結合される設計、彼らは通常アドホック図書館準備方法13,14,を使用15,16。
ここでは、我々 は中間に低細胞数 (5 × 104 - 5 x 10 の5セル) を使用して、ヒストン変更プロファイルを調査するためチップ プロトコルを記述した (すなわち、チップ qPCR) いずれかの選択した軌跡またはグローバル (すなわち、チップ seq) (図 1)。チップ seq 技術を組み合わせることで、当社のチップ プロトコルは標準ライブラリの製法をできるようになり、多くの研究所10に幅広くアクセスと共に使用できます。このプロトコルは、いくつかのヒストンを調査に使用されている(例えば、 H3K4me3、H3K27me3、および H3K27ac) 異なる鶏胚組織 (例えば、脊髄神経管 (SNT)、成人プロミネンスと胚盤葉上層) で。ただし、少量で、生物学的および臨床的に関連するサンプルをだけ得ることが他の生物に広く適用されると見込んでください。

<table><tbody><tr><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA粉末</td>カール<td>ロス</td><td>3737.3</td><td></td></tr><tr><td>リン酸生理食塩水緩衝液(PBS)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>D8537</td><td></td></tr>トリ<tr><td>スHCL pH 8.0</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>T1503NaCl</td><td></td></tr><tr><td></td><td>カールロス</td><td>3957.2EDTA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>カールロス</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>カールロス</td><td>3054.2</td><td></td></tr><tr><td>Na-デオキシコール酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>D6750-24</td><td></td></tr><tr><td>N-ラウロイルサルコシン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>61743-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Applichem</td><td>A3724,0250</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td>カール<td>ロス</td><td>3739.2</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>I3021-100ml</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Carl Roth</td><td>1833</td><td></td></tr><tr><td>Protein G/magnetic beads</td><td>Invitrogen</td><td>1004D</td><td></td></tr><tr><td>37% ホルムアルデヒド</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252549-1L</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>Peqlab</td><td>12-RA-03</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46.35 E</td><td></td></tr><tr><td>Na-酪酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>SLB2659V</tr><tr><td>プロテイナーゼ阻害剤</td><td>ロシュ</td><td>5892791001</td><td></td></tr><tr><td>SYBRgreen ミックス</td><td>バイオザイム</td><td>617004</td><td></td></tr><tr><td>dH2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>1 Kb ラダー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>SM1333</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Sigma Alrich</td><td>03756-25</td><td></td></tr><tr><td>アガロー</td><td>ス Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>0.25% トリプシン-EDTA (1x)</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>オクチルフェノールエトキシレート (トリトン X 100)</td><td>Roth</td><td>3051.4</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (ダルベッコ&acute;Modified Eagle Medium)</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>Gel loading tips Multiflex</td><td>A.Hartenstein</td><td>GS21</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Plates</td><td>Sarstedt</td><td>721,985,202</td><td></td></tr><tr><td>384 well</td><td>Sarstedt</td><td>721,985,202</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72,706</td><td></td></tr><tr><td>100 - 1,000 &micro;L フィルターチップ</td><td>Sarstedt</td><td>70,762,211</td><td></td></tr><tr><td>2 - 20 &micro;L フィルターチップ</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,213</td><td></td></tr><tr><td>2 - 200 &micro;L フィルターチップ</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,211</td><td></td></tr><tr><td>0.5 - 10 &micro;L フィルターチップ</td><td>Sarstedt</td><td>701,116,210</td><td></td></tr><tr><td>H3K27me3 抗体</td><td>Active Motif</td><td>39155</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac antibody</td><td>Active Motif</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me3 antibody</td><td>Active Motif</td><td>39159</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me2 antibody</td><td>Active Motif</td><td>39141</td><td></td></tr><tr><td>End Repair Mix</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>常磁性ビーズ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>再懸濁バッファー</td><td>イルミナ</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>A-テーリングミックス</td><td>イルミナ</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>ライゲーションミックス</td><td>イルミナ</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>RNAアダプターインデックス</td><td>イルミナ</td><td>RS-122-2101</td><td></td></tr><tr><td>ライゲーションバッファー</td><td>イルミナ</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>PCR プライマーカクテル</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Enhanced PCR Mix</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>ゲノム DNA ラダー</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>溶出バッファー</td><td>Agilent</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>サンプルバッファー</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>ライブラリ定量キット</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4835 &ndash; 07960204001</td><td></td></tr><tr><td>肥沃な鶏の白い卵</td><td>LSL Rhein Main</td><td>KN: 15968</td><td></td></tr><tr><td>針 (Neoject)</td><td>A.Hartenstein</td><td>10001</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ (Ecoject 10 mL)</td><td>Dispomed witt oHG</td><td>21010</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>会社名</td><td>strongカタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Hermle</td><td>Z 216 MK</td><td></td></tr><tr><td>サーモシェーカー</td><td>ITABIS</td><td>MKR13</td><td></td></tr><tr><td>ソニケーター</td><td>アクティブモーティブ</td><td>エピシアープローブ ソニケーター ソニケー</td><td></td></tr><tr><td>ター</td><td>ダイアゲノード</td><td>バイオラプタープラス</td><td></td></tr><tr><td>ローテーター</td><td>スチュアート</td><td>SB3</td><td></td></tr><tr><td>可変容量(5 &ndash;1,000 &MU;L) ピペット</td><td>エッペンドルフ</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>タイマー</td><td>シグマ</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>マグネットホルダー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>DynaMag-2 12321D</td><td></td></tr><tr><td>テーブルスピナー</td><td>ヒースロー サイエンティフィック</td><td>スプラウト</td><td></td></tr><tr><td>ミキサー</td><td>LMS</td><td>VTX 3000L</td><td></td></tr><tr><td>リアルタイムPCRサイクラー</td><td>ロシュ</td><td>ライトサイクラー;シリアルNr.5662</td><td></td></tr><tr><td>PCRサイクラー</td><td>Applied Biosystems</td><td>Gene Amp PCRシステム 9700</td><td></td></tr><tr><td>DNAおよびRNA品質管理システム</td><td>Agilent</td><td>Agilent 4200 TapeStationシステム</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td></td><td>Dumont 5-Inox-H</td><td></td></tr><tr><td>穴あきスプーン</td><td>世界の精密機器</td><td>501997</td><td></td></tr></tbody></table>

クロマチン免疫沈降 (チップ) プロトコル低豊富な胚サンプル

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

クロマチン免疫沈降 (チップ) は、クロマチン修飾酵素特定の軌跡やゲノム規模で、転写因子やヒストン ファーストクリーニング変更されたヒストンのローカリゼーションをマッピングするための広く使われている手法です。次世代シーケンス (すなわち、チップ Seq) とチップ試金の組み合わせは、遺伝子制御ネットワークを世界的に明らかにして特に規制の非コーディング シーケンスのゲノムの機能アノテーションを改善する強力なアプローチです。チップ プロトコルは通常多量の細胞材料、従ってまれなセルタイプまたは小さい組織生検の調査にこの法の適用性を排除を必要です。チップ試金を初期脊椎動物胚体内で通常得られる生物学的材料の量に対応するために、するために述べるここでチップの簡易プロトコルを完了するために必要なステップ数、アッセイは、サンプルの損失を最小限に抑えるために減少しました。このチップ プロトコルは様々 なニワトリ胚および成体組織中細胞数 (5 × 104 - 5 x 10 の5セル) に低の異なるヒストン修飾を調査するため正常に使用されています。重要なは、このプロトコルは標準ライブラリの作製法を用いたチップ seq 技術と互換性のある、関連性の高い萌芽期ティッシュのマップ グローバル エピゲノムを提供します。

チップ seq 実験 HH19 鶏の胚からプールの SNT セクションを使用して、HH22 の上顎突起鶏胚との結合プロファイルを調査する段階 HH3 鶏胚を行ったチップ プロトコルのパフォーマンスを示すためには、各種のヒストンの修正は (すなわちH3K4me2、H3K27ac、H3K4me3、および H3K27me3)。チップ Dna が得られた後、超音波処理効率は対応する入力 Dna (図 3) のアガロース電気泳動で評価しました。チップと入力の Dna は遺伝子座のバインドまたは調査のヒストンの修正 (図 4 a) で非連結予想で濃縮を測定するチップ qPCR 解析に使用されました。図 4 aH3K27me3、H3K4me3 濃縮の例 HH19 SNT のセクションでレベルは SOX17、SOX2、非アクティブ、アクティブ、SNT では、それぞれ 2 つの遺伝子のプロモータ...

ここでは、クロマチン免疫沈降 (チップ) と低豊富な鶏胚サンプルからグローバル エピゲノム プロファイルを生成するチップ seq ライブラリの準備のプロトコルについて述べる。

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

この手順の全体的な目標は、脊椎動物ゲノムの機能アノテーションを改善するために、少量の胚サンプルを使用して、さまざまなヒストン修飾の結合プロファイルを調査することです。この方法は、特定の胚組織の同一性を定義する主要なエンハンサーと遺伝子は何かなど、発生生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、限られた量の特定の材料が必要であり、局所特異的解析とゲノムワイド解析の両方にも使用できることです。この方法は、転写制御や胚組織との細胞の不均一性に関する洞察を得ることができますが、特許サンプルなどの他のシステムにも適用できます。この実験のニワトリ胚であるHH19期を取得するには、摂氏37度、湿度80%の水平向きで3日間、肥沃な白いレグホーン鶏の卵をインキュベートします。HH19胚の分離を開始するには、10ミリメートル注射器で3ミリリットルのアルブミンを抽出して胚盤葉を下げることにより、胚にアクセスできるようにします。余分な胚膜を取り除くには、細いハサミを使って目に小さな穴を開けます。1ミリリットルのロック溶液を追加します。曲げた針の助けを借りて、0.5ミリリットルのインド黒インクを追加します。細い手術用ハサミと鉗子を使用して、胚を囲む余分な胚膜を切り取ります。次に、穴のあいたスプーンで胚を20ミリリットルのPBS溶液を含む4.5センチメートルのペトリ皿に移します。実体顕微鏡で氷の上で作業し、細かいハサミと鉗子を使用して、羊膜と余分な胚膜の残りの部分を解剖して廃棄します。次に、横方向の脊髄神経管またはSNTセグメントを胚の上腕レベルで切断します。解剖を尾側に胸部に伸ばして、SNTを分離します。最後に、鉗子を使用して、SNTを横方向および腹側に取り囲む組織を切除します。SNTを単離した後、摂氏37度の温かいトリプシンを含む3.5cmのシャーレに各セグメントを浸します。実体顕微鏡でSNT周辺の非神経組織の緩みが見られる場合は、サンプルを冷たくした1x PBSに移します。トリプシン化を止めるには、10%FBSを含むコールドDMEMを使用して、サンプルを新しいディッシュに移します。鉗子を使用して、SNTから残りの間葉系組織と外胚葉組織を手動で除去します。このきれいなSNT切片を1.5ミリリットルのチューブに移し、液体窒素で急速凍結します。次に、テキストプロトコルに従って組織を均質化します。13.5マイクロリットルの37%ホルムアルデヒドを加え、ローテーター上で室温で15分間インキュベートします。ホルムアルデヒドを急冷するには、25マイクロリットルの2.5モルグリシンをチューブに加え、ローテーター上で室温で10分間インキュベートします。チューブを遠心分離し、テキストプロトコルに従ってペレットを洗浄します。架橋後、ペレットを300マイクロリットルの氷冷した完全な溶解緩衝液にピペッティングして再懸濁します。サンプルを摂氏4度でロッキングプラットフォーム上で10分間インキュベートします。次に、サンプルを摂氏4度で超音波処理します。超音波処理後、サンプルを摂氏4度で16, 000 x Gで10分間遠心分離します。上清またはライセートを新しい1.5ミリリットルのチューブに移し、細胞残渣ペレットを廃棄します。テキストプロトコルに従ってライセートを希釈します。次に、各サンプルの少量のアリコートをインプットコントロールとして保持し、摂氏20度で凍結します。クロマチン沈殿またはチップにかけられる残りのサンプルを、テキストプロトコルに従って適切な抗体でインキュベートします。次に、300 μリットルの抗体結合クロマチンを、以前に洗浄した磁気ビーズに加えます。チューブを反転させてサンプルを混合します。抗体をビーズに結合させるには、チューブをチューブローテーターに置き、摂氏4度で最低4時間垂直に回転させます。クロマチン結合ビーズを洗浄するには、氷上に保持したチューブに氷冷したRIPA洗浄バッファー1ミリリットルを加え、チューブを反転またはフリックして混合します。チューブを室温で磁気ホルダーに入れた後、ビーズが側面に沈殿するのを待ちます。透明な液体を注ぎ、この洗浄をさらに3回繰り返します。チューブに1ミリリットルのTE 50ミリモル塩化ナトリウムを加えた後、この溶液中のクロマチン結合ビーズを新しい1.5ミリメートル微量遠心チューブに移します。チューブを磁気ホルダーに入れ、ビーズが落ち着いたら、液体を注ぎます。次に、予冷した遠心分離機でビーズを900 x G、摂氏4度で3分間遠心分離します。ビーズがマグネットホルダーに落ち着いたら、ゲルローディングチップを使用して残りのTEをすべて取り出します。室温で作業し、210 μLの溶出バッファーをビーズに加え、フリックして再懸濁します。予め温めたヒートブロックに65°Cでチューブを15分間、振とうしながらインキュベートします。インキュベーション後、ビーズでチューブを室温で16, 000 x Gで1分間遠心分離します。ビーズが磁気ホルダーに落ち着いたら、上清を新しい微量遠心チューブに移します。以前に凍結したインプットコントロールサンプルを摂氏20度から室温まで解凍します。90 μLの溶出バッファーをサンプルに加え、短時間ボルテックスして混合します。架橋を逆転させるには、チップをインキュベートし、サンプルを摂氏65度で一晩中制御します。室温で作業し、チューブごとに 1 容量の TE バッファーを加え、反転して混合します。RNAを消化するには、RNAse Aをコントロールに加え、チップサンプルを最終濃度0.2ミリグラム/ミリリットルまで戻し、チューブを反転させて混合します。予熱したヒートブロックに37°Cでチューブを2時間インキュベートします。その後のDNA精製のためにタンパク質を消化するには、プロテアーゼKを最終濃度0.2ミリグラム/ミリリットルまでチューブに加え、チューブを反転させて混合します。予め温めたヒートブロックに55°Cでチューブを2時間インキュベートします。補足資料に従ってDNAを抽出し、精製します。このDNAは、現在、定量的PCRおよびチップシークライブラリ調製に使用できます。チップを成功させるために不可欠な超音波処理効率は、インプットコントロールサンプルのアガロースゲル電気泳動によって確認されます。この例では、ニワトリ脊髄神経管またはSNT切片を用いて、11回の超音波処理サイクルを用いて、200〜500塩基対の範囲の最適なフラグメントサイズを得た。チップ化されたDNAを定量的PCRによって分析し、ニワトリSNTで活性および不活性な遺伝子のプロモーター領域周辺の活性化および抑制ヒストンマークの濃縮レベルを測定しました。これは、さらなる分析のために多くのDNAを失うことなく、いくつかのローサイドのみを定量化することにより、欠けた品質を評価することが可能であることを示しています。チップシークライブラリーを順次調製した後、ニワトリSNTで生成されたH3K27 tri methylationおよびH3K4 tri methylation chip seekデータについて、代表的なイナゴを示します。同様のチップシークプロファイルは、上顎隆起やステージHH3胚などの異なるニワトリ胚組織でも成功裏に生成されました。これは、ここで提示するチッププロトコルを使用して、限られた量のさまざまな胚組織からエピゲノムプロファイルを生成できることを示しています。このプロトコルを使用して胚組織におけるヒストン修飾プロファイルを生成することにより、シグナルはそのような組織に存在するすべての異なる細胞タイプから来ることを覚えておくことが重要です。このプロトコルに従い、より多くの出発生物学的材料を使用することで、転写因子、共活性化因子、RNAポリメラーゼ2サブユニットなど、転写調節に関与する他のタンパク質の結合プロファイルを調査することが可能になるはずです。これらのプロトコルが確立されると、発生生物学や遺伝医学の分野の研究者は、脊椎動物のゲノムの機能変化を改善し、筋形成、進化、ヒト疾患の分子基盤に関する重要な洞察を得ることができます。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

ESCの分化は、細胞型特異的構造の変化とクロマチンの構成と一致している。これらの変更の検出はstemcellnessと細胞分化を定義するメカニズムが貴重な洞察を提供します。クロマチン免疫沈降（ChIP）は、幹細胞の分化の分子メカニズムを解明する貴重な方法を表します。...

ヒト胚性幹細胞からクロマチン免疫沈降

我々はマウス胚組織における組織特異的遺伝子発現の開始中または後に組織特異的遺伝子に要因の相互作用を識別するために、クロマチン免疫沈降（ChIP）法を示しています。それは正常な胚発生時に発生するとして、このプロトコルは、組織特異的遺伝子の活性化の研究に広く適用可能であるべきである。...

初期段階のマウス胚を用いて組織特異的遺伝子のためのクロマチン免疫沈降アッセイ

我々は、一次T細胞を用いたクロマチン免疫沈降のための堅牢な方法が記載されている。メソッドは、標準的なアプローチの上に成り立ったが、細胞の数量限定のために効率を改善条件や試薬の特定のセットを使用しています。重要なことは、データ分析段階の詳細な説明が提示される。...

バイオマスの制限額を使用して効率的なクロマチン免疫沈降

クロマチン免疫沈降法と超高スループットシーケンシング（チップ-SEQ）の組み合わせは、所定の組織または細胞株におけるタンパク質-DNA相互作用を特定し、マッピングすることができます。概説としては、例えば、転写因子TCF7L2の経験を使用して、その後の配列決定のための高品質のChIPテンプレートを生成する方法である。...

ハイスループットシーケンシングのための高品質クロマチン免疫沈降DNAテンプレート（チップ-SEQ）の生成

生体内でゲノムにどのような影響を与えるかクロマチン制御因子とクロマチンの状態の問題は、細胞運命決定が発生中の胚になっている様子を、早期の我々の理解の鍵である。 ChIPの-SEQ-グローバルレベル-さアフリカツメガエル胚のためにここで概説でクロマチンの機能を調査するための最も一般的なアプローチ。...

クロマチンレギュレータと米国でのゲノムワイドスナップショット<em&gt;アフリカツメガエル</emChIPの-配列によって&gt;胚

遺伝子転写の微調整規制が胚細胞の運命決定の基礎となります。ここで、我々は、幹細胞およびマウス胚の心臓の開発の両方心臓分化のエピジェネティックな調節を調査するために使用されるクロマチン免疫沈降アッセイを記載します。...

胚性幹細胞や組織の心臓分化のエピジェネティック制御

ここでは、チップ Seq を実行する方法について記述して ES 細胞の CARIP-Seq、次世代シーケンシング ライブラリ準備も含めて世界的なエピゲノムとクロマチン関連 RNA...

CARIP Seq とチップ Seq: クロマチン結合 Rna および胚性幹細胞における蛋白質 DNA 相互作用を識別する方法

ここの褐色脂肪組織 (BAT) マウスから分離した高スループット DNA シーケンス (チップ seq) 続いて効率的なクロマチン免疫沈降 (チップ)...

マウスの褐色脂肪組織のクロマチン免疫沈降

クロマチン免疫沈殿(ChIP)は、遺伝子調節の分子機構を理解するための強力なツールです。しかしながら、この方法は、機械的せん断による再現性クロマチン断片化を得ることに困難を伴う。ここでは、酵素消化を用いたChIPアッセイの改良されたプロトコルを提供する。...

哺乳類細胞における微小コッカルヌクレアーゼを用いてクロマチン免疫沈殿アッセイ

本論文では、ChIP液体ハンドラプラットフォームを用いた特定のヒストン修飾(H3K27ac)に関連するDNA領域の半自動マイクロスケールのChIP-Seqプロトコルについて説明し、続いてタグメンテーションを用いたライブラリ調製について述べている。この手順には、品質と量の目的に対する制御評価が含まれており、他のヒストン修飾または転写因子に採用することができます。...

大規模エピジェネティック研究のための半自動化されたChIP-Seq法

このプロトコルは、スナップ凍結組織からのクロマチン調製に焦点を当てており、架橋クロマチン免疫沈降(X-ChIP)とそれに続く定量的PCR分析(X-ChIP-qPCR)または次世代シーケンシングアプローチ(X-ChIP-seq)のいずれかに適しています。...

クロマチン免疫沈降分析のための凍結キメラ肝臓組織からのクロマチン抽出

学ぶ 低豊度ニワトリ胚サンプル用のChIPおよびChIP-seqライブラリ調製プロトコル。ヒストン修飾の結合プロファイルを解析し、脊椎動物ゲノムの機能注釈を向上させる方法です。発生生物学研究に有用です。

クロマチン免疫沈降 (チップ) プロトコル低豊富な胚サンプル

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