クロマチン免疫沈降 (チップ) プロトコル低豊富な胚サンプル

この手順の全体的な目標は、脊椎動物ゲノムの機能アノテーションを改善するために、少量の胚サンプルを使用して、さまざまなヒストン修飾の結合プロファイルを調査することです。この方法は、特定の胚組織の同一性を定義する主要なエンハンサーと遺伝子は何かなど、発生生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、限られた量の特定の材料が必要であり、局所特異的解析とゲノムワイド解析の両方にも使用できることです。

この方法は、転写制御や胚組織との細胞の不均一性に関する洞察を得ることができますが、特許サンプルなどの他のシステムにも適用できます。この実験のニワトリ胚であるHH19期を取得するには、摂氏37度、湿度80%の水平向きで3日間、肥沃な白いレグホーン鶏の卵をインキュベートします。HH19胚の分離を開始するには、10ミリメートル注射器で3ミリリットルのアルブミンを抽出して胚盤葉を下げることにより、胚にアクセスできるようにします。

余分な胚膜を取り除くには、細いハサミを使って目に小さな穴を開けます。1ミリリットルのロック溶液を追加します。曲げた針の助けを借りて、0.5ミリリットルのインド黒インクを追加します。

細い手術用ハサミと鉗子を使用して、胚を囲む余分な胚膜を切り取ります。次に、穴のあいたスプーンで胚を20ミリリットルのPBS溶液を含む4.5センチメートルのペトリ皿に移します。実体顕微鏡で氷の上で作業し、細かいハサミと鉗子を使用して、羊膜と余分な胚膜の残りの部分を解剖して廃棄します。

次に、横方向の脊髄神経管またはSNTセグメントを胚の上腕レベルで切断します。解剖を尾側に胸部に伸ばして、SNTを分離します。最後に、鉗子を使用して、SNTを横方向および腹側に取り囲む組織を切除します。

SNTを単離した後、摂氏37度の温かいトリプシンを含む3.5cmのシャーレに各セグメントを浸します。実体顕微鏡でSNT周辺の非神経組織の緩みが見られる場合は、サンプルを冷たくした1x PBSに移します。トリプシン化を止めるには、10%FBSを含むコールドDMEMを使用して、サンプルを新しいディッシュに移します。

鉗子を使用して、SNTから残りの間葉系組織と外胚葉組織を手動で除去します。このきれいなSNT切片を1.5ミリリットルのチューブに移し、液体窒素で急速凍結します。次に、テキストプロトコルに従って組織を均質化します。

13.5マイクロリットルの37%ホルムアルデヒドを加え、ローテーター上で室温で15分間インキュベートします。ホルムアルデヒドを急冷するには、25マイクロリットルの2.5モルグリシンをチューブに加え、ローテーター上で室温で10分間インキュベートします。チューブを遠心分離し、テキストプロトコルに従ってペレットを洗浄します。

架橋後、ペレットを300マイクロリットルの氷冷した完全な溶解緩衝液にピペッティングして再懸濁します。サンプルを摂氏4度でロッキングプラットフォーム上で10分間インキュベートします。次に、サンプルを摂氏4度で超音波処理します。

超音波処理後、サンプルを摂氏4度で16, 000 x Gで10分間遠心分離します。上清またはライセートを新しい1.5ミリリットルのチューブに移し、細胞残渣ペレットを廃棄します。テキストプロトコルに従ってライセートを希釈します。

次に、各サンプルの少量のアリコートをインプットコントロールとして保持し、摂氏20度で凍結します。クロマチン沈殿またはチップにかけられる残りのサンプルを、テキストプロトコルに従って適切な抗体でインキュベートします。次に、300 μリットルの抗体結合クロマチンを、以前に洗浄した磁気ビーズに加えます。

チューブを反転させてサンプルを混合します。抗体をビーズに結合させるには、チューブをチューブローテーターに置き、摂氏4度で最低4時間垂直に回転させます。クロマチン結合ビーズを洗浄するには、氷上に保持したチューブに氷冷したRIPA洗浄バッファー1ミリリットルを加え、チューブを反転またはフリックして混合します。

チューブを室温で磁気ホルダーに入れた後、ビーズが側面に沈殿するのを待ちます。透明な液体を注ぎ、この洗浄をさらに3回繰り返します。チューブに1ミリリットルのTE 50ミリモル塩化ナトリウムを加えた後、この溶液中のクロマチン結合ビーズを新しい1.5ミリメートル微量遠心チューブに移します。

チューブを磁気ホルダーに入れ、ビーズが落ち着いたら、液体を注ぎます。次に、予冷した遠心分離機でビーズを900 x G、摂氏4度で3分間遠心分離します。ビーズがマグネットホルダーに落ち着いたら、ゲルローディングチップを使用して残りのTEをすべて取り出します。

室温で作業し、210 μLの溶出バッファーをビーズに加え、フリックして再懸濁します。予め温めたヒートブロックに65°Cでチューブを15分間、振とうしながらインキュベートします。インキュベーション後、ビーズでチューブを室温で16, 000 x Gで1分間遠心分離します。

ビーズが磁気ホルダーに落ち着いたら、上清を新しい微量遠心チューブに移します。以前に凍結したインプットコントロールサンプルを摂氏20度から室温まで解凍します。90 μLの溶出バッファーをサンプルに加え、短時間ボルテックスして混合します。

架橋を逆転させるには、チップをインキュベートし、サンプルを摂氏65度で一晩中制御します。室温で作業し、チューブごとに 1 容量の TE バッファーを加え、反転して混合します。RNAを消化するには、RNAse Aをコントロールに加え、チップサンプルを最終濃度0.2ミリグラム/ミリリットルまで戻し、チューブを反転させて混合します。

予熱したヒートブロックに37°Cでチューブを2時間インキュベートします。その後のDNA精製のためにタンパク質を消化するには、プロテアーゼKを最終濃度0.2ミリグラム/ミリリットルまでチューブに加え、チューブを反転させて混合します。予め温めたヒートブロックに55°Cでチューブを2時間インキュベートします。

補足資料に従ってDNAを抽出し、精製します。このDNAは、現在、定量的PCRおよびチップシークライブラリ調製に使用できます。チップを成功させるために不可欠な超音波処理効率は、インプットコントロールサンプルのアガロースゲル電気泳動によって確認されます。

この例では、ニワトリ脊髄神経管またはSNT切片を用いて、11回の超音波処理サイクルを用いて、200〜500塩基対の範囲の最適なフラグメントサイズを得た。チップ化されたDNAを定量的PCRによって分析し、ニワトリSNTで活性および不活性な遺伝子のプロモーター領域周辺の活性化および抑制ヒストンマークの濃縮レベルを測定しました。これは、さらなる分析のために多くのDNAを失うことなく、いくつかのローサイドのみを定量化することにより、欠けた品質を評価することが可能であることを示しています。

チップシークライブラリーを順次調製した後、ニワトリSNTで生成されたH3K27 tri methylationおよびH3K4 tri methylation chip seekデータについて、代表的なイナゴを示します。同様のチップシークプロファイルは、上顎隆起やステージHH3胚などの異なるニワトリ胚組織でも成功裏に生成されました。これは、ここで提示するチッププロトコルを使用して、限られた量のさまざまな胚組織からエピゲノムプロファイルを生成できることを示しています。

このプロトコルを使用して胚組織におけるヒストン修飾プロファイルを生成することにより、シグナルはそのような組織に存在するすべての異なる細胞タイプから来ることを覚えておくことが重要です。このプロトコルに従い、より多くの出発生物学的材料を使用することで、転写因子、共活性化因子、RNAポリメラーゼ2サブユニットなど、転写調節に関与する他のタンパク質の結合プロファイルを調査することが可能になるはずです。これらのプロトコルが確立されると、発生生物学や遺伝医学の分野の研究者は、脊椎動物のゲノムの機能変化を改善し、筋形成、進化、ヒト疾患の分子基盤に関する重要な洞察を得ることができます。