ヒト NK 細胞活性の評価の流れのフローサイトメトリーを用いた細胞毒性の試金

本手順の全体的な目的は、ヒトNK細胞の細胞毒性活性を評価することです。この手法は、機能的または古典的なNK細胞欠損症の患者のモニタリングに使用できます。このフローサイトメトリーに基づく手法の主な利点は、感度が高く、再現性があり、放射性クロム放出試験などの標準的なNK細胞機能評価法よりも迅速であることです。

この手法は、新規のNK細胞標的療法を試験する場合や、これまで困難であったNK細胞生物学における詳細なマルチパラメーターフローサイトメトリー解析を行う場合に利用可能です。まず、標準的なプロトコルに従い、密度勾配分離を用いて全血サンプルから末梢血単核細胞（PBMC）を分離します。臨床検体を扱う際は、精製したNK細胞ではなくPBMCを使用することが非常に有効です。

分離した細胞を完全培地で5 × 10⁶ cells/mLの濃度に希釈し、直ちに遠心分離によってK562ターゲット細胞を回収します。5 × 10⁵個のK562細胞を、1% FBSを添加した500 µLの新鮮な培地で再懸濁します。次に、500 µLのCFSEワーキングソリューションを用いてターゲット細胞をラベルし、ピペッティングを3〜5回行い、細胞溶液を穏やかに混合します。

遮光条件下で37°Cで10分間置いた後、完全培地10 mLを添加し、室温・暗所にて10分間反応を停止させます。停止 incubation の終了後、遠心分離により細胞を回収し、計数のため標識した標的細胞ペレットを完全培地1 mLで再懸濁します。次に、新鮮な完全培地を用いて細胞濃度を1 × 10⁵ cells/mLに希釈し、標的細胞を湿潤環境の37°C、5% CO₂インキュベーターに入れます。

アッセイを成功させるために、標的細胞へのストレスを最小限に抑え、エフェクター細胞を回収後できるだけ早くテストしてください。標的細胞の標識から30分以内に、表に従って96ウェルU底組織培養処理プレートに標識を行ってください。次に、エフェクター細胞対標的細胞の比率が25:1、12.5:1、6.25:1のウェル、標的細胞のみのウェル、およびエフェクター細胞のみのウェルに、完全培地を100 µLずつ加えてください。

エフェクター細胞 100 µLを、細胞毒性コントロールウェルおよびエフェクター細胞対標的細胞比が50:1および25:1のウェルに加えます。次に、エフェクター細胞対標的細胞比が25:1のウェルから始めて、標的細胞のみのウェルを飛ばし、次の2つの低濃度比のウェルへ順に細胞 100 µLずつを移送します。なお、各移送の間には十分に混合してください。最後に、残りの細胞 100 µLをエフェクター細胞のみのウェルに加えます。TweenのみのK562死細胞陽性コントロールウェルに、2X 0.2% Tween ワーキングソリューション 100 µLを加えます。

バイアル2のワーキングソリューションを30 µL、NK細胞細胞毒性陽性コントロールウェルに加えてください。次に、1 × 10⁵個/mLに調整したK562標的細胞を、エフェクター細胞のみのウェルを除くすべてのウェルに完全培地100 µLで加えてください。すべての細胞を播種した後、マルチチャンネルピペットを用いてすべてのウェルを混合してください。

短時間の遠心分離で細胞を沈殿させ、プレートを細胞培養インキュベーターに4時間置きます。インキュベーション終了後、プレートを氷上または冷却台の上に置き、各ウェルに調製直後の死細胞染色剤を50 µLずつ加えます。次に、すべてのウェルを静かに混合し、フローサイトメトリーで細胞を解析します。

先ほど実演したように、冷温培養4時間後のCFSEおよび死細胞染色のフローサイトメトリー分析を行うと、「標的細胞のみ」のウェルでは細胞死が15%以下であることがわかります。「エフェクター細胞のみ」のウェルではCFSEシグナルは検出されず、これらのウェルで観察される細胞死は5%未満です。一方で、Tweenを介した標的細胞殺傷ウェルにおける細胞死は、通常85%を超えます。NK細胞機能に欠損がある患者では、健常者と比較して、テストしたほとんどまたはすべての比率で殺傷活性の低下が観察されます。これは、これらの患者由来のNK細胞が、エフェクター細胞と標的細胞の比率の低下に相関して細胞毒性が段階的に減少することを示しています。

この手法を習得すれば、2時間の準備およびプレートへの播種、4時間のインキュベーション、そして30分のデータ取得を含め、合計6時間半で完了させることができます。この手順を実施する際は、細胞の準備から共インキュベーションの開始までのタイムラグを最小限に抑えるため、ターゲット細胞とエフェクター細胞を並行して準備することが重要です。このビデオを視聴することで、フローサイトメトリーを用いて、蛍光標識したターゲット細胞に対するヒトNK細胞の細胞傷害活性を測定する方法について十分に理解できるはずです。