Name: ヒト NK 細胞活性の評価の流れのフローサイトメトリーを用いた細胞毒性の試金 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: 学ぶヒトNK細胞の細胞傷害活性評価法。フローサイトメトリーを用いた迅速で再現性の高いアッセイで、K562標的細胞とPBMCを用い、放射能を使わずにNK細胞機能を定量化します。臨床診断と研究に適用可能です。

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私たちは彼女については原稿を準備するジル ナルシソ、UCLA 免疫遺伝学センターを感謝したいです。

サンプルは、UCLAの人間研究保護プログラムによって確立された倫理ガイドラインに従って収集され、IRBが承認しました。
1. 試薬の調製
注:特に明記されていない限り、すべての試薬は使用前に室温で平衡化する必要があります。すべての試薬は無菌状態でなければなりません。
<ol>
	<li>カルシウムとマグネシウムを含まない5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に10 μLのTween-20溶液をp20ピペットで加え、Tween-20の2倍ワーキング溶液(0.2%)を調製します。
	<ol>
		<li>Tween-20の粘度が高いことを考えると、精度を確保するために次の手順を実行してください:気泡の形成を避けるためにゆっくりと収集し、キャリーオーバーを避けるためにチップ全体を水没させず、PBSで数回上下にピペットで動かしてチップからすべてのTween-20を洗い流します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>198 μL の完全培地 (1:100 希釈) に 2 μL の IL-2 ストック溶液 (2.1E6 IU/mL) を 2 μL 加え、RPMI に 1% ペニシリン-ストレプトマイシンと 10% ウシ胎児血清 (FBS) を加え、さらに 1:100 希釈に進み、2 μL の IL-2 中間溶液を 198 μL の完全培地に加えて 7x ワーキング溶液 (210 IU/mL) を調製します。</li>
	<li>2 μL の CFSE ストック溶液 (5 mM) を 500 μL のプレーン培地 (RPMI) に加えます。ボルテックス、スピンダウンしてキャップから液滴を取り除き、その後、50μLのCFSE中間溶液を950μLのプレーンRPMIに追加してさらに1:20希釈を進め、1μMの2倍ワーキング溶液を得ます。</li>
</ol>
2. PBMCのエフェクター細胞としての単離
注:このアッセイは、健康なコントロールからの総PBMCで効果的に使用することが検証されています。ただし、各PBMC調製物でNK細胞含有量を確認することをお勧めします（図1)。また、採取する全血の量は、末梢全血中のNK細胞の頻度に基づいており、これは人によって、特に健康なドナーと患者の間で異なる場合があります。
<ol>
	<li>ナトリウムまたはリチウムヘパリン化採血管に最低4mLのヒト全血を採取します。.採血時には血液サンプルを室温で保存し、採集から30時間以内に使用してください。</li>
	<li>全血を4 mLのPBSで希釈します(つまり、 全血に等量のPBS。.</li>
	<li>4 mLの密度勾配溶液(材料の表を参照)を15 mLコニカルチューブに加えます。チューブを傾けて、希釈した全血を密度勾配溶液の上に慎重に重ねます。</li>
	<li>ブレーキをオフにして、650 x gで24分間遠心分離します。</li>
	<li>血漿と血小板の最上層の下にある薄い白い層である単核細胞の層を、新しい15mLの円錐管に慎重に集めます。PBSで容量を15mLにします。</li>
	<li>ブレーキをかけた状態で、450 x gで10分間遠心分離します。上清を吸引し、細胞を0.5 mLの完全培地に再懸濁します。</li>
	<li>自動セルカウンターまたは血球計算盤を使用して細胞をカウントし、完全な培地でPBMC濃度を5x106細胞/mLに調整します。</li>
	<li>フローサイトメトリーでNK細胞の含有量を確認します(ステップ4を参照)。</li>
	<li>アッセイを30分以内に開始し、細胞を室温で最大10分間保持するか、使用する準備ができるまで37°Cの加湿5%CO2インキュベーターに入れます。</li>
</ol>
3. エフェクター細胞としてのNK細胞の単離
注:プロトコルのこの部分は、エフェクター細胞として全PBMCを使用する代替手段です。健康な個体からの全血4mLからの典型的な収量は、約4x105 NK細胞、またはPBMCの約5〜15%ですが、この頻度はドナーによって異なります21。単離後に純度チェックを実施することをお勧めします。
<ol>
	<li>ナトリウムまたはリチウムヘパリン化採血管に最低4mLのヒト全血を採取します。.全血50 μLをプレエンリッチメントサンプルとして染色します。</li>
	<li>濃縮カクテルを50 μL / mLで血液サンプルに加えます(材料の表を参照)。よく混ぜ合わせ、室温で10分間インキュベートします。</li>
	<li>等量のPBS + 2% FBSを加えてサンプルを希釈し、穏やかに混合します。</li>
	<li>4 mLの密度勾配溶液を15 mLコニカルチューブに加えます。希釈したサンプルを密度グラジエント培地の上に慎重に重ねます。</li>
	<li>ブレーキをオフにして、1,200 x gで10分間遠心分離します。</li>
	<li>濃縮された細胞の層を新しい15 mLコニカルチューブに慎重に集めます。PBS + 2%FBSで容量を最大50mLにして細胞を洗浄します。</li>
	<li>300 x gで10分間遠心分離し、上清を捨てて洗浄を繰り返します。</li>
	<li>上清を吸引し、細胞を0.5 mLの完全培地に再懸濁します。</li>
	<li>自動セルカウンターまたは血球計算盤を使用して、細胞をカウントし、濃度を5x105細胞/mLに調整します。精製した細胞懸濁液50 μLを、濃縮後のサンプルとして染色します。</li>
	<li>細胞を室温で最大10分間保持するか、使用する準備ができるまで37°Cの加湿5%CO2インキュベーターに入れます。</li>
</ol>
4. NK細胞含有量評価のためのイムノフェノタイピング
<ol>
	<li>全単離された50 μLのPBMC、濃縮前全血、または精製NK細胞を使用して、NK細胞マーカーとして抗CD56蛍光色素標識抗体で染色します。他の細胞タイプや系統(CD3+ T細胞、CD19+ B細胞など)のマーカーも、汚染の原因を評価するために含めることができます。</li>
	<li>4°Cで20分間インキュベートし、2 mLのPBS + 2% FBSを加えて洗浄します。</li>
	<li>450 x gで5分間遠心分離します。</li>
	<li>PBMCまたはNK細胞の場合は、上清を吸引し、100μLのPBS+2%FBSで細胞を再懸濁します。</li>
	<li>全血サンプルの場合は、赤血球(RBC)溶解を行います。
	<ol>
		<li>遠心分離後、上清を吸引し、2 mLの赤血球溶解バッファー(31.75 gの塩化アンモニウム+4.16 gのトリス塩基+6.65 gのEDTA、5000 mLの脱イオン水に溶解)に再懸濁します。.</li>
		<li>室温で10分間インキュベートします。</li>
		<li>洗浄を2回繰り返し、上清を吸引し、溶解したサンプルを100 μLのPBS + 2% FBS. に再懸濁します。
		注:RBC溶解は、染色前に行うこともできます。</li>
		<li>フローサイトメトリー解析に進みます。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. K562標的細胞の解凍・培養・回収
<ol>
	<li>10 mLの完全培地を15 mLのコニカルチューブに分注し、37°Cの水浴で温めます。K562細胞の解凍と培養には、すべてのステップで37°Cに予熱した培地のみを使用してください。</li>
	<li>凍結したK562細胞のバイアル1本を37°Cの水浴に、そのほとんどが解凍されるまで置きます。</li>
	<li>半解凍したK562細胞を、37°Cに予熱した15mLコニカルチューブ内の完全培地に移します。極低温バイアルの内側を予め温めた培地で洗浄し、その洗浄液を15mLチューブに加えます。</li>
	<li>ブレーキをかけた状態で、140 x gで7分間遠心分離します。上清を取り除き、ペレットを1 mLの完全培地に再懸濁します。</li>
	<li>自動セルカウンターまたは血球計算盤を使用して細胞をカウントするために、適切な量の細胞懸濁液を分注します。</li>
	<li>濃度を1x10 5-2x105細胞/mLに調整し、加湿した5% CO2インキュベーターで37°Cで少なくとも2日間培養してから使用してください。この密度範囲で培養を3か月以内に維持し、その後、新しいアリコートを解凍します。培養中の細胞濃度が1x106細胞/mLを超えないようにしてください。</li>
	<li>アッセイで使用するには、K562細胞培養ウェルを10 mLの血清学的ピペットと混合し、アリコートを取り出して、自動セルカウンターまたは血球計算盤とTrypan Blue染色を使用して細胞生存率をカウントおよび評価します。
	<ol>
		<li>生存率が85%未満の場合は、次の死細胞除去手順に進みます。
		<ol>
			<li>必要に応じて、15 mLの密度勾配溶液を50 mLコニカルチューブに加えます。培養からすべての細胞を採取し、チューブを傾けて細胞懸濁液を密度勾配溶液の上にゆっくりと重ねます。</li>
			<li>ブレーキをオフにして、650 x gで24分間遠心分離し、生細胞の層を新しい15 mLコニカルチューブに慎重に集めます。PBSで容量を50mLにします。</li>
			<li>ブレーキをかけた状態で、450 x gで10分間遠心分離します。上清を取り除き、ペレットを1 mLの完全培地に再懸濁します。細胞をカウントし、細胞の生存率を確認します(5.7と同様)。</li>
			<li>加湿した5%CO2インキュベーターで37°Cで少なくとも2日間培養してから使用してください。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>5x105 K562標的細胞を採取し、140 x gで7分間遠心分離し、上清を吸引し、細胞ペレットを1% FBSを含む培地に500 μLで再懸濁します。</li>
</ol>
6. K562ターゲットセルの標識
注:CFSEワーキングソリューションを追加する前に、K562セルが十分に再懸濁されていることを確認してください。
<ol>
	<li>500 μLのCFSEワーキング溶液を500 μLのK562細胞にピペットで移し、最終濃度0.5 μMに 同じ1000-1250 μLチップを使用して、3-5回静かにピペッティングしてすぐに混合します。</li>
	<li>37°Cのウォーターバスまたは加湿した5%CO2インキュベーターで、37°Cの暗所で10分間インキュベートします><。
	注:インキュベーター内の温度平衡化遅延時間はウォーターバスに比べて長いため、特に1 mL>容量の場合はインキュベーション時間を調整する必要がある場合があります。</li>
	<li>標識反応を10 mLの完全培地で室温の暗所で10分間クエンチします。</li>
	<li>標識されたK562細胞を140 x gで7分間遠心分離し、上清を除去し、1 mLの完全培地に再懸濁します。</li>
	<li>自動セルカウンターまたは血球計算盤を使用して細胞をカウントし、完全培地中の濃度を1x105細胞/mLにします。</li>
	<li>使用する準備ができるまで、37°Cの加湿した5%CO2インキュベーターに細胞を置きます。細胞は、室温で最大10分間保持するか、使用する準備ができるまで37°Cの加湿CO2インキュベーターに保持することができます。冷蔵しないでください。</li>
</ol>
7. めっき
注:NK細胞が制限されている場合、K562細胞とNK細胞の両方の濃度を半分にすることができ、細胞の半分がアッセイでプレーティングされます。このアッセイは、半分の細胞量で同等の結果をもたらします(比率が一定に保たれている限り)。
<ol>
	<li>総PBMCを使用する場合は、ウェルごとに次の条件で96ウェル、U底、組織培養処理プレートを標識します:(1)エフェクター(E):ターゲット(T)= 50:1 + IL-2-NK細胞の細胞毒性の陽性コントロール。(2)E:T = 50:1;(3)E:T = 25:1;(4)E:T = 12.5:1;(5) E : T = 6.25 : 1;(6)T-標的細胞のみ-K562死のネガティブコントロール。(7)E-エフェクター細胞のみ。(8) T + Tween - K562 死亡に対するポジティブコントロール</li>
	<li>精製されたNK細胞を使用する場合は、ウェルごとに次の条件で96ウェル、U底、組織培養処理プレートを標識します:(1)エフェクター(E):ターゲット(T)= 5:1 + IL-2-NK細胞の細胞毒性の陽性コントロール;(2)E:T = 5:1;(3)E:T = 2.5:1;(4)E:T = 1.25:1;(5)E:T = 0.625:1;(6)T-標的細胞のみ-K562死のネガティブコントロール。(7)E-エフェクター細胞のみ。(8)T + Tween-K562死亡のポジティブコントロール</li>
	<li>100 μLの完全培地を条件3、4、5、6、7に加えます。このステップとそれ以降のすべてのステップでは、(推奨)マルチチャンネルピペットを使用します。</li>
	<li>100 μLのエフェクター細胞(PBMC(5x106細胞/mL、または精製NK細胞5x105細胞/mL)を条件1、2、3に添加します。条件4〜7のエフェクター細胞を段階希釈して添加します。コンディションごとにチップを変えないでください。
	<ol>
		<li>条件3を混合し、100μLを取って、条件4に移します。</li>
		<li>条件4を混合し、100μLを取って条件5に移します。</li>
		<li>条件5を混合し、100 μLを取り、条件7に移します。条件 6 にはエフェクター セルがありません。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>調製した2x 0.2% Tween作動溶液100 μLを条件8(最終濃度:0.1% Tween-20)に加えます。条件8にはエフェクター細胞がありません。</li>
	<li>条件1に30 μLのIL-2ワーキング溶液を加えます。IL-2は、標的細胞懸濁液を添加する前にエフェクター細胞懸濁液に添加する必要があります(最終濃度:27 IU / mL)。</li>
	<li>100 μLの標的細胞(標識K562細胞を1x105細胞/mL)を条件1、2、3、4、5、6、8に加えます。条件7にはターゲットセルがありません。</li>
	<li>すべてのウェルをマルチチャンネルピペットで混合し、プレートを120 x gで2分間遠心分離します。</li>
	<li>加湿したCO2インキュベーターで37°Cで4時間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、プレートを氷上に置いて、30分以内に生存率染色に進みます。</li>
</ol>
8. 生存率と獲得のための染色
<ol>
	<li>5 μMのストック溶液3 μLを600 μLのPBSに加えて、デッドセル染色(材料の表を参照)を調製します。</li>
	<li>希釈した死細胞染色液50 μLを各ウェルに加え、最終容量250 μL、最終濃度0.005 μMにしてください。</li>
	<li>フローサイトメトリー解析に進みます。フローサイトメーターを使用して、ターゲットセルゲート(図2)で少なくとも1,000のイベントを収集し、統計的に意味のある結果を得ることができます。</li>
</ol>

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<li>Hazeldine, J., Lord, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+ageing+on+natural+killer+cell+function+and+potential+consequences+for+health+in+older+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">The impact of ageing on natural killer cell function and potential consequences for health in older adults.</a> Ageing Res Rev. 12 (4), 1069-1078 (2013).</li>
</ol>

著者は経済的利害関係の競合を宣言しません。

ここで説明したメソッドは、NK 細胞の細胞傷害活性を評価するために伝統的な51Cr リリース試金する簡単かつコスト効果の高い代替手段を提供します。このメソッドは、機密性の高い、再現と CRA のような前の標準的な方法より手間がかからずと臨床の両方に使用できます、アプリケーションを研究します。
アッセイ作品合計 PBMCs と濃縮の NK 細胞は、細胞集団を浄化するために必要とせず PBMCs を使用するオプションは、患者のサンプルから収集した血液またはいくつかまたは貧しい品質のセルの小さなボリュームを扱う大きなメリットです。この試金は、CFSE と死んだ細胞排除性汚れのみを利用しています。これらの 2 つのパラメーターだけを見て診断を目的として、さらにフローサイトメトリー解析における補償を必要としないという利点を簡潔かつ十分な情報を提供します。
このメソッドは、基本的な NK 細胞生物学を研究し、新規 NK 細胞標的療法をテストにも使用できます。この点では、流れの cytometers の拡大機能は、この...

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to:
<img alt="Effector:Target cell death comparison graph, healthy donor vs patient, cytotoxicity analysis." src="/files/ftp_upload/56191/56191fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4">

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Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

ナチュラル キラー (NK) 細胞は、人間の生得的なリンパ球批判的に他の病原性の脅威1,2トランス ホーム細胞、ウイルス感染細胞の排除に関与の洗練されたサブセットです。NK 細胞溶解顆粒細胞傷害性タンパク質、パーフォリンなど granzymes の家します。起動時に、NK 細胞は直接ターゲット セル換散とサイトカインとケモカインの放出とともにアポトーシスの結果これらの細胞傷害性の分子がリリースされたローカルという免疫学のシナプスと呼ばれる、ターゲットとの複雑な相互作用を形成し、最終的に、炎症の誘導で1,3,4の状態します。
NK 細胞の活性化を含む複雑な文字列を活性化と抑制相互 NK 細胞受容体とリガンドの堅く調整されたシステムの形成、標的細胞の表面に発現します。NK 細胞の活性化の最も研究のメカニズムの 1 つは、「行方不明自己」です。確かに組織適合性の複雑な (MHC)、または人間の白血球の抗原 (HLA) 分子を主要なクラスの検出の欠如感染または細胞トリガー NK 細胞障害活性を変換します。腫瘍、ウイルス感染細胞レセプター一般的に NK になる T 細胞性免疫能を脱出するこれらの抗原細胞ターゲット1,3,4。
NK 細胞機能の評価は主に脱顆粒や細胞毒性に分類の試金。ただし、脱顆粒関連マーカー CD107a の流れフローサイトメトリー検出などの脱顆粒の試金は NK 細胞の活性化とそれらの究極の機能は、ターゲット セル5,6,7,8の直接の殺害を示すのみ。したがって、この制限は細胞毒性の試金に指示しより直接的代替として調査官を集めています。
長年「ゴールド スタンダード」T および NK 細胞の細胞媒介性細胞傷害活性を評価するため、クロム リリース試金 (CRA)。CRA は、放射能によって51Cr を用いた標的細胞のラベリングとエフェクター細胞にそれらをインキュベート共同に含まれます。この試金は蛋白質バインド51Cr 培養上清をガンマを数えることで測定することができますリリースでそのセル換散の結果主義が染み込んでください。効果的、このアッセイはさまざまな理由のため問題となる: 困難な標準化 - ことが全体で非現実的な9,10 51Cr の自発的なリリースと放射性51Cr の処分処理高材料費。
非放射性アッセイ、蛍光標識、酵素リリースも生物発光などの数から、CRA 111412,13,,に代わるものとして開発されています。ここで NK 細胞細胞毒性活性 K562 標的細胞に簡単な敏感なと再現性のある測定用フロー フローサイトメトリーを用いた手法について述べる。K562 細胞は、人間 erythroleukemic セル HLA クラスの発現低下と私と NK 細胞媒介性細胞傷害15に特に敏感になる賦活の NK の受容器のための ligands の高められた表現です。このアッセイ K562 細胞 carboxyfluorescein ジアセテート サクシニミジルエステル (CFSE) があらかじめ付いていますいずれか末梢血単核球 (Pbmc) の様々 な比率で共培養や NK 細胞1を精製しました。CFSE はエフェクター NK 細胞16,17から標的細胞の判別ができる安定した、蛋白結合蛍光染料です。共培養後核酸染色、特に死んだ細胞の膜を浸透、殺された標的細胞 (材料の表を参照) を識別するために使用されます。流れの cytometer 死者 (すなわち、汚れ +) の割合を決定するために、サンプルを集録し、CFSE + 標的細胞。
この試金は、機能やクラシックの NK 細胞の欠乏を引き起こす約 30 の既知の欠陥がある NK 細胞コンパートメントに影響を与えるイネの欠陥、プライマリまたはセカンダリの血球貪食症候群、ルーチンの診断スクリーニングとして使用できます。また、再発、重度のヘルペス ウイルス感染症、造血幹細胞移植またはポスト免疫調節療法18,19、20、次免疫再構築を評価するための基本的な研究アプリケーションのホストのため患者の NK 細胞活性を調査することをお勧めします。

<table><tbody><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (1x, w/o Ca2+ and Mg2+)</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>熱不活性化ウシ胎児血清</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-02</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリンストレプトマイシン</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ15140-16310,000</td><td>U / mL</td></tr><tr><td>IL-2</td><td>R&のストック溶液D Systems</td><td>202-IL-050</td><td>0.2 から凍結乾燥 &mu;アセトニトリルおよびTFA中のmろ過溶液とBSAをキャリアタンパク質として含んだ溶液。500 ul で 100 &mu;g/mL in in sterile 100 mM Acetic Acid containing at least 0.1% bovine serum albumin (2.1x10E6 IU/ml)</td></tr><tr><td>K562 Cells ATCC</td><td></td><td>CCL-243</td><td>Cancer cell line&nbsp;</td></tr><tr><td>T-75細胞培養フラスコ</td><td>Corning</td><td>431464</td><td></td></tr><tr><td>CFSE 細胞増殖キット</td><td>Life Technologies (CellTrace)</td><td>C34554</td><td>Reconfigure I vial with 18 ul DMSO to 調製 5mM ストック溶液。凍結/解凍しないでください。</td></tr><tr><td>Sytox Red</td><td>Life Technologies</td><td>S34859</td><td>ストックソリューションは5&muで提供されます。1 mL DMSO中のM。DMSO溶液は、試薬を劣化させることなく、複数回の凍結融解サイクルにさらすことができます。</td></tr><tr><td>ナトリウム/リチウムヘパリン採血管</td><td>BD</td><td>02-687-95</td><td></td></tr><tr><td>U底96ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>CLS3897</td><td></td></tr><tr><td>血清ピペット</td><td>BDファルコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリスチレン丸底チューブ(5mL)</td><td>BDファルコン</td><td>14959-5</td><td></td></tr><tr><td>50mLポリプロピレンコニカルチューブ</td><td>BDファルコン</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 mLポリプロピレン円錐管</td><td>BDファルコン</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>試薬リザー</td><td>バーUSAサイエンティフィック</td><td>2321-2230</td><td></td></tr><tr><td>ヒトNK細胞濃縮カクテル</td><td>StemCellテクノロジーズ(ロゼットセップ)</td><td>15065</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト nk 細胞活性の評価の流れのフローサイトメトリーを用いた細胞毒性の試金

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

自然免疫系のエフェクター リンパ球のナチュラル キラー (NK) 細胞として知られている重要な役割宿主防御において異常な細胞、特に腫瘍を排除し、ウイルス感染細胞に対する。他の病理学の条件のホストとともに、約 30 知られているイネの欠陥では、機能または古典的な NK 細胞欠乏症を引き起こす、けんしょうの減少や細胞傷害活性を欠席します。歴史的には、細胞毒性を面倒な高価な潜在的に有害である放射性の方法で調べた。この資料では、合理化された、臨床応用可能な流れ cytometry ベースの NK 細胞の細胞傷害活性を定量化する方法について説明します。この分析では、末梢血単核球 (PBMCs) または NK 細胞純化は、異なる比率で共存培養 NK 細胞性細胞毒性 (NKCC) に敏感であると知られているターゲット腫瘍細胞株。標的細胞はエフェクター細胞 (NK 細胞) から差別を許可する蛍光色素をあらかじめラベルを。潜伏期間後殺された標的細胞は、死んだ細胞に浸透する具体的には核酸の汚れによって識別されます。このメソッドは、診断や研究用途との両方、フローサイトメトリーのマルチパラ メーター機能のおかげで影響を受けやすい可能性のある NK 細胞の表現型と機能のより深い分析を可能にする利点があります。

アッセイをセットアップする前に NK 細胞内容が好みのエフェクター人口で評価されることを強くお勧めします。図 1は、典型的な CD56 染色 (ライトブルー) の前に示しています (赤) NK 細胞濃縮後。NK 細胞は、PBMCs の最大 15% を占めるし、濃縮後の少なくとも 80% 純粋なべきであります。
このアッセイのフローサイトメトリーによる解析を含む 2 つのパラメーターの検出: CFSE、FITC; と同じチャネルの検出死んだ細胞の染色、APC (図 2 a、B) と同じチャネルで検出。データ集録、データを分析する図 2のゲートの戦略が使用されます。死者 (すなわち、死んだ細胞染色 +) K562 標的細胞はターゲット人口の内で殺...

流れ cytometry ベースの人間のナチュラル キラー細胞の細胞傷害活性を定量的に決定する方法を示しています。

ヒト NK 細胞活性の評価の流れのフローサイトメトリーを用いた細胞毒性の試金

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

本手順の全体的な目的は、ヒトNK細胞の細胞毒性活性を評価することです。この手法は、機能的または古典的なNK細胞欠損症の患者のモニタリングに使用できます。このフローサイトメトリーに基づく手法の主な利点は、感度が高く、再現性があり、放射性クロム放出試験などの標準的なNK細胞機能評価法よりも迅速であることです。この手法は、新規のNK細胞標的療法を試験する場合や、これまで困難であったNK細胞生物学における詳細なマルチパラメーターフローサイトメトリー解析を行う場合に利用可能です。まず、標準的なプロトコルに従い、密度勾配分離を用いて全血サンプルから末梢血単核細胞（PBMC）を分離します。臨床検体を扱う際は、精製したNK細胞ではなくPBMCを使用することが非常に有効です。分離した細胞を完全培地で5 × 10⁶ cells/mLの濃度に希釈し、直ちに遠心分離によってK562ターゲット細胞を回収します。5 × 10⁵個のK562細胞を、1% FBSを添加した500 µLの新鮮な培地で再懸濁します。次に、500 µLのCFSEワーキングソリューションを用いてターゲット細胞をラベルし、ピペッティングを3〜5回行い、細胞溶液を穏やかに混合します。遮光条件下で37°Cで10分間置いた後、完全培地10 mLを添加し、室温・暗所にて10分間反応を停止させます。停止 incubation の終了後、遠心分離により細胞を回収し、計数のため標識した標的細胞ペレットを完全培地1 mLで再懸濁します。次に、新鮮な完全培地を用いて細胞濃度を1 × 10⁵ cells/mLに希釈し、標的細胞を湿潤環境の37°C、5% CO₂インキュベーターに入れます。アッセイを成功させるために、標的細胞へのストレスを最小限に抑え、エフェクター細胞を回収後できるだけ早くテストしてください。標的細胞の標識から30分以内に、表に従って96ウェルU底組織培養処理プレートに標識を行ってください。次に、エフェクター細胞対標的細胞の比率が25:1、12.5:1、6.25:1のウェル、標的細胞のみのウェル、およびエフェクター細胞のみのウェルに、完全培地を100 µLずつ加えてください。エフェクター細胞 100 µLを、細胞毒性コントロールウェルおよびエフェクター細胞対標的細胞比が50:1および25:1のウェルに加えます。次に、エフェクター細胞対標的細胞比が25:1のウェルから始めて、標的細胞のみのウェルを飛ばし、次の2つの低濃度比のウェルへ順に細胞 100 µLずつを移送します。なお、各移送の間には十分に混合してください。最後に、残りの細胞 100 µLをエフェクター細胞のみのウェルに加えます。TweenのみのK562死細胞陽性コントロールウェルに、2X 0.2% Tween ワーキングソリューション 100 µLを加えます。バイアル2のワーキングソリューションを30 µL、NK細胞細胞毒性陽性コントロールウェルに加えてください。次に、1 × 10⁵個/mLに調整したK562標的細胞を、エフェクター細胞のみのウェルを除くすべてのウェルに完全培地100 µLで加えてください。すべての細胞を播種した後、マルチチャンネルピペットを用いてすべてのウェルを混合してください。短時間の遠心分離で細胞を沈殿させ、プレートを細胞培養インキュベーターに4時間置きます。インキュベーション終了後、プレートを氷上または冷却台の上に置き、各ウェルに調製直後の死細胞染色剤を50 µLずつ加えます。次に、すべてのウェルを静かに混合し、フローサイトメトリーで細胞を解析します。先ほど実演したように、冷温培養4時間後のCFSEおよび死細胞染色のフローサイトメトリー分析を行うと、「標的細胞のみ」のウェルでは細胞死が15%以下であることがわかります。「エフェクター細胞のみ」のウェルではCFSEシグナルは検出されず、これらのウェルで観察される細胞死は5%未満です。一方で、Tweenを介した標的細胞殺傷ウェルにおける細胞死は、通常85%を超えます。NK細胞機能に欠損がある患者では、健常者と比較して、テストしたほとんどまたはすべての比率で殺傷活性の低下が観察されます。これは、これらの患者由来のNK細胞が、エフェクター細胞と標的細胞の比率の低下に相関して細胞毒性が段階的に減少することを示しています。この手法を習得すれば、2時間の準備およびプレートへの播種、4時間のインキュベーション、そして30分のデータ取得を含め、合計6時間半で完了させることができます。この手順を実施する際は、細胞の準備から共インキュベーションの開始までのタイムラグを最小限に抑えるため、ターゲット細胞とエフェクター細胞を並行して準備することが重要です。このビデオを視聴することで、フローサイトメトリーを用いて、蛍光標識したターゲット細胞に対するヒトNK細胞の細胞傷害活性を測定する方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ここでは、効率的に拡大し、精製ヒトNK細胞の数が多いし、その機能を評価する方法を説明します。...

拡大、精製、及びヒト末梢血NK細胞の機能的評価

このビデオは、蛍光染色された標的細胞に対するナチュラルキラー細胞の溶解活性を示しています。この手法では、死細胞を染色し、フローサイトメーターを使用して生細胞と死細胞の標的細胞を定量することにより、NK細胞による細胞毒性の測定が可能になります。...

Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity Assay Flow Cytometric Analysis 用サンプル調製

このプロトコルは、高感度の細胞ベースの細胞毒性アッセイについて説明しています。このアッセイは、エフェクターCD8+ T細胞の数が増加している場合の生標的CD4+ T細胞の頻度の減少を列挙することにより、抗原特異的CD8+...

細胞毒性活性を測定するための細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイ

簡単かつ信頼性のある方法は、異なるNK細胞サブセット内の脱顆粒、サイトカインおよびケモカインの産生などNK細胞機能のセットを分析するために、ここで説明されています。...

NK細胞の機能を監視するためのサイトメトリーに基づくアッセイを流します

この研究は、ヒトの血液サンプル中のNK(Natural...

ヒト全血中のナチュラルキラー細胞溶解活性のフローサイトメトリー分析

がん細胞によるナチュラルキラー(NK)細胞介在の根絶の回避は、がんの開始と進行に重要です。ここでは、肝腫瘍細胞に対するNK細胞媒介性細胞毒性を評価するための非放射活性ベースの2つのプロトコルを紹介する。さらに、NK細胞の移動を分析するための第3のプロトコルが提示されます。...

肝腫瘍細胞の文脈における自然キラー細胞媒介性細胞毒性と遊性の測定

ヒトナチュラルキラー細胞における治療抗体によるFcγRIIIA駆動事象を研究するためのプロトコルをここに説明する。この人工刺激プラットフォームは、脱顆粒、ケモカイン/サイトカイン産生、および結合に関与する抗体のFcγRIIIaおよびFc部分によって媒介されるシグナル伝達経路などの下流エフェクター機能の尋問を可能にする。...

治療抗体の存在下におけるFcγRIIIa関与によるヒトナチュラルキラー細胞事象の評価

このプロトコルは、レンズフリーシャドウイメージング技術を使用して、ナチュラルキラー(NK)細胞数および活性の迅速な単一細胞分析のためのラベルフリー法を記述しています。この方法は、回折パターンをコンピュータで分析することにより、個々のNK細胞の形態学的変化を定量化します。...

ナチュラルキラー細胞活性化の迅速なラベルフリー分析のためのフィールド展開可能なレンズフリーイメージングプラットフォーム

このプロトコルは、生細胞イメージングとフローサイトメトリーを用いて、ヒトの自然なキメラ抗原受容体介在および抗体依存性細胞毒性を一貫して測定するための標準化された in vitro.

キメラ抗原受容体および治療用抗体によって増強されるNK細胞毒性の定量化:生細胞イメージングおよびフローサイトメトリー

Tregsのは、免疫系の強力な抑制因子である。それ故に、それらを定義するためにユニークな表面マーカーの欠如が存在する、Tregsのの定義は、主に機能的です。ここでは、最適化を説明...

ヒトのインビトロ</em免疫バランスの初期状態の認識のためのスクリーニングツールとして>抑制

学ぶヒトNK細胞の細胞傷害活性評価法。フローサイトメトリーを用いた迅速で再現性の高いアッセイで、K562標的細胞とPBMCを用い、放射能を使わずにNK細胞機能を定量化します。臨床診断と研究に適用可能です。

ヒト NK 細胞活性の評価の流れのフローサイトメトリーを用いた細胞毒性の試金

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