細菌の増殖の高精度、高スループットの分析

この実験の全体的な目的は、細菌の増殖を高スループットかつ精密に分析することです。この手順を用いることで、複数の培地または異なる菌株を同時に試験することが可能です。この手法は、細胞増殖の決定要因は何かといった、システム生物学および微生物学の分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。

この手法の主な利点は、細菌細胞の増殖曲線における最大増殖速度および最大個体群密度というグローバルパラメータを、研究者が正確に評価できることです。この方法はE. coliの増殖に関する知見を得るのに有用ですが、環境細菌の増殖アッセイやスクリーニングなど、他の微生物にも適用可能です。

まず、滅菌済みのシリコンゴム栓付きガラスチューブ5本、ピペット、および目的の菌株をクリーンベンチ上に用意します。シリコンゴム栓を開ける前に、ガラスチューブの口をブンセンバーナーで火炎滅菌します。チューブを開封した後、シリコンゴム栓を火炎に通し、その後、ガラスチューブにキャップを軽く被せます。

次に、電子ピペットと使い捨てセロロジカルピペットを使用して、1本のガラスチューブに5 mLのM63を、他の4本のチューブに4.5 mLのM63を分注します。p200チップを用いてコロニーをピックアップし、5 mLのM63が入ったガラスチューブに接種します。チューブをボルテックスして懸濁液を作成します。

次に、この溶液を0.5 milliliters分、4.5 millilitersのM63を含む4本のチューブのうちの1本に移し、溶液を10倍に希釈します。残りのチューブについても同様の操作を繰り返します。ガラスチューブの口とシリコンゴム栓を滅菌した後、ストッパーでチューブを密閉します。

次に、5本のチューブを37 °Cに予熱した振盪インキュベーターに入れ、200 rpmで振盪させます。一晩、または10〜30時間培養します。培養後、p1000を用いて使い捨てキュベットに1,000 µLのM63を加えます。

使い捨てキュベットを分光光度計にセットします。波長を600 nmに固定してプログラムを開始し、ブランクを測定します。5本のガラスチューブを振盪インキュベーターからクリーンベンチへ移動させます。

使い捨てキュベットからM63を廃棄し、p1000を用いて同じ使い捨てキュベットに培養液を1,000 microliters加えます。次に、細胞培養液の光学濁度を測定します。続いて、1.5 milliliterマイクロチューブに滅菌済み60%glycerol溶液を250 microlitersと、選択した細胞培養液を750 microliters加え、ピペッティングにより混合します。

残りの9本のマイクロチューブをマイクロチューブスタンドに設置し、調製した混合液を各チューブに100 µLずつ分注します。ストック溶液は-80 °Cの超低温冷凍庫で保存してください。マイクロプレートリーダーの設定を行うには、まずソフトウェアを起動し、タスクマネージャーからプロトコルを開いて、「新規作成」を選択します。

次に、標準プロトコルを選択します。手順を開き、設定を調整してください。設定温度を開き、インキュベーターをオンに選択します。

次に、温度を37 °Cに、グラジエントを0 °Cに設定します。次のステップに進む前に、プリヒートを確認してください。「start kinetic」を開き、実行時間を24分または48分に設定し、インターバルを30分または1時間に設定します。

シェイク設定を開き、シェイクモードをリニアに設定します。連続シェイクを確認し、周波数を567 cpmに設定します。次に、リード設定を開き、吸光度、エンドポイント/キネティック、およびモノクロメーターを確認します。

波長を600に設定します。最後に、[validate]をクリックして、手順が正しいことを確認してください。そして、[save]をクリックして、今後のために新しいプログラムとして保存します。

成長をリアルタイムで記録するため、滅菌済みの試薬リザーバーにM63を約25 milliliters加えます。次に、段階希釈の準備として、マイクロチューブにM63を900 microlitersずつ加えます。続いて、解凍したグリセロールストックにM63を900 microliters加え、ボルテックスで撹拌します。

10倍希釈液を100 µL取り、M63を900 µL含む別のマイクロチューブに移してボルテックスします。目的の希釈倍数に達するまでこの操作を繰り返します。次に、8チャンネルピペットを用いて、滅菌済みの96ウェル平底マイクロプレートの端のウェルにM63を200 µLずつ分注します。

参照表に従い、希釈した各サンプルを200 µLずつマイクロプレートのウェルに分注します。加熱による不均一な層の形成や播種効率の影響を避けるため、マイクロプレートの端のウェルにはサンプルを入れないでください。また、同一のサンプルをプレート上の異なる位置にある複数のウェルに分注してください。96ウェルマイクロプレートをプレートリーダーにセットします。

ReadNowおよびタスクマネージャーを開き、プログラムを選択します。「OK」をクリックして測定を開始してください。最後に、データ解析のために記録を新しい実験ファイルとして保存します。

ここでは、実験前に作成した参照テーブルの例を示します。96ウェルプレートのピクトグラムを8×12の表として描き、96ウェルプレート上における接種培養サンプルの位置を指示しました。増殖速度は、OD600のすべての連続する値のペアに数式を適用して算出します。

最大増殖率を推定するため、5回連続の増殖率の平均値と標準偏差を算出した。合計60件の細胞培養の増殖率をヒートマップとして表示している。白から赤への変化は、増殖率が低いことから高いことへの段階的な変化を示している。

この手法を習得すれば、適切に順序立てて行うことで数分以内に完了できます。このビデオを視聴することで、ハイスループットな方法で細菌増殖を高精度に測定するための、マイクロプレートへのサンプルの調製およびロード方法について十分に理解できるはずです。この手順を行う際は、細胞密度が低い培養物が現れるのを避け、細胞が24時間以内に増殖を開始することを確認するために、実験前にリファレンス表を作成しておくことが重要です。

本手順に続き、集団の増殖やダイナミクスの決定要因などのさらなる問いに答えるため、実験操作の自動化や計算解析などの他の手法を実施することが可能です。この技術の開発により、システム生物学および微生物学の分野の研究者に新たな道が開かれました。これにより、細胞増殖の基本原理の探究や、培地組成の最適化が可能になります。