Name: 細菌の増殖の高精度、高スループットの分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 学ぶ細菌の高精度・高スループット増殖解析法。複数培地や異なる株を同時に評価し、最大増殖速度や最大菌体密度を正確に測定できます。E. coliや環境細菌のスクリーニングにも応用可能です。

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1 成長培地を準備する 注: 最小媒体 M63 の化学組成は次のように: 62 ミリメートル K 2 HPO 4、39 mM KH 2 PO 4、15 mM (NH 4) 2。 など 4、1.8 μ M FeSO 4、15 μ M チアミン HCl、0.2 mM MgSO 4、および 22 mM グルコース。M63 は 3 つの原液を混合することによって作られた: 5 X ソリューション、20% ブドウ糖と MgSO 4 チアミン ソリューション。4 ですべてのソリューションを格納 ° C
<ol><li>電気ピペットと使い捨ての血清ピペットを使用して FeSO 4 ソリューションを準備する 5 X ソリューション <ol><li>を準備する ddH 2 O を 50 mL の遠心管に追加します。0.06 mL 0.01 M 塩酸を追加 36 mg FeSO 4-7 H 2 O を取得してよく混ぜる塩酸を追加する、P-200 を使用します</li>。
		<li>160 mL ddH 2 O メスシリンダーで測定し、500 mL ビーカーに追加。この順序で、次を追加します: 10.72 g K 2 HPO 4、5.24 g KH 2 PO 4、2.0 g (NH 4) 2 SO 4、および 0.5 mL FeSO 4 ソリューション (1.1.1 の手順で準備).</li>
		<li>2 M 島を追加することによって 7.0 に pH を調整精度 pH メーターを使用しています。測定シリンダー内の溶液を注ぐ、ddH 2 O を 200 mL の容量に追加します。250 mL ろ過装置 (PVDF、0.22 μ M) を使用して、ソリューションを滅菌します</li>。
	</ol></li> <li>20% グルコース溶液を準備する <ol><li>200 mL ddH 2 O のメスシリンダーを測定し、500 mL ビーカーに注ぐ。混合磁性攪拌器を使用して中のグルコース 50 グラムを追加します。250 mL の容量にメスシリンダーでソリューションを希釈します。1.1.3 の手順で説明するようにソリューションを滅菌します</li>。
	</ol></li> <li>MgSO 4 チアミン ソリューションを準備する <ol><li>500 mL ビーカーに 150 mL ddH 2 O を追加。電磁攪拌機で混合しながらメスシリンダーでチアミン HCl と MgSO 4-7 H 2 o. Dilute ソリューション 10 g 1.0 g を 200 mL の容量に追加します。1.1.3 の手順で説明するようにソリューションを滅菌します</li>。
	</ol></li> <li>最小媒体 M63 を準備 <ol><li>5 X ソリューション、20% ブドウ糖溶液、MgSO 4 チアミン ソリューション、電子ピペット、P-200 ピペットおよびクリーン ベンチで 200 μ L ピペット チップを配置します</li>。
		<li>155.8 mL ddH 2 O のメスシリンダーを測定し、500 mL ビーカーに注ぐ</li>。
		<li>5 X 溶液及び 4 mL 20% ブドウ糖溶液 40 mL を加える電子ピペットと使い捨ての血清ピペットを使用して測定 ddH 2 o.0.2 mL、P-200 と MgSO 4 チアミン ソリューションを追加します。1.1.3 の手順で説明するようにソリューションを滅菌します</li>。
	</ol></li></ol> 2。グリセロール ストックを準備する <ol><li>細胞培養 注: ひずみ銀行組織から (例えば、W3110 およびその減らされたゲノム) 細菌の緊張があります。系統は、通常寒天のコロニーの形で得られます。
	<ol><li>シリコーン ゴム栓、電子ピペット、P-1,000、1,000 μ L ピペット チップ、P-200、200 μ L ピペット チップ、クリーン ベンチのターゲット株 (板の植民地) と 5 つの滅菌ガラス管を配置します</li>。
		<li>は、シリコーン ゴム栓を開く前にブンゼン バーナーのガラス管の口を公開します。チューブが開かれた後、炎にシリコーン ゴム栓を公開し、ガラス管にキャップを軽く配置します</li>。
		<li>電子ピペットと使い捨ての血清ピペットを使って 1 つのガラス管と他の 4 本のチューブに 4.5 mL M63 に 5 mL M63 を追加します</li>。
		<li>P-200 tip を使用してコロニーをピックアップし、5 mL M63 を含むガラス管で接種します</li>。
		<li>渦管に懸濁液を作る。ソリューションを 10 倍希釈して、4.5 mL M63 を含む 4 つの管の 1 つにこの溶液 0.5 mL を移すことで</li>。
		<li>を繰り返して残りのチューブ 2.1.5 手順で説明します。5 つの異なる濃度の希釈系列 (1、10、100、1000 の希釈液と 10,000) 準備が整いました</li>。
		<li>は、ガラス管や手順 2.1.2 シリコーン ゴム栓の口を殺菌します。ストッパーとチューブをキャップします。シリコーン ゴム栓をしわなく汚染を防止します</li>。
		<li>は、5 つのチューブが、37 ° C で予め温めておいた揺れインキュベーター、200 rpm で振る。一晩、または 10 に 30 h. 文化を孵化させなさい</li>
	</ol></li> <li>グリセロール ストックの文化の選択 <ol><li>クリーン ベンチにあらかじめ加温室温 M63 媒体、P-1,000、1,000 μ L ピペット チップ、使い捨てのキュベットを配置します</li>。
		<li>追加 1000 μ L P-1、000 と使い捨てのキュベットに M63。分光光度計のキュヴェットを使い捨て、固定波長 600 でプログラムを起動 nm、およびメジャー空白</li>。
		<li>5 つのガラス管を振動インキュベーターからクリーン ベンチに移動します</li>。
		<li>破棄 M63 使い捨てのキュベットから P-1、000 と同じ使い捨てのキュベットに 1,000 μ L 文化を追加。2.2.2 の手順で説明されているように細胞培養 (外径 600) の光濁度を測定します 。
		注: 任意の汚染を回避し、正確な測定を達成するために、ガラス管と前述の火炎と渦サンプリング前に文化にストッパーを公開します。細胞密度が低い場合は特に信頼性の高い結果を得るに繰り返し測定が推奨されます</li>。
		<li>5 つの細胞培養、早いの指数的な成長段階にあるものを選択 (外径 600 - 0.01 0.05) グリセロール ストック 。
		注: 複数の文化が密度を最適な範囲内にあれば、0.05 に最も近い選択一般的です</li>。
	</ol></li> <li>テストを繰り返してのグリセロールを作る 。
	注: これは 10 株を準備するため、説明します。実験的要件に応じて拡大または縮小量が可能です。
	<ol><li>滅菌 60% グリセリン溶液を置いて、10 滅菌 1.5 mL マイクロ チューブ、P-1,000、P-200、1,000 と 200 μ L ピペット チップ、マイクロ チューブはクリーン ベンチの上に立ちます</li>。
		<li>追加の 250 μ L 滅菌ピペットで 60% グリセリン溶液と 1.5 mL マイクロ チューブとミックスするカルチャを選択したセルの 750 μ L. 
		注: 在庫量は変数ですが常に細胞培養に 60% のグリセロールの 1:3 の比を維持この結果、15% のグリセロールの最終的な集中にします</li>。
		<li>残り 9 マイクロ チューブ マイクロ チューブ スタンドに置き、各管に 2.3.2 の手順で作製した混合物の 100 μ L を分注します。将来使用するための 10 の同一のグリセロールがあります</li>。
		<li>-80 でディープ フリーザーで在庫を保管 ° C</li>
	</ol></li></ol> 3。成長曲線を取得 <ol><li>マイクロ プレート リーダーを設定します 。
	注: の用語プレート リーダーで使用される特定の言葉遣いがここで使用される引用符ショー (材料の表を参照してください)。
	<ol><li>オープン ソフトウェア。開いている &#34; プロトコル &#34; の &#34; タスク マネージャー &#34; を選択、&#34; 新規作成 &#34;。選択 &#34; 標準プロトコル &#34;.</li>
		<li>オープン &#34; プロシージャ &#34;、し設定を調整します。オープン &#34; 設定温度 &#34;、選択と &#34; インキュベーターに &#34;。設定 &#34; 温度 &#34; 37 ° c と &#34; グラデーション &#34; 0 ° c. チェック &#34; 予熱 &#34; 次のステップに進む前に。オープン &#34; 運動を開始 &#34;、&#34; 実行時 &#34; 24時 00分: 00 または 48:00:00 と &#34; 間隔 &#34; 00時 30分: 00 または 1:00 。
		注: それは全体の 96 ウェル プレートを読むこと約 1 分かかります</li>。
		<li>オープン &#34; 振る &#34; セットと &#34; を振るモード &#34; として &#34; 線形 &#34;。チェック &#34; Constitution シェイク &#34; 設定 &#34; 周波数 &#34; 567 cpm で。オープン &#34; 読み取り &#34;、チェック &#34; 吸光度 &#34;、&#34; エンドポイント、カイネティック &#34; と &#34; グレーティングモノクロ メーター &#34; 設定 &#34; 波長 &#34; 600 にします。</li>。
		<li>クリック &#34; 検証 &#34; の手順が正しいことを確認します。クリックして &#34; 保存 &#34; を将来使用するための新しいプログラムとして保存します</li>。
	</ol></li> <li>リアルタイム成長の記録 <ol><li>96 ウェル プレートに接種培養の位置を指示する 96 ウェル プレート ピクトグラム (8 × 12 テーブル) を描画します。テーブルを印刷および実験のための参照としてそれを使用します 。
		注: 蒸発のため、マイクロ プレートの端に位置する井戸は空白媒体を含める必要がありますのみです</li>。
		<li>場所滅菌 96 ウェル フラット プレートの蓋、P-1000、1000 μ L ピペット チップ、P-200、200 μ L ピペット チップ、いくつか 1.5 mL マイクロ チューブ、8 マルチ チャンネル ピペット、滅菌試薬槽、室温、M63、グリセロールクリーン ベンチの株 (2.3 の手順で準備).</li>
		<li>は、試薬リザーバーに約 25 mL M63 を追加します。次の手順この貯水池の在庫を使用します</li>。
		<li>追加 900 μ L シリアルの希薄を作るための準備としてマイクロ チューブに M63</li>。
		<li>は、室温でグリセロール ストックを解凍します。900 μ L を追加解凍グリセロール ストックと渦に M63。これは、結果、元のグリセロール ストックの 10 倍希釈で</li>。
		<li>M63 と渦の 900 μ L を含む別のマイクロ チューブに 10 倍希釈の転送 100 μ L。これは、結果、100 希釈で</li>。
		<li>3.2.6 希釈の必要な数を達成するまで手順を繰り返します</li>。
		<li>200 μ L M63 を使用してマイクロ プレートの端に井戸を埋める 8 ch ピペット (P-200). 
		注: これらの井戸は空白として使用できます</li>。
		それぞれの <li>負荷 200 μ L 希釈手順 3.2.4 - 参照テーブル (手順 3.2.1) によるとマイクロ プレートのウェルに 3.2.7 に調製した試料です。渦希釈サンプル前に複数の井戸で同じサンプル読み込みと負荷に変化、プレート上の場所</li>。
		<li>プレート リーダーの 96 ウェル マイクロ プレートを配置します</li>。
		<li>オープン &#34; 今すぐ読む &#34; の &#34; タスク マネージャー &#34; プログラム (セクション 3.1) を選択。クリックして &#34; OK &#34; 測定を開始します。データ分析 (セクション 4) のための新しい実験ファイルとして録音を保存します</li>。
	</ol></li></ol> 4。データ分析 <ol><li>エクスポート テキスト ファイルとして USB メモリ リアルタイム成長率データ (セクション 3.2) の結果固執します 。
	注: 96 ウェル フォーマットされた結果 (曲線) はリアルタイムでプレート リーダーに表示されます。(OD 値) の時間のレコードをテーブルとしてエクスポートできます。行と列を表すよく数字 (例えば A1、B1) と測定時間 (例えば 00時 00分: 59)、それぞれします</li>。
	<li>表計算ソフトでテキスト ファイルを開きます</li>。
	<li>96 ウェル マイクロ プレートの時間外径 600 読み取りをさらに分析するための新しいワークシートにコピーします</li>。
	<li>バック グラウンド読み込み、減算時間各サンプルの読み込みが時間のゼロも 。
	注意: 便宜上、空白の平均値井戸含む M63 (ステップ 3.2.8) は、バック グラウンド値として使用できます</li>。
	<li>は、最大の人口密度を推定する 5 つの連続した OD 600 読み取りの平均を計算します 。
	注: 5 つの連続した OD 600 読み取りの最大平均値は対応する成長曲線の最大外径 600 として定義します</li>。
	<li>外径 φ 600 の連続する値のすべてのペアの次の式を適用することで成長率、μ (h -1) の計算: 
	<img alt="Equation"src="/files/ftp_upload/56197/56197eq1.jpg"/> 注: この式の C は 私 と C + 1 は、任意の 2 年連続時間の点 (t は 私 と t + 1、OD 600 値を表すそれぞれ)。LN は自然対数を示します</li>。
	4.6 のステップにしたがって <li>計算外径 600 時間に基づいて時間をかけて成長率の変化を読み取ります。平均と最大の成長率を推定する 5 つの連続した成長率の標準偏差を計算します 。
	注: 最小の標準偏差と最大平均値が対応する成長曲線の最大成長率として定義します</li>。
</ol> 5。96 ウェル読み取り (オプション) の世界的なバイアスを確認する 注: 両方のプレート リーダーと消耗の 96 ウェル プレートは、バイアス測定を引き起こすことができます。高精度で再現性のある量的な結果を達成するために 96 ウェル プレートの世界的なバイアスを確認することを強く推奨します。
<ol><li>セクション 3.2.2 で説明したようにバイアスのテストの 96 ウェル プレート、プレート リーダーを準備します</li>。
	<li>滅菌 50 mL 遠心チューブに追加 20 mL M63。同じ遠心管と渦にグリセロール ストックを追加します。滅菌試薬リザーバーに懸濁溶液を移します</li>。
	<li>8 ch ピペットを使用して懸濁溶液 200 μ L を 96 ウェル プレートに転送します</li>。
	<li>プレート リーダーの 96 ウェル プレートを配置し、測定を開始します</li>。
	<li>外径 600 時間のレコードを読み取り、セクション 4 で説明されているように分析します。各ウェルの 96 ウェル読み取りの位置バイアスを決定するための計算された最大成長率と人口密度を比較します</li>。
</ol>

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</ol>

平土屋にありがとう CFU アッセイの例を提供します。この仕事は部分的に財政的に文部科学研究 (C) 号 26506003 の (BWY) に文部科学省から。

プロトコルの重要なステップには、普通株式の指数関数的に成長のセルやマイクロ プレートの様々 な位置に複数の井戸で同じサンプルのレプリケーションの準備が含まれます。以前は、微生物学者は、一晩前文化から文化を始めた。このメソッドは、細菌の増殖のタイムラグを減らすことができます、再現性のある成長曲線を実現することは困難です。図 2のように、共通のグリセロールを使用して独立した測定結果ほぼ同じ成長曲線を再現性と正確な結果を提供します。図 3に示すように、さまざまな場所で井戸与えるわずかに異なる読み取り測定の世界的なバック グラウンドと見なされます。細菌の成長の定量的評価、この背景を検討してください。実験的レプリケーションの種類豊富なプレートの場所で複数の井戸にサンプルの接種は世界的なバイアスを考慮する勧めします。
エラーの処理のほかに由来する実験装置と物資のトラブルシューティングおよび修正は考慮されなければなりません。いくつかの高度なマイクロ プレート リーダーが市販され...

微生物学的研究は、しばしば細菌細胞の培養と細菌の生理1,2,3の基礎的な現象を表す細菌の増殖曲線の評価開始します。基本的な文化の原則は、細菌培養は基本的な方法論研究発表文献や教科書で広く利用可能です。ベンチのレベルに実質的な伝統的に注目されている成長媒体の最適化と培養条件しますが、成長率を制御する、微生物生理学の一層の理解を提供するだろう可能性が高いされていません。広範囲に研究4。指数関数的に増殖する細菌、細胞の状態の重要なパラメーターは成長率は、ゲノム、トランスクリプトーム、プロテオーム5,6,7,8 と調整が報告されています。.従って、細菌の増殖の定量的評価は微生物生理学を理解するため重要です。
細菌の増殖を評価するには、バイオマスを推定する実験手法確立9,10と光濁度など、生化学的、物理的または生物学的パラメーターの検出に基づいています。さらに、成長変化の動的特性をキャプチャするための分析手法はよく確立された非線形モデル11,12,13, たとえば、ロジスティック方程式に基づいています。成長ダイナミクスは文化の細胞の成長の時間サンプリングによる光濁度を測定またはコロニー形成単位 (CFU) 試金の実行によって一般に取得されます。これらの培養と検出法の制限は、データ ポイントは個体群動態の本当の反射の測定間隔時間で多くの場合、ため培養条件 (例えば温度の変化と曝気) は、サンプリング時に邪魔されてます。文化・解析技術は、技術と理解の最近の進歩を使用して更新する必要があります。マイクロ プレート リーダーの最近の進歩は、細菌の増殖のリアルタイム観察を可能し、人件費を大幅に削減します。これらの高度なデバイスを使用して、細菌の増殖に関する最新の研究は、高スループット測定14,15分析法を報告しています。
このプロトコルの目的は、最終的に成長率を決定する方法と、どのような要因に影響を与える成長率の質問に対処する量的研究の価値があるでしょう高スループット方法で正確な成長ダイナミクスを評価することです。プロトコル細菌の増殖での再現性と正確な定量の考慮する必要がありますすべての要因に対処します。実験方法と分析は、メイン テキストで詳細に説明します。このメソッドでは、高スループット方法で細菌の増殖の正確かつ再現性の高い分析ができます。微生物学者たちは、その実験的証拠から追加の量的な結果を導き出すにこのプロトコルを使用できます。このプロトコルは、概念的な結論を描画するまたは成長の理論的概要を達成するためにしようとするシステムバイオロジーの研究も使用できます。

<table><tbody><tr><td>K2HPO4</td><td>和光</td><td>164-04295</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>和光</td><td>166-04255</td><td></td></tr><tr><td>(NH4)2SO4</td><td>和光</td><td>019-03435</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4-7H2</サブ>O</td><td>和光</td><td>138-00415</td><td></td></tr><tr><td>チアミンHCl</td><td>和光</td><td>201-00852</td><td></td></tr><tr><td>ぶどう糖</td><td>和光</td><td>049-31165</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>和光</td><td>080-01066</td><td></td></tr><tr><td>鉄 (II) 硫酸塩七水和物 (FeSO4-7H2O)</td> <td>和光</td><td>094-01082</td><td></td></tr><tr><td>高</td><td>和光</td><td>168-21815</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>ワ</td><td>コー075-00611</td><td></td></tr>遠心<tr><td>チューブ(50 mL、滅菌済み)</td><td>ワトソン</td><td>1342-050S</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ、200 & マイクロ;L</td><td>WATSON</td><td>110-705Y</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ、1,000 &micro;L</td><td>WATSON</td><td>110-8040</td><td></td></tr><tr><td>マイクロチューブ (1.5 mL)</td><td>WATSON</td><td>131-715C</td><td></td></tr><tr><td>8 マルチチャンネルピペット</td><td>WATSON</td><td>NT-8200</td><td></td></tr><tr><td>PASORINA STIRRER</td><td>AS ONE</td><td>2-4990-02</td><td></td></tr><tr><td>ガラスシリンダー (200 mL)</td><td>AS ONE</td><td>1-8562-07</td><td></td></tr><tr><td>精密pH mater</td><td>AS ONE</td><td>AS800 / 1-054-01</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-200</td><td>GILSON</td><td>1-6855-05</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-1000</td><td>GILSON</td><td>1-6855-06</td><td></td></tr><tr><td>使い捨て血清ピペット (10 mL)</td><td>サンプラテック</td><td>SAN27014</td><td></td></tr><tr><td>使い捨て血清ピペット (25 mL)</td><td>サンプラテック</td><td>SAN27015</td><td></td></tr><tr><td>マイクロチューブスタンド</td><td>BM Bio</td><td>801-02Y</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>BM Bio</td><td>BM-V1</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 96 ウェルマイクロプレート(蓋付き)(平底、透明)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Corning、3370</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 試薬リザーバー(50 mL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Corning、4870</td><td></td></tr><tr><td>Stericup GV PVDF (250 mL、0.22 &micro;M)</td><td>Merck Millipore</td><td>SCGVU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Aid XP</td><td>DRUMMOND</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>Bioshaker (BR-23UM MR)</td><td>TAITEC</td><td>0053778-000</td><td></td></tr><tr><td>廃棄セル (1.5 mL)</td><td>Kartell</td><td>1938 / 2-478-02</td><td></td></tr><tr><td>DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>A23616</td><td></td></tr><tr><td>EPOCH2</td><td>BioTek</td><td>2014-EP2-002 / EPOCH2T</td><td></td></tr><tr><td>ビーカー (500mL)</td><td>岩城</td><td>82-0008</td><td></td></tr><tr><td>BIOクリーンベンチ</td><td>パナソニック</td><td>MCV-B131F</td><td></td></tr><tr><td>ガラス管</td><td>日電理化ガラス</td><td>P-10M~P-30 /101019</td><td></td></tr><tr><td>シリコーンゴム栓</td><td>信越ポリマー</td><td>T-19</td><td></td></tr><tr><td>細菌株</td><td>株バンク編成;日本バイオリソースプロジェクト(NBRP)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

細菌の増殖の高精度、高スループットの分析

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

細菌の増殖は、近代の微生物生理学の開発だけでなくシステム レベルでの細胞動態の調査、中心的な概念です。最近の研究では、細菌の増殖とゲノムの削減とトランスクリプトームの再編成など、ゲノム全体のイベント間の相関を報告しています。正しく細菌の増殖を分析は、遺伝子の機能と細胞成分の成長に依存した調整を理解することにとって重要です。したがって、高スループット方法で細菌の増殖の正確な定量的評価が必要です。新興の技術開発は、細菌の増殖を研究するために使用されるメソッドの更新が可能な新しい実験的なツールを提供しています。ここで紹介したプロトコルでは、細菌の増殖の再現性と正確な評価のための非常に最適化された実験手順をマイクロ プレート リーダーを採用しています。このプロトコルは、いくつかの成長を評価に使用した前述のエシェリヒア属大腸菌の緊張。プロトコルの主な手順は次のとおりです: 再現性のある結果、高スループット成長評価の 96 ウェルのプレートの使用の 2 つの大きな手動計算とテストを繰り返して多数の小さな瓶で細胞株の準備(すなわち、最大成長率と人口密度) のパラメーター成長ダイナミクスを表します。伝統的なコロニー形成単位 (CFU) 試金、ガラス管で寒天プレート上で培養している細胞をカウントと比較して本法が効率的ですと成長変化の詳細の時間的な記録を提供しますより厳格です低い人口密度で検出限界。要約すると、この方法は結論を概念や理論的な観察をする使用ことができます細菌の増殖の正確かつ再現可能な高スループット分析のため有利です。

この方法は、(数時間数日から分) からまでのさまざまな時間間隔で複数の光学濃度測定は、96 ウェル フォーマットのリーダーを用いた連続、高スループット方法で動的な細菌の増殖をキャプチャする手段を提供します。各種ゲノムを表現する大腸菌の品揃えの成長曲線を正確に取得するには、単一の実験 (図 1 a) に。記述法と比較して (CFU の試金) の従来の方法は一般的に長いサンプリング時間間隔 (図 1 b) が必要で、複数の文化が必要な場合は、労働集約的です。さらに、CFU の試金のための文化サンプリングたび繰り返し測定のため使用ことはできません細胞培養の少量の使用が必要です。さらに、検出の時間ポイントの限られた数は、成長率と最大外径 φ600の正しい計算に必要なサンプリング ポイントを見落とす可能性があります。しかし、CFU アッセイ、検出下限は、103 - 104セル/mL...

細菌の成長の定量的評価はシステム レベルの現象として微生物生理学の理解に不可欠です。システム生物学への関心のキーの対象は、細菌の増殖の高精度、高スループットの分析を可能にする、実験的操作および分析的なアプローチのためのプロトコルを紹介します。

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

この実験の全体的な目的は、細菌の増殖を高スループットかつ精密に分析することです。この手順を用いることで、複数の培地または異なる菌株を同時に試験することが可能です。この手法は、細胞増殖の決定要因は何かといった、システム生物学および微生物学の分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、細菌細胞の増殖曲線における最大増殖速度および最大個体群密度というグローバルパラメータを、研究者が正確に評価できることです。この方法はE. coliの増殖に関する知見を得るのに有用ですが、環境細菌の増殖アッセイやスクリーニングなど、他の微生物にも適用可能です。まず、滅菌済みのシリコンゴム栓付きガラスチューブ5本、ピペット、および目的の菌株をクリーンベンチ上に用意します。シリコンゴム栓を開ける前に、ガラスチューブの口をブンセンバーナーで火炎滅菌します。チューブを開封した後、シリコンゴム栓を火炎に通し、その後、ガラスチューブにキャップを軽く被せます。次に、電子ピペットと使い捨てセロロジカルピペットを使用して、1本のガラスチューブに5 mLのM63を、他の4本のチューブに4.5 mLのM63を分注します。p200チップを用いてコロニーをピックアップし、5 mLのM63が入ったガラスチューブに接種します。チューブをボルテックスして懸濁液を作成します。次に、この溶液を0.5 milliliters分、4.5 millilitersのM63を含む4本のチューブのうちの1本に移し、溶液を10倍に希釈します。残りのチューブについても同様の操作を繰り返します。ガラスチューブの口とシリコンゴム栓を滅菌した後、ストッパーでチューブを密閉します。次に、5本のチューブを37 °Cに予熱した振盪インキュベーターに入れ、200 rpmで振盪させます。一晩、または10〜30時間培養します。培養後、p1000を用いて使い捨てキュベットに1,000 µLのM63を加えます。使い捨てキュベットを分光光度計にセットします。波長を600 nmに固定してプログラムを開始し、ブランクを測定します。5本のガラスチューブを振盪インキュベーターからクリーンベンチへ移動させます。使い捨てキュベットからM63を廃棄し、p1000を用いて同じ使い捨てキュベットに培養液を1,000 microliters加えます。次に、細胞培養液の光学濁度を測定します。続いて、1.5 milliliterマイクロチューブに滅菌済み60%glycerol溶液を250 microlitersと、選択した細胞培養液を750 microliters加え、ピペッティングにより混合します。残りの9本のマイクロチューブをマイクロチューブスタンドに設置し、調製した混合液を各チューブに100 µLずつ分注します。ストック溶液は-80 °Cの超低温冷凍庫で保存してください。マイクロプレートリーダーの設定を行うには、まずソフトウェアを起動し、タスクマネージャーからプロトコルを開いて、「新規作成」を選択します。次に、標準プロトコルを選択します。手順を開き、設定を調整してください。設定温度を開き、インキュベーターをオンに選択します。次に、温度を37 °Cに、グラジエントを0 °Cに設定します。次のステップに進む前に、プリヒートを確認してください。「start kinetic」を開き、実行時間を24分または48分に設定し、インターバルを30分または1時間に設定します。シェイク設定を開き、シェイクモードをリニアに設定します。連続シェイクを確認し、周波数を567 cpmに設定します。次に、リード設定を開き、吸光度、エンドポイント/キネティック、およびモノクロメーターを確認します。波長を600に設定します。最後に、[validate]をクリックして、手順が正しいことを確認してください。そして、[save]をクリックして、今後のために新しいプログラムとして保存します。成長をリアルタイムで記録するため、滅菌済みの試薬リザーバーにM63を約25 milliliters加えます。次に、段階希釈の準備として、マイクロチューブにM63を900 microlitersずつ加えます。続いて、解凍したグリセロールストックにM63を900 microliters加え、ボルテックスで撹拌します。10倍希釈液を100 µL取り、M63を900 µL含む別のマイクロチューブに移してボルテックスします。目的の希釈倍数に達するまでこの操作を繰り返します。次に、8チャンネルピペットを用いて、滅菌済みの96ウェル平底マイクロプレートの端のウェルにM63を200 µLずつ分注します。参照表に従い、希釈した各サンプルを200 µLずつマイクロプレートのウェルに分注します。加熱による不均一な層の形成や播種効率の影響を避けるため、マイクロプレートの端のウェルにはサンプルを入れないでください。また、同一のサンプルをプレート上の異なる位置にある複数のウェルに分注してください。96ウェルマイクロプレートをプレートリーダーにセットします。ReadNowおよびタスクマネージャーを開き、プログラムを選択します。「OK」をクリックして測定を開始してください。最後に、データ解析のために記録を新しい実験ファイルとして保存します。ここでは、実験前に作成した参照テーブルの例を示します。96ウェルプレートのピクトグラムを8×12の表として描き、96ウェルプレート上における接種培養サンプルの位置を指示しました。増殖速度は、OD600のすべての連続する値のペアに数式を適用して算出します。最大増殖率を推定するため、5回連続の増殖率の平均値と標準偏差を算出した。合計60件の細胞培養の増殖率をヒートマップとして表示している。白から赤への変化は、増殖率が低いことから高いことへの段階的な変化を示している。この手法を習得すれば、適切に順序立てて行うことで数分以内に完了できます。このビデオを視聴することで、ハイスループットな方法で細菌増殖を高精度に測定するための、マイクロプレートへのサンプルの調製およびロード方法について十分に理解できるはずです。この手順を行う際は、細胞密度が低い培養物が現れるのを避け、細胞が24時間以内に増殖を開始することを確認するために、実験前にリファレンス表を作成しておくことが重要です。本手順に続き、集団の増殖やダイナミクスの決定要因などのさらなる問いに答えるため、実験操作の自動化や計算解析などの他の手法を実施することが可能です。この技術の開発により、システム生物学および微生物学の分野の研究者に新たな道が開かれました。これにより、細胞増殖の基本原理の探究や、培地組成の最適化が可能になります。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

出典: 黒川M. ほか。細菌増殖の高精度かつ高スループットの解析。 J. Vis. Exp.

マイクロプレートリーダーを用いた細菌増殖の正確かつ高スループット解析

出典:ケイビーン、M. T.らバチルス・サブティリスの単細胞マイクロ流体解析。J. Vis.

マイクロ流体システムにおける細菌増殖を単細胞分解能で追跡

ScanLagは、成長の遅延、つまり遅延時間、および数千の細胞の並行成長速度を測定するためのハイスループットな方法です。ScanLagを使用したスクリーニングにより、単一のバリアントのレベルで長い遅延時間と成長の鈍化を区別できます。...

ScanLag：ハイスループットコロニーの成長の定量化とラグタイム

(1)細胞内細菌性病原体を標的とする真核生物の細胞浸透性抗菌薬を同時に同定し、(2)真核生物の細胞毒性を評価するために、ハイスループットのリアルタイムアッセイが開発されました。その後、同じ技術のバリエーションをデジタル分注技術と組み合わせて、簡便で高解像度の用量反応、および 2 次元および 3...

高スループット、リアルタイム、細胞内抗菌活性のデュアル読み出しテストおよび真核細胞の細胞毒性

マイクロチター皿における放射標識細菌培養物の成長は、(p)ppGppを含むヌクレオチドプールの豊富さの複数の技術的および生物学的複製アッセイを可能にする高スループットサンプリングを促進する。生理的ストレスの原因によって引き起こされる成長遷移の影響だけでなく、ストレスからの回復を監視することができます。.

大腸菌(p)ppGppの複数の生体内測定に対するマイクロチター皿放射ラベリングの使用、その後に薄層クロマトグラフィー

この方法では、細菌細胞における簡潔な生きたレポーターアッセイを用いて、RNA結合タンパク質(RBP)の結合親和性を、簡潔で生きたレポーターアッセイを用いて認知および非認知結合部位に定量する。アッセイはレポーター遺伝子の抑圧に基づいています。...

細菌におけるタンパク質-RNA結合を定量するためのアッセイ

細菌の適合性を決定するためのこの分子ベースのアプローチは、デジタルPCRを介して定量化されたユニークなゲノムDNAバーコードを使用して微生物の正確かつ正確な検出を容易にします。プロトコルは、サルモネラ株の競争力指数の計算について説明します。しかし、この技術は、遺伝的に可鍛性の生物の絶対的な定量を必要とするプロトコルに容易に適応可能である。...

サルモネラ菌におけるフィットネスのハイスループット分析に関するデジタルPCRベースの競争指数

このプロトコルは、単一細胞および細胞集団レベルでのストレス条件下での細菌増殖の時間分解された記述を可能にする。...

ストレス治療下での細菌増殖の多スケール分析

酵母増殖型は、マイクロコロニーに成長する固定化細胞の高度に平行なタイムラプスイメージングを通じて正確に測定される。同時に、ストレス耐性、タンパク質発現、タンパク質の局在化を監視し、統合データセットを生成して、環境と遺伝的の違い、およびイソジェニック細胞間の遺伝子発現不均一性を研究し、成長を調節することができます。...

成長と遺伝子発現の不均一性を測定するマイクロコロニーのハイスループットライブイメージング

ここではでプラスミド過剰発現の画面を説明...

ハイスループット酵母プラスミドの過剰発現の画面

学ぶ細菌の高精度・高スループット増殖解析法。複数培地や異なる株を同時に評価し、最大増殖速度や最大菌体密度を正確に測定できます。E. coliや環境細菌のスクリーニングにも応用可能です。

細菌の増殖の高精度、高スループットの分析

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