マウス網膜細動脈Ex Vivoでの反応性の測定の準備手順

この網膜標本作成法の全体的な目的は、ビデオ顕微鏡を用いてマウスの網膜動脈の反応性を測定することです。この手法は、網膜血流調節の分野における重要な疑問の解決に寄与し、さまざまな眼疾患の病態生理の理解を深めるのに役立ちます。この新しい技術の主な利点は、極めて高い光学分解能で網膜血管の反応性を測定できることです。

同時に、高度な装置を多く必要としません。一般的に、この手法に不慣れな方は、眼動脈とその分枝を特定するのが困難なため、苦労することがあります。ここでは、私の研究室の大学院生であるJenia Kouchek Zadeh氏およびWael Omran氏と共に、この手順を実演します。

必要な器具を準備し、実験手順に備えます。次に、鋼製ハサミを用いてマウスの頭蓋骨を正中線に沿って矢状方向に2等分し、眼科用ハサミで皮膚と脳を除去します。眼科用ハサミを用いて、眼窩骨のみが残るまで頭蓋骨を除去し、手術顕微鏡下で、氷上の氷冷Krebs-Henseleit緩衝液が入った解剖皿に眼窩を移します。

眼科用鋏で眼窩骨を切断し、4番精密ピンセットと学生用Vannasバネ鋏を用いて、眼球と眼窩組織を慎重に除去します。5番精密ピンセットとVannas嚢白切開鋏を使用し、眼動脈の主枝を損傷しないように注意しながら、ハードナー腺、結合組織、および外眼筋を慎重に取り除きます。10-0ナイロン縫合糸を用いて眼動脈主枝の近位端にある眼窩枝を結紮し、4番精密ピンセットを用いて眼球を70% ethanolを含むペトリ皿に移します。

実験中の漏出を防ぐため、眼動脈のすべての眼窩分枝を結紮することが非常に重要です。10秒後、眼球を解剖皿に戻します。エタノールの曝露により、角膜は白っぽく見えます。

バッファーを新鮮なKrebs溶液に交換し、顕微鏡と3ゲージの針を用いて角膜周辺部を穿刺します。Vannas被膜切開用ハサミを使用して角膜を剥離し、虹彩組織を慎重に切り離します。次に、Vannas被膜切開用ハサミの鋭い先端の一つを脈絡膜と網膜の間に挿入し、脈絡膜と強膜を切除します。

カスタムメイドの灌流チャンバーに網膜を固定するには、まずニードルホルダーを使用して、先端径100 µmのガラスマイクロピペットの端をチャンバーのシリコンチューブに押し込みます。次に、チューブの反対側にシリンジを接続し、マイクロピペットの先端から不純物を洗い流します。灌流チャンバーに冷えたKrebs緩衝液を満たし、チャンバーを実体顕微鏡の下に配置します。

灌流チャンバー内に、直径1.6 mmのステンレスワイヤー2本を配置し、その上に1.8 mmのくぼみがある透明なプラスチックプラットフォームを設置して、プラットフォームの上にステンレス製リングを置きます。スプーンを用いて、眼動脈が付着したままの視神経付き網膜をプラットフォーム上に移し、眼動脈の縫合端を取り除きます。10-0ナイロン縫合糸で作成した2つのループをマイクロピペットにかけ、縫合糸で動脈をマイクロピペットに固定します。

1本の精細ピンセットを使用して網膜を透明プラットフォーム上に配置し、別の精細ピンセットを使用して前嚢を慎重に切り開きます。水晶体を取り出し、マイクロシザーズを用いて水晶体嚢全体と硝子体を切除します。次に、pars planaから視神経までの距離の半分で、網膜に4本の放射状の切開を加え、ステンレス製リングを網膜上に配置して、網膜をプラットフォームに固定します。

網膜細動脈を解析の準備にするため、灌流チャンバーを光学顕微鏡下に移動させ、100倍の水浸対物レンズを選択します。チューブをパラサイクリックポンプの流入および流出ポートに接続し、95% oxygen で酸素供給し 5% carbon dioxide で炭酸ガス化した 37 degrees Celsius の Krebs buffer でチャンバー内を循環させます。マイクロピペットを備えたシリコンチューブを三方活栓を介してリザーバーシリコンホースに接続し、リザーバーに Krebs buffer を 50 millimeters of Mercury に相当する高さまで満たします。

対物レンズを使用して、網膜表面に手動でピントを合わせ、血管または赤血球を探索します。血管が見つかったら、その血管にピントを合わせ、三方コックを開きます。すると、直ちに血管径が増大し、赤血球が現れます。

30分間の平衡化期間後、細小動脈には10%未満の管腔径減少を伴う弱い固有緊張が生じます。マウス網膜制限試薬をバス溶液に加え、血管の生存能を確認します。次に、ポンプを循環させてバス内からアゴニストを洗浄し、チャンバーに新鮮なKrebs緩衝液を加えます。

この代表的な実験では、トロンボキサン模倣剤であるU46619を用いて、野生型C57Bl/6Jマウスの網膜細動脈において濃度依存的な血管収縮反応を誘導しました。1×10⁻⁶ Mの濃度において、管腔径は静止時から約50%減少しました。アゴニストで事前収縮させた細動脈にアセチルコリンを累積的に投与したところ、1×10⁻⁵ Mのアセチルコリン濃度で管腔径が事前収縮時の約25%まで濃度依存的に増加し、血管内皮が正常に機能していることが示されました。習熟すれば、適切に実施することでこの手法は90分から120分で完了できます。

これらの手順を行う際は、眼球を開く前に眼窩後方のすべての動脈枝を結紮して眼球をエタノールに浸し、眼動脈の捻転を防ぐこと、および最後にガラス製マイクロピペットチップに詰まりがないかを確認することを忘れないでください。このビデオを視聴することで、in vitroでのビデオ顕微鏡による動脈測定に向けて、マウス網膜をどのように準備するかについて十分に理解できたはずです。