Name: 解離マウス皮質ニューロンの培養の準備 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 2 s
Description: 学ぶマウス皮質ニューロンの解離培養法。産後早期マウスから神経細胞を分離し、電気生理学やカルシウムイメージングなどの神経科学研究に応用する実験手法を解説しています。

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培養の一日前の準備： <ul><li>無菌解剖ソリューション（DS）を準備する。 </li><li> NBM/B27（B27サプリメントとNeurobasal Mediom）を準備する。 </li><li>オートクレーブのddH 2 O及び必要に応じて、ガラスのcoversilpsを滅菌する。 </li><li>ポリ- D -リジンでコーティングの組織培養皿またはガラス製カバースリップ。 </li></ul>ポリ- D -リジンコーティング： 無菌条件下で培養前日に準備します。 <ul><li>氷上で10倍PDLと場所のアリコートを解凍。 </li><li> PDLの1mlに9 mlの滅菌超ろ過水を追加し、（1X）よく混ぜる。 </li><li>次のように、室温で一晩1X PDLとコートサーフェス： <ul><li>ガラスカバースリップ（Bellcoガラス、株式会社カタログ番号1943から00012まで。）：75μlの/カバースリップ OR </li><li> 24ウェル培養プレート：300μL/ウェル OR </li><li> 35mmの培養皿：1ml/dish </li></ul></li><li>滅菌水で5倍リンス（液体を吸引するために滅菌パスツールピペットを使用）。 </li><li>表面が完全に乾くまで水を取り外します。 </li></ul>培養の手順（無菌条件下で層流フードで行われている） <ol><li>スーパー接着剤を使用してミクロトームVibraslicer（カムデンインスツルメンツ社）の支持ブロックの上に寒天とのり、それのブロックをカット。 </li><li>後期胚のステージ（E17 - 18）マウス胎児、euthaniseダムを使用する場合は、胚性袋から子宮と無料の個々の胎児を削除します。場所は、滅菌シャーレに胎児​​と、下記のとおり継続する。 </li><li>首を切るのマウスの胎児や子犬（あなたの動物実験使用の委員会で承認された以下のガイドライン）。 </li><li>冷たいDSで満たされた60ミリメートルのペトリ皿にワットマン濾紙ディスクに皮膚や頭蓋骨と場所の脳を取り外します。 </li><li>滅菌カミソリの刃を使用して小脳を切り取ります。 </li><li>スパチュラを用いて脳をピックアップし、ろ紙上に余分な水分を排出し、代わりにVibraslicerの支持ブロックと接着剤の脳（尾側を上にして寒天が直面している腹側の部分）に脳を転送する。 </li><li>冷たいDSでチャンバーを埋める。 8-9速度のセレクタを設定します。 </li><li>嗅球から始まる、200から400μmのセクションをカット。 Vibraslicerの刃が皮質に入ると、600μm冠状セクションに切断開始。 P0マウス脳では4月5日使用可能なスライスをもたらす間、E17 - 18マウスの脳は、通常、3-4使用可能なスライスが得られます。 </li><li> 10ミリリットルのガラスパスツールピペットをアンプラグインの逆の端を使ってDS 2とラベル付けさ35ミリメートルのペトリ皿に脳スライスを転送する。 </li><li>大脳皮質を摘出し、キャピラリーチューブから引き出さガラス針を用いて髄膜を除去。 </li><li>小片、長さは0.5〜1ミリメートルに皮質rindsをカット。 </li><li> 0.2μmのフィルターESは、35mmシャーレに5ccのシリンジに接続されたフィルタ。 </li><li>フィルタ処理されたESを含むペトリ皿に皮質組織片を移し。 </li><li> 37℃で30分間インキュベートします。 </li></ol>一方で： <ol><li>フード、Vibraslicerと解剖ツールをクリーンアップします。 </li><li> 60ミリメートルのペトリ皿に暖かいNBM/B27 5 mlを加える。 </li></ol> 30分後。インキュベーション： <ol><li> 10 mlのDSに組織を移す。 1分間のために解決しましょう​​。 </li><li>第一こんにちはチューブの渦に組織を移し、2〜3分のために解決しましょう​​。 </li><li>第二Hiに転送する。上記のように繰り返す。 </li><li>第一リーに転送する。上記のように繰り返す。 </li><li>第二リーに転送する。上記のように繰り返す。 </li><li>第三リチウムに転送する。上記のように繰り返す。 </li><li>メディア60 mmディッシュに組織を移す。 </li></ol>解剖顕微鏡の下で： <ol><li>組織からごみを清掃し、そっとティッシュをほぐすためにプルアップガラスピペット（減少ボアサイズを使用）を通過させることによって、各部分を砕いて粉にする。 </li><li> NBM + B27の残りを含む15 mlのコニカルチューブに細胞懸濁液を移す（24ウェルプレートまたは5の11ミリリットル、13 mlの合計を作る - 35 mmの培養ディッシュ穏やかに混合し、解決するために組織の大部分を待つ）。 </li><li>転送細胞懸濁液（24ウェルプレートあるいは2 ml / 35 mmの培養ディッシュ/ウェル0.5ml）を。 </li><li>ガラス製カバースリップを使用する場合は、カバースリップあたり80μlの細胞懸濁液を追加し、細胞がより多くのNBM/B27メディアでチャンバーをフラッディングする前に付着するための組織培養インキュベーターで1時間を可能にする。 </li><li> 37℃、5％CO 2で培養を維持する。 </li></ol>次の日 24ウェルプレート：（cNBM/B27; cNBM/B27培地の調製のための議定書下に表示される）NBM/B27培地を条件付け0.5ミリリットル非神経細胞の各ウェルをフィード 35ミリメートル料理：cNBM/B27培地に0.5 mlを交換してください。 新鮮なcNBM/B27ごとに2〜3日で培地の0.5ミリリットルを置き換えることにより、文化を維持する。 培養培地は、グリア細胞の増殖を促進しないが、培養は、必要に応じてさら​​にグリア細胞の数を減らすために、文化の日3月5日で5μMFDU（5 - フルオロ-2&#39; - デオキシウリジン、シグマF0503）で処理することができます。 セット<html> - UP解剖と文化のための 70％EtOH中で解剖ツールを殺菌したり、それらをオートクレーブ： <ul><li>はさみ（med.と小）ヘラ（med.と小） </li><li>ピンセット（med.と小）レーザーブレード</li><li> vibraslicerバッファ風呂用ブレード</li><li>脳のためのブレードをサポートするための小さな金属製のくさび</li></ul>その他の材料： <ul><li>ペトリ皿（60 mm）の</li><li>ペトリ皿（35ミリ） </li><li>ろ紙</li><li>ガラスピペット10ミリリットル</li><li>滅菌ディスポーザブルピペット、5,10および25ミリリットル</li><li>シリンジフィルター、0.2μmの</li><li>シリンジ5ccの</li><li>遠心分離チューブ、15ミリリットル</li><li>滅菌パスツールガラスピペット</li><li> PDLコート培養皿またはガラス製カバースリップ</li></ul>ラベルsix 15 ml遠心チューブと準備は、次のとおりです。 チューブ＃1：酵素溶液： を含む5mlのDSにパパイン（ワーシントンLS 03126）の50 Uを追加します。 <ul><li> L -システインの100μL（0.8mg） </li><li> 7μlの0.1N NaOHを</li><li> 50μlのAPV（5mm）で</li></ul>クリアするには、室温でソリューションを残す。酵素溶液は、最初は&quot;曇り&quot;に表示され、使用前にクリアする必要があることに注意してください。 チューブ＃2＆＃3：ハイ酵素阻害薬： 3ミリリットルDS + 300μlのBSA /チタン+30μlのAPV（5mm）で提供されます。 泡を避けるために静かに混和、2つの1.5ミリリットルのアリコートに分ける。 チューブ＃4 - ＃6：低酵素阻害薬： 8ミリリットルDS +80μlのBSA /チタン+80μlのAPV（5mm）で提供されます。 泡を避けるために穏やかに混合、三2.6ミリリットルのアリコートに分ける。 場所チューブは氷上に＃6を介して第2の番号。チューブ＃1（酵素液）、室温で残す。 ソリューション、アリコート<ul><li>ソリューション（緩衝生理食塩水）シグマフォーミュラ重量500ミリリットル[濃] </li><li>塩化ナトリウムNaClのS - 9625 58.45 80.0グラム137mM </li><li>塩化カリウムKClのP - 4504 74.56 4.0グラム5.4mM </li><li>ナトリウム二塩基性リン酸、無水Na 2 HPO 4、S - 0876 142.0 0.24グラム0.17mM </li><li>一塩基性リン酸カリウム、無水KH 2 PO 4、P - 5379 136.09 0.3グラム0.22mM </li></ul> 400ミリリットル超ろ過水で溶解するまですべての食材とミックスを秤量。 500 mlに最終的なボリュームをもたらす。きれいな瓶とオートクレーブ内の場所。 4℃とラベル&quot;DSソリューション&quot;。 <ul><li>ソリューションB（HEPES）シグマフォーミュラ重量250ミリリットル[濃] </li><li> HEPESヘペスH - 3375 283.3 20.97グラム9.9mM </li></ul> 200mlに超ろ過された水を追加します。溶解するまで混合し、250mlに最終的なボリュームをもたらす。きれいな瓶とオートクレーブ内の場所。 4℃とラベル&quot;DS B液&quot;。 <ul><li>ワーキング溶液500ミリリットル[濃] </li><li>超ろ過された水400ミリリットル</li><li>ストック溶液25ミリリットル</li><li>ストック溶液B 14ミリリットル</li><li> D（+） - グルコースシグマG - 8270 3.0グラム33.3mM </li><li>スクロースシグマS - 0389 7.5グラム43.8 mMの</li></ul> 1N NaOHで7.4にpHを調整する。超ろ過された水で500 mlに最終的なボリュームをもたらす。きれいなガラスのボトルやオートクレーブにデカント。 4℃で保存します。ラベル&quot;解剖ソリューション&quot;。 ポリ- D -リジンの準備： <ol><li> 1mg/mlで無菌H 2 Oで、ポリ- D -リジン（シグマP - 7280 PDL）の10倍のストック溶液を調製。 </li><li> 1.0mlのアリコートを行います。このソリューションは、3ヶ月間-20℃で保存することができます。 </li></ol> MEDIA <ol><li> 10mlのを追加するB - 27サプリメント（Gibco社17504〜044）500mlのNBMボトル（Neurobasalミディアム、ギブコ21103から049）へ。 </li><li> 4で40 mlのアリコートとストアを行う℃に</li></ol> APV <ol><li> 10 mgのAPV（2 -アミノ-5 - phosphonopentanoic酸、シグマA - 5282）のバイアルに10 mlの滅菌H 2 Oを加えてよく混ぜる。 </li><li> -20℃で180μlのアリコートとストアを準備する</li></ol> BSA / Tiの <ol><li> 10 mlのDSで1グラムBSA（ウシアルブミン。シグマA - 7030）および1gトリプシンインヒビター（Sigma社T - 9253）を溶解する。 </li><li> 1N NaOHで7.4にpHを調整する。 </li><li> 0.2μmのシリンジフィルターを通して濾過することにより滅菌する。 </li><li> -20℃で400μlのアリコートと店に分ける</li></ol> L -システインエッペンドルフチュー​​ブに200μlのDSで0.6 mgのL -システイン（シグマC - 7755）を溶解する。 寒天（4％） <ol><li> 100ミリリットル滅菌水でバクト寒天4gの（ディフコ0140〜01）を溶解する。培養のために必要とされるまで4℃で保管してください。 </li><li>マイクロ波の寒天は、35mmペトリ皿を溶融し、充填する。クールダウンして重合するために座ってみましょう。 </li></ol>パパイン（ワーシントンLS 03126） NUNC培養ボトルIN&quot;&gt;非神経の文化をe_title コー​​ティング培養ボトル（4ヌンクボトル） <ol><li> 1X PDLを作るために10X PDLの3管のそれぞれに9 mLの滅菌水を追加。 </li><li>最初のボトルに30 mlの1X PDLを転送します。 </li><li>すべての成長の表面が覆われるまで若干移動する。 1分間放置します。 </li><li>第二瓶に1X PDLを転送する。 1分間放置します。 </li><li>目と前後のボトルで繰り返します。 </li><li> 150ミリリットル滅菌H 2 Oで2倍、4つのボトルをすすぐ</li></ol>酵素溶液（ES）を準備します。 <ol><li>結晶が溶解するまで0.8 mgのL -システイン（シグマC7755）を0.6ミリリットルの遠心管の重量で、150ミリリットルDSと渦を追加します。 </li><li> 15 mlコニカルチューブに5 mlのDSを転送して、L -システイン150ミリリットルを追加します。 </li><li>パパイン50ユニットを追加。 （ワーシントンLS 03126） </li><li> 7ミリリットル0.1N NaOHを追加します。 </li></ol> PREPARE MEM（GIBCO＃11090〜081） <ol><li> 500mlのMEMのボトルから65 mlを削除します。グルコースを準備するために10mlを保存します。 </li><li> 5ミリリットルペン/連鎖球菌を（Gibco社＃15070から063）を追加します。 </li><li> 10ミリリットル1Mグルコース（シグマG - 8270）（1.8グラム/ 10ミリリットルMEM）を追加します</li><li> 50ミリリットルのウシ胎児血清（ギブコ＃16140から071）または仔ウシ血清（オメガBC - 04）を追加します。 </li><li> 4でよく混ぜ、分注し、店舗℃の</li></ol> NEUROBASAL MEDIUM/B-27のサプリメント（NBM/B27） NBM、500ミリリットル（ギブコ＃21103から049）、B - 27（50X）、10ミリリットル（ギブコ＃17504〜044） <ol><li> NBMボトルとミックスにB - 27バイアルの全体の内容を追加します。 </li><li> 4℃で分注しストア</li></ol>脳組織の郭清<ol><li>ドライ解剖前の70％EtOHからツールを解剖。 </li><li> 3〜15ミリリットルチューブのそれぞれに10 mlのDSを転送します。 </li><li>仔マウス（P0 - P3）を選択すると、4本に3つの頭脳が必要になります。 </li><li> 35ミリメートルのペトリ皿に冷たいDSを追加。 </li><li>子犬マウスを刎ねると頭脳をばらばらにする。 </li><li>コー​​ルドDSを含むペトリ皿に脳を置きます。 </li><li>ガラスピペットを通過するのに十分小さい部分、に組織を切る。 </li></ol>酵素解離<ol><li>パスツールピペットでシャーレからできるだけ多くのDSを削除します。 </li><li> 0.2μmのフィルターと5ccシリンジを介してフィルタのES。 </li><li>組織と皿の中でESを置きます。 </li><li> ℃のインキュベーター（CO 2フリー）が30分間37℃で組織をインキュベートする。 </li></ol>組織を洗浄<ol><li>できるだけ少ないESとして取得することを確認しながら、最初のDSのチューブにガラスピペットで組織を転送する。 </li><li> 1500rpmで30秒間遠心します。 </li><li>組織と繰り返し手順をさらに2回転送する。 </li></ol>粉砕<ol><li> 50ミリリットル遠心管にMEM / FBSの38 mlを置きます</li><li>このペトリ皿に35mm皿と伝達組織にMEM / FBSの3 mlを追加します。 </li><li>優しく1000μlエッペンドルフピペットチップを介して摩砕することにより、組織を解離する。 </li><li> MEM / FBSの38ミリリットルを含むチューブに細胞懸濁液を移し、よく混ぜる。 </li></ol>めっき<ol><li>各ボトルに細胞懸濁液とメディアの同量を得るために直立培養ボトルスタンド。 </li><li>各培養瓶でMEM / FBSの90 mlを置く。 </li><li>各瓶の細胞懸濁液10mlを追加。 </li><li>ラベル：非神経、イニシャルと日付。 37℃および5％CO 2をインキュベートする。 </li></ol>摂食<ol><li> 3日目または4日に、暖かいMEM / FBS（デカントすべてのメディアとMEM / FBSの100mlでそれを置き換える）とフィード細胞。文化は、コンフルエントになるために7〜10日かかることがあります。 </li><li>デイ7-10 NBM/B27のメディアを変更してください。 </li><li>次の日、メディアを収集する。 0.22μmとフィルタ</li><li> 40mlのアリコートを作成し、MEM / FBSで培養を養う。 </li><li> 2または3日間、次の、NBM/B27ためにメディアを変更する</li><li>翌日、収集し、手順を繰り返します。 </li><li>約のためのメディアを集めておいてください。 2週間。 </li></ol>

著者に開示すべき事項はありません。

<table><tbody><tr><td>5-フルオロ-2&amp;rsquo;-デオキシウリジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Vibraslicer</td><td>Campden Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876</td><td></td></tr><tr><td>リン酸一カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D (+)-グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-D-リシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>B27サプリメント</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal培地 (NBM)</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>2-アミノ-5-ホスホノペンタン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>トリプシンインヒビター</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9253</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム 1N溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>L-システイン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7755</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco Laboratories</td><td>0140-01</td><td></td></tr><tr><td>パパイン</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS 03126</td><td></td></tr><tr><td>滅菌済み 0.2 &amp;mu;m シリンジフィルター</td><td>Fisher Scientific</td><td>DDA02025S0</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバーガラス No1, 12mm</td><td>Bellco Glass</td><td>1943-00012</td><td></td></tr><tr><td>最小必須培地 (MEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11090-081</td><td>Earle&amp;rsquo;s salts含有、L-グルタミン不含。非神経細胞培養の増殖に使用。</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td>非神経細胞培養用</td></tr><tr><td>胎児ウシ血清</td><td>Invitrogen</td><td>16140-071</td><td>非神経細胞培養に使用</td></tr><tr><td>Nunclon &quot;Triple Flask&quot; 組織培養ボトル</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-25</td><td>非神経細胞培養に使用。これらのフラスコは&quot;条件付け Neurobasal培地/B27&quot;を調製する際に非常に便利だが、他の組織培養フラスコやディッシュでも代用可能。</td></tr><tr><td>ガラス底 &quot;イメージングディッシュ&quot;</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td>ガラス底の35mm培養ディッシュ。倒立イメージングセットアップを用いたカルシウムまたはナトリウムイメージングに最適。ただし高価である。</td></tr></tbody></table>

解離マウス皮質ニューロンの培養の準備

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

このビデオでは、後期胚と早期出生後マウス脳から皮質ニューロン培養を生成するためのプロセスをガイドします。これらの培養物は、免疫細胞化学、生化学、電気生理学、カルシウムやナトリウムイメージング、蛋白質および/またはRNA分離など、様々なアプリケーションに使用することができます。これらの文化はまた、後期胚または出生後致死遺伝子の突然変異を運ぶトランスジェニック動物の神経発達を研究するためのプラットフォームを提供しています。手順は比較的単純であり、組織培養技術のいくつかの経験を必要とし、あなたが適切に準備されている場合2〜3時間を上回ってはいけません。視床皮質線維路から皮質外皮を慎重に分離が不要な非神経細胞の数が削減されます。上げるには神経細胞の収量は、酵素インキュベーションステップの後に優しく皮質組織片を砕いて粉にする。それが細胞や未熟神経細胞死への不必要な傷害を防ぐため、これは不可欠です。これらの文化は、グリア細胞のフィーダー細胞の非存在下で維持されているので、彼らはまた、神経細胞に富む成長する文化の付加的な利点を提供します。

このビデオでは、後期胚と早期出生後のマウス皮質からニューロン培養を生成するための手順を示しています。これらの培養物は、免疫細胞化学、生化学、電気生理学、カルシウムとナトリウムのイメージングに使用され、出生後致死遺伝子の突然変異を運ぶトランスジェニック動物の神経発達を研究するためのプラットフォームを提供することができます。

このビデオでは、マウスの胎生後期および出生直後の脳から皮質ニューロン培養細胞を作製するプロセスについて解説します。これらの培養細胞は……

こんにちは、Hilgenbergです。私はカリフォルニア大学アーバイン校の解剖神経生物学部門で研究しています。本日は、マウスを用いた皮質培養の調製方法について解説します。これらは、ニューロンを調製するために使用する生後〇日目のマウスです。通常、これらの培養細胞は、電気生理学的解析、またはタンパク質やRNAの調製に使用します。また、カルシウムイメージングやナトリウムイメージングにも同様の培養調製法を用います。これらの培養法の優れた点は、実際にはバンカープロトコル（Banker protocol）を適応させたものですが、グリア細胞のフィーダー細胞を用いずに培養できることです。これにより利便性が大幅に向上し、通常、培養物はグリア細胞よりもニューロンが豊富になります。それでは、ニューロンの調製方法について説明します。さて、脳を取り出して実際の解剖を開始できる段階になりました。しかし、その前に、これらの細胞を播種するカバーガラスはコーティングしておく必要があることに触れておくことが重要です。通常、私たちはポリスリン濃度 0.1 mg/mL で、室温にて一晩コーティングを行っています。そして翌日、ポリスリンを除去し、カバーガラスを3回連続で洗浄します。用途に応じて、大きなディッシュや小さなディッシュを使用するか、あるいはガラスカバースリップを使用します。さて、これがクリーンベンチの一般的なセットアップです。準備しておくべき溶液と、脳の単離または解剖、そして実際の脳の切断に役立つ器具について簡単に説明しました。ここにあるのが、冷却した解剖用溶液です。通常、試料は氷上に置いておきます。脳を切断するためにバイブレーティングミクロトーム（Vibratome）を使用します。脳を固定して切断するための、解剖液が入った容器を用意しています。そして、脳の摘出に必要なさまざまなツールがあります。ここでは、脳を固定するために使用するオーガープレートを用意しています。シリンジ、滅菌フィルター数個、Rotmanペーパーディッシュ、およびさまざまなサイズのペトリ皿が必要です。そして、これがマウス用パイピングツールです。また、ここには引き伸ばしガラスピペットも用意しています。これらは、解剖ツールとして、また脳片を回収し、基本的にこれらを繰り返すために使用するガラスキャピラリーです。酵素溶液には解剖溶液が含まれています。そこには、papainを活性化するためのL cysteineと、pHを調整するための0.1 normal sodium hydroxideが含まれています。ペパインを添加すると、溶液はわずかに不透明になります。組織の酵素消化に実際に使用する前に、溶液を透明にする必要があります。これで、手順を開始する準備がほぼ整いました。Fibro Slicerの準備が完了しています。脳をセクショニングするためのブレードを挿入し、バッファーを含み脳を支持する容器をその下に配置しました。次に、脳を支持するためのサポートプレートにAGAブロックを固定する準備をします。このAGAは硬化した状態で、濃度は4% AGAであり、このように領域を切り出します。次に、側面を基本的に長方形にオーガーカットします。そして、スパチュラを使用して、オーガーブロックからこの部品を取り出します。これで、オーガーの平らな面を前に向けた状態で、サポートプレートに接着します。これが脳を接着させ、このオーガで固定するための台座です。このようにして切片を作成することで、脳が後方に移動するのを防ぎます。これで、脳を取り出す準備が整いました。通常、P0またはP1のマウスを使用します。それでは、これが切断したマウスの頭部です。すぐに頭皮を除去します。まず、ここにある筋肉の帯と、反対側の筋肉の帯を切開します。次に、ハサミで切開します。この際、ハサミの内側で脳を傷つけないよう細心の注意を払います。そして、頭蓋骨の周囲を両側から切断します。ここで軟骨を慎重に持ち上げ、小型のULAを用いてこのように脳を取り出します。取り出した脳は、セクション溶液を満たし、底にワットマンろ紙を敷いたペトリ皿に移します。次に、脳をホルダーに固定するための平坦で安定した面を作るため、脳の基部を切断します。まず、支持プレートに少量のKure-fix（瞬間接着剤）を滴下します。次に、スパチュラで脳を取り出します。この際、カーブ鉗子を使って補助します。そして、解剖液で付着した余分な液体を軽く取り除き、脳をオーガー支持体に固定します。これで脳を緩衝液バスに転送する準備が整いました。まず、小さな容器に解剖用溶液を加え、脳を固定するサポートを設置します。脳がブレード（刃）に面するようにマウントします。さて、脳の固定が完了しましたので、フィブロスライサーを使用して脳の始端を探しながら、脳をブレードの方へ移動させます。まず、嗅球の端を少し切除しました。次に、ブレードを約600 µm下方へ移動させ、もう一度切断します。これにより、皮質をちょうど通過することになります。皮質部分が刃の上に乗り上がります。ここから刃をさらに600 µm下げて、2番目の切片を切り出します。この操作は中断することなく、連続的に、かつスムーズに行うことが重要です。ブレードを引き抜くと同時に、ファイバースライサーを停止させます。次に、ガラスピペットを使用しますが、ここではあえて逆向きに使用します。ピペットの後端を使い、この皮質切片を吸い上げて、清潔なペトリ皿に移します。P0またはP1のマウスにおいて、約5〜6枚のスライスを回収するまで、常に600 µmずつ脳を切り進めます。そして、皮質の末端に達するまで継続します。これで、脳の他の部位から皮質を分離する準備が整いました。それでは、解剖器具のように鋭い、引き伸ばしたガラス製ピペットを使用します。まず、最も小さく、除去する必要がある嗅球がある最初のセクションから開始します。また、このサンプルの髄膜も除去します。 l再び、この部位から嗅球を除去し、髄膜から剥がしていきます。時折、容易に分離できない箇所がありますが、そのような部分はそのままにしておき、良好な部位のみを取り出します。常に片方の端から進め、一つのセクションずつ順番に処理していきます。髄膜を除去することが重要です。また、これらの切片を確認する際、翻転させて、この調製において不要な非神経細胞の多くが含まれている神経線維束の位置をより明確に確認したい場合があります。さて、この切片では、皮質層の下にこの線維束がはっきりと見えます。したがって、皮質層が終わるちょうどその間に刺し、この調製で避けたい非神経細胞の多くが含まれる線維束を指し示します。したがって、繊維束を後に残すように、この線に沿って切断します。ここでは、組織を小さな立方体に細切にします。さて、シリンジに取り付けた0.2 micronフィルターを通して、酵素溶液を滅菌しています。そして、このように皮質片に直接これを加えます。すべての皮質片が十分な液体に浸っていることを確認してください。その後、皮質片を37°Cのインキュベーターで30分間インキュベートします。これにより、組織がかなり緩みます。さて、皮質片をインキュベーターで30分間インキュベートしました。その間に、最終的にこれらの細胞を培養することになる、B 27サプリメント添加のニューロベーサル培地を温めておきました。また、こちらにいくつかの溶液を準備しています。まず1つ目は、解剖用溶液です。したがって、これは通常の解剖用溶液です。その後、スカベンジャーとしてBSAを含み、NMDA受容体成分をブロックするためのAPVを含む、高濃度のトリプシン抑制剤溶液に移します。続いて、低濃度のトリプシン抑制剤、BSA、およびAPVによる洗浄を3回行います。それでは、プロパン溶液からこれらの組織片を取り出し、DS解剖用溶液を入れたコニカルチューブに移します。これらの凝集塊は重力によって下降し、チューブの円錐部分にすべて沈みきるまで1〜2分かかる場合があります。その後、凝集塊を再び回収し、高濃度のトリプシン阻害剤を含む溶液に移します。ここでも、これらの凝集塊がチューブの底に沈むまで待ちます。高濃度のトリプシンインヒビター溶液でさらに1回洗浄した後、これらの凝集塊を低濃度のトリプシンインヒビターで洗浄します。最後の洗浄と低濃度酵素インヒビター処理の後、細胞をあらかじめ温めておいたNeurobasal培地に移し、口径の小さいガラスキャピラリーで細胞を上下にトリチュレーション（ピペッティング）することで、機械的に細胞を解離させます。これから細胞と組織凝集塊のトリチュレーションを行います。ですが、その前に、ここで見えているデブリをすべて取り除きます。例えば、細胞から漏れ出したタンパク質やDNAが、組織の塊に付着した綿のような物質を形成しています。これらがピペットチップを詰まらせ、直径の小さい穴に無理に組織を通そうとすることになるため、まずこれを取り除いておく必要があります。次に、これらのガラスキャピラリーの一部を破断させ、細胞を出し入れするのに適したサイズの開口部を作成します。これは良好なピペットです。こちらを見ると、先端が綺麗に丸くなっており、鋭利なエッジがないことがわかります。これをマウス用パイプヒッターに装着します。間に0.2 µmのフィルターがあり、これから組織をガラスキャピラリーに出し入れします。組織の塊がピペットの開口部よりそれほど大きくないため、最初の工程はかなりスムーズに進むはずです。組織を緩めるだけで十分です。その後、わずかにサイズの小さいピペットチップで処置します。先端がきれいな円形で整ったピペットチップを使用してください。これで良好です。そして繰り返しになりますが、すべての凝集塊は一度にパイプの中に入ったり出たりします。これにより、組織は非常に柔らかく緩んでおり、これらの凝集塊を培地で再懸濁すれば、細胞は基本的に脱落します。次に、解離させた細胞をすべて新しい15 mLコニカルチューブに移し、まだ大きな凝集塊になっている細胞を分散させるため、優しく2、3回上下にピペッティングして懸濁します。その後、まだ残っている大きな破片が沈殿するまで1〜2分間待ちます。また、破断したガラスキャピラリーの破片がある場合も、同様に底へ沈殿します。次に、これを分注して、完全にlyコーティングされたカバーグラスまたはディッシュに播種します。ここでは、あらかじめポリリシンでコーティングしたガラスカバーグラスに80 µLを播種しており、きれいな液滴が形成されています。細胞は最終的に沈降し、ガラスカバーグラスに接着します。約1時間後、細胞が沈降したので、ディッシュ全体にさらに培地を非常にゆっくりと加えます。このように、軽く円を描くように揺らしてください。その後、これらの細胞を37°Cのインキュベーターに入れ、明日、条件化培地で継代します。さて、これらが皮質細胞です。播種から1日弱が経過しています。昨日プレートに播種されており、多くのニューロンが存在していることがわかります。ニューロンが豊富にあり、また一部の細胞碎片も混在しています。これらは生存できなかった細胞です。そして、これらは次回の数回の給餌で洗い流されます。死細胞は、膜が波打った非常に小さな円形の細胞です。以上の手順で、解離皮質培養の調製方法を説明しました。脳切片から皮質外層を取り除く際、非神経細胞を多く含む視床皮質線維束から分離させることが重要である点に注意してください。また、細胞をトリプシン処理する際は、処理しすぎないようにしてください。過剰な処理は、それまでに回収した孤立細胞の大部分を死滅させてしまうためです。組織スライスの取り扱いに細心の注意を払えば、良好な培養が可能です。実験の成功を祈っています。

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