テストの子孫によるゼブラフィッシュ致死の骨格変異の浸透度をシフト

この育種戦略の全体的な目標は、変異体の浸透度を上向きまたは下向きに操作することです。この選択的育種法により、変異体の表現型をより完全に理解することができます。高浸透度および低浸透度の変異株を生成することにより、突然変異の表現型シリーズ全体を理解することができます。

ほとんどのゼブラフィッシュの鱗は、突然変異体が劣性致死性であるため、ホモ接合型の突然変異体は直接繁殖する前に死にます。したがって、私たちはここで示す子孫検査の古典的な選択的育種戦略を採用しています。この方法のアイテムは、異所性骨細胞の発達をタイムラプスレコードにしようとしたときに最初にありました。

残念なことに、余分な骨細胞が頻繁に現れたため、選択的育種によって変異体浸透剤を変更することに着手しました。この方法は、変異系統を持つゼブラフィッシュスケールで行いますが、他のゼブラフィッシュ変異体表現型や、おそらく他の生物にも適用できます。テキストプロトコルに従って未選択の開始ゼブラフィッシュストックを調製した後、次のようにKASPジェノタイピングを実施します。

ゼブラフィッシュの尾組織を96ウェルプレートのウェル内の50マイクロリットルの溶解バッファーに入れます。10マイクロリットルの10ミリグラム/ミリリットルのプロテイナーゼkをウェルあたり10マイクロリットル加え、組織サンプルを55°Cのサーモサイクラーで2〜5時間消化します。続いて、20分間の摂氏94度の不活性化ステップが続きます。

消化後、溶解生成物を冷蔵します。.分光光度計を使用して、ゲノムDNAを定量化します。次に、分子生物学グレードの水を使用して、各反応に約20〜30ナノグラムが含まれるようにゲノムテンプレートを希釈します。

1.5ミリリットルの微量遠心チューブに、氷上のサンプルあたり0.14マイクロリットルのKASPプライマーミックスと5マイクロリットルのKASPマスターミックスを加え、よく混ぜます。次に、短時間遠心分離して内容物をチューブの底に集めます。5マイクロリットルのプライマーマスターミックス溶液を、使用するリアルタイムPCR装置に適した96ウェル光学PCRプレートのウェルにピペットで入れます。

次に、希釈したDNAテンプレートサンプル5マイクロリットルを各ウェルにピペットで入れ、ピペットで吸引して混合します。光学的に透明なフィルムシールをプレートに貼り、フィルムが各ウェルで完全にシールされていることを確認します。プレートを600 x Gで短時間遠心分離して、下部の内容物を収集し、混合物から気泡を取り除きます。

メインのKASP反応を実行した後、分析コンピューターによって生成された結果の散布図を表示します。識別されたヘテロ接合動物をメインの水システムにまとめて収容します。動物がフィンクリップから回復した後、ペアワイズインタークロスを設定し、ディバイダーを使用して胚が同期していることを確認します。

胚を採取し、親ペアを繁殖ケージに隔離します。孤立した成魚を監視して、攻撃的な魚を分離したり、カバーを提供できるようにします。5日目または6日目に胚を育てるには、水泳用膀胱がクラッチの75%で膨らんでいるときに、ガラスピペットを使用して表現型野生型の動物を採取します。

表現型の野生型を保育園に置き、どの親がそれらを産んだかを記録します。テキストプロトコルに従って水泳膀胱を膨らませない幼虫に麻酔をかけた後、広口径ガラスパスツールピペットを使用して動物を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに集めます。各チューブから胚水を取り除き、1x PBS中の1ミリリットルの2%パラホルムアルデヒドと交換します。

チューブを1時間揺らして動物を固定します。このロッキングステップとその後のすべてのロッキングステップ中にチューブを定期的に追跡して、幼虫がチューブの側面にくっついたり、チューブの底に凝集したりしていないことを確認します。ガラスピペットを使用して、チューブから固定剤を取り除きます。

次に、50%エタノールを1ミリリットル加えます。サンプルをさらに10分間揺らします。アルシアンプレミックス1ミリリットルあたり0.5%アリザリンレッドの20マイクロリットルを追加することにより、新鮮な染色溶液を調製します。

50%エタノールを取り除き、各チューブに1ミリリットルの染色液を加えます。次に、チューブを一晩揺らします。テキストプロトコルに従って胚を漂白した後数日以内に、浸透剤について染色された変異体の子孫をスコアリングします。

この例では、トピックボーンの任意の発生に対してスコアを付けます。次の世代のために、2つの高浸透性物質と2つの低浸透性物質ファミリーを選択します。各親ペアにサブストック識別子 (family 4.01、02 など) を付与します。

また、すべてのラベルに近親交配の世代番号を示すことも役立ちます。メインシステム上のハウスペアといくつかの混合性別のコンパニオンフィッシュ。コンパニオンフィッシュは、色素沈着の変化やヒレの構造など、恒久的で明らかな特徴を持つ任意のゼブラフィッシュラインにすることができます。

選択した科の野生型の兄弟幼生を入れた水槽に、変異体の兄弟からの浸透剤をラベル付けし、通常どおり魚を成魚に育てます。子孫試験による選択的育種により、数世代で全体的な浸透剤が下向きと上向きの両方にシフトするはずです。これらの実施例では、mef2ca b1086変異体に適用し、致死性ホモ接合体変異体におけるオペラカルと分枝ステガル光線との間のトピック骨の高浸透性または低浸透性を選択した。

キャスト手順を成功させるには、遺伝子タイプに対応するサンプルのタイプグループをコンピュータープログラムによって認識し、十分なサイクルが実行された後にNTCをプロットの原点の近くに配置する必要があります。ここで示したように、成功したアルシアンブルー、アリザリンレッドの染色は、透明またはかすかではない骨と軟骨の要素が鮮やかに染色されます。軟骨要素の境界は鮮明に見えるはずで、個々の矛盾細胞が識別可能になります。

濃度が高すぎるアルシアンブルーは他の組織から透明でなく、分析が不可能でした。ゼブラフィッシュラインのメンテナンスからこの技術を実装すると、数世代で浸透剤が変わる可能性があります。この手順に続いて、NC2ハイブリダイゼーションやタイムラプスイメージング研究などの他の方法により、より一貫した結果が得られる可能性があります。

この手法を使用して、表現型変異の遺伝性を調査します。このビデオを見れば、たとえその突然変異が致死的であっても、突然変異株を選択的に繁殖させて浸透度を変える方法についてよく理解できるはずです。