傷害による老化と生体内での骨格筋におけるリプログラミングの評価

本プロトコルの全体的な目的は、組織損傷後の骨格筋におけるin vivoでの細胞老化とリプログラミングの両方を評価することです。この手法は、筋肉の再生を促進するためにどのように細胞可塑性を高めるかといった、再生医療分野における重要な課題の解決に寄与します。本技術の主な利点は、生体内の環境において老化細胞を検出および定量化するための信頼性の高い手法を提供できる点にあります。

細胞老化は、近年、組織の修復および再生に関与していることが示唆されています。老化が組織修復や再生にどのように寄与するのか、そのメカニズムを解明することは、再生医療に大きな影響を与えると考えられます。私たちは、骨格筋におけるin vivoリプログラミングに対する組織損傷の潜在的な影響を調査していた際に、初めてこの手法を考案しました。

本手順を開始するには、筋肉サンプルのスライドを1%パラホルムアルデヒドおよび0.2%グルタルアルデヒドを含むPBSで4分間固定します。次に、スライドをPBSで10分間ずつ2回洗浄します。その後、pH 5.5のPBSでスライドを30分間洗浄します。

次に、切片をX-gal溶液とともに、暗所、37°Cで最低24時間インキュベートします。その後、スライドをPBSで3回、各回10分間洗浄します。続いて、1%パラホルムアルデヒドを含むPBSで、スライドを30分間後固定します。

最後に、スライドをPBSで3回洗浄します。続いて、スライドをエオシン溶液に1分間浸し、0.2%エオシンで対比染色を行います。その後、蒸留水で短時間すすぎます。

水溶性の非蛍光封入剤を用いてスライドを封入します。4%パラホルムアルデヒドを含むPBSで10分間固定します。PBSで10分間ずつ2回洗浄します。

続いて、透過化溶液を加え、5分間インキュベートします。その後、スライドをPBSで2回、それぞれ5分間洗浄します。最後の洗浄では、0.25%BSAを含むPBS 200 microlitersをスライドに直接滴下し、5分間置きます。

5% FBS含有PBS中で、1.25 µg/mLに希釈した一次抗Nanog抗体とともにスライドを4°Cで一晩インキュベートします。PBSでスライドを2回、各10分間洗浄します。最後の洗浄では、0.25% BSA含有PBS 200 µLを用い、5分間洗浄します。

その後、市販のキットに含まれるRAB-HRP二次抗体100マイクロリットルをスライドに滴下し、45分間インキュベートします。次に、二次抗体を除去するため、PBSで5分間ずつ3回洗浄します。その後、市販キット付属の基質バッファーでDABを希釈します。

激しくボルテックスします。各スライドにDAB溶液を100 µL直接加え、室温で最大10分間インキュベートします。次に、スライドを水で洗浄してDAB溶液を除去します。

Fast Red溶液を用いて、スライドを2分間対比染色します。その後、スライドを再度水で短時間洗浄します。続いて、95% ethanolで5分間脱水し、さらに100% ethanolで5分間ずつ2回脱水します。

その後、速乾封入剤を用いてスライドを封入します。背景を除去するため、顕微鏡の明視野にて20倍でスライドを観察します。この手順では、スライドをスキャンし、組織の完全性、染色の質、および対比染色の状態に基づき、可能な限り離れた位置にある最高品質の切片を各スライドから2つ選択します。

これら2つの切片におけるSA-Beta-Gal陽性細胞をカウントし、平均値を算出します。次に、最小および最大のSA-Beta-Gal陽性細胞を手動で選択し、ピクセルサイズの順位を決定します。ImageJのインターフェースで、Analyze、Tools、ROI Manager、Analyze、Set Measurementの順にクリックします。

次に、「Area（面積）」を選択します。選択ツールを使用して、SA-Beta-Gal陽性細胞の中で最小のものと最大のものを囲み、「Add（追加）」をクリックしてROIマネージャーに追加します。その後、「Measure（測定）」ボタンを使用してサイズを測定し、後で使用するために値を保存します。

次に、可視化されたすべての陽性細胞が選択されるように、しきい値パラメータを調整します。[Image]、[Type]、[8-bit]の順にクリックして、画像をグレースケールに変換します。その後、[Image]、[Adjust]、[Threshold]へと進みます。

2番目のカーソルを動かし、陽性のSA-Beta-Gal細胞がすべて赤色でカバーされるまで調整し、「Apply」をクリックします。次に、「Analyze」、「Analyze Particles」の順にクリックし、「Size」を選択して、先に定義した値を適用して粒子を解析します。「Circularity」に0.00-1.00と入力し、「OK」をクリックします。カウントされたすべての粒子の要約がROI Managerに表示されます。

次に、選択したすべての粒子を元の画像に転送します。正確な定量化を行うため、手動で選択範囲を調整してください。陽性細胞を追加するか、偽陽性細胞を削除します。

最後に、選択ツールを用いてセクションの外郭を描き、面積を測定します。ROI ManagerのAddをクリックし、次にMeasureをクリックします。顕微鏡下で、明視野像におけるNanog陽性細胞を20倍の倍率で手動でカウントします。

ここでは、筋損傷後のin vivoリプログラミングおよび老化レベルを評価するための概略図を示します。以下は、損傷した骨格筋の凍結切片におけるSA-Beta-GalおよびNanog染色の代表的な画像です。これらの画像は、エオシンで対比染色したSA-Beta-Gal染色と、ファストレッドで対比染色したNanog染色を示しています。

上段に非損傷筋肉、下段に損傷筋肉を示します。このグラフは、受傷後10日目の連続切片におけるSA-Beta-Gal陽性細胞とNanog陽性細胞の定量化および相関を示しています。この手順を行う際は、染色の特異性を確保するために、常に陰性対照を含めることが重要です。

この手順に従い、免疫蛍光染色などのあらゆる手法や、異なる老化マーカーの選択を用いることで、老化細胞の細胞アイデンティティなどの追加的な疑問に答えるために、あらゆる細胞型で解析を行うことが可能です。この技術は発展を重ねるごとに、老化や組織修復・再生分野の研究者が、哺乳類において細胞老化がいかに細胞可塑性を促進し、組織修復と再生を促進し得るかを探究するための道を開いてきました。したがって、このビデオを視聴することで、in vivoにおいて老化細胞とリプログラミング細胞の両方を同定する方法について、十分に理解できたはずです。