Name: 豊かさと充電転送エシェリヒア属大腸菌の Rna のレベルの定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: 学ぼう、Escherichia coliにおけるtRNA充電レベルと豊かさの定量化手法。スパイクイン細胞を用いた正確な比較分析により、異なる成長状態におけるRNA動態を解明する方法です。

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著者は、優れたテクニカル サポート メッテ Warrer をありがとうございます。この作業は、独立した研究のためデンマーク評議会によって支えられた |自然科学 [1323-00343B] と [DNRF120] デンマーク国立研究財団。

<ol><li>Varshney, U., Lee, C. -P., RajBhandary, U. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+analysis+of+aminoacylation+levels+of+tRNAs+in+vivo.+Application+to+studying+recognition+of+Escherichia+coli+initiator+tRNA+mutants+by+glutaminyl-tRNA+synthetase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct analysis of aminoacylation levels of tRNAs in vivo. Application to studying recognition of Escherichia coli initiator tRNA mutants by glutaminyl-tRNA synthetase.</a> J Biol Chem. 266 (36), 24712-24718 (1991).</li>
<li>Sorensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charging+levels+of+four+tRNA+species+in+Escherichia+coli+Rel%28%2B%29+and+Rel%28-%29+strains+during+amino+acid+starvation%3A+a+simple+model+for+the+effect+of+ppGpp+on+translational+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel(+) and Rel(-) strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy.</a> J Mol Biol. 307 (3), 785-798 (2001).</li>
<li>Krüger, M. K., Sørensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aminoacylation+of+hypomodified+tRNAGlu+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Aminoacylation of hypomodified tRNAGlu in vivo.</a> J. Mol. Biol. 284 (3), 609-620 (1998).</li>
<li>Svenningsen, S. L., Kongstad, M., Stenum, T. S., Muñoz-Gómez, A. J., Sørensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+RNA+is+highly+unstable+during+early+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Transfer RNA is highly unstable during early amino acid starvation in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 45 (2), 793-804 (2017).</li>
<li>Enriquez, J. A., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+aminoacylation-induced+conformational+changes+in+human+mitochondrial+tRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Evidence for aminoacylation-induced conformational changes in human mitochondrial tRNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (16), 8300-8305 (1996).</li>
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<li>Kane, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+rare+codon+clusters+on+high-level+expression+of+heterologous+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli.</a> Curr Opin Biotechnol. 6 (5), 494-500 (1995).</li>
<li>Baca, A. M., Hol, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+codon+bias%3A+a+method+for+high-level+overexpression+of+Plasmodium+and+other+AT-rich+parasite+genes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Overcoming codon bias: a method for high-level overexpression of Plasmodium and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli.</a> Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).</li>
<li>Li, S., Pelka, H., Schulman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anticodon+and+discriminator+base+are+important+for+aminoacylation+of+Escherichia+coli+tRNA+%28Asn%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The anticodon and discriminator base are important for aminoacylation of Escherichia coli tRNA (Asn).</a> J Biol Chem. 268 (24), 18335-18339 (1993).</li>
<li>Rizzino, A. A., Freundlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+in+vivo+aminoacylation+by+periodate+oxidation%3A+tRNA+alterations+and+iodate+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Estimation of in vivo aminoacylation by periodate oxidation: tRNA alterations and iodate inhibition.</a> Anal Biochem. 66 (2), 446-449 (1975).</li>
<li>Dittmar, K. A., Sorensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino-acid+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation.</a> EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).</li>
<li>Zhou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+reference+genes+for+quantifying+transcriptional+responses+of+Escherichia+coli+to+protein+overexpression+by+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel reference genes for quantifying transcriptional responses of Escherichia coli to protein overexpression by quantitative PCR.</a> BMC Mol Biol. 12 (1), 18(2011).</li>
<li>Jacobson, A., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+events+occurring+during+recovery+from+prolonged+glucose+starvation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Metabolic events occurring during recovery from prolonged glucose starvation in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 95 (3), 1030-1039 (1968).</li>
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<li>Zundel, M. A., Basturea, G. N., Deutscher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+ribosome+degradation+during+starvation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">Initiation of ribosome degradation during starvation in Escherichia coli.</a> Rna. 15 (5), 977-983 (2009).</li>
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<li>Schaechter, M., Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependency+on+medium+and+temperature+of+cell+size+and+chemical+composition+during+balanced+grown+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dependency on medium and temperature of cell size and chemical composition during balanced grown of Salmonella typhimurium.</a> J Gen Microbiol. 19 (3), 592-606 (1958).</li>
<li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+medium+for+enterobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Culture medium for enterobacteria.</a> J Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).</li>
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<li>Sorensen, M. A., Jensen, K. F., Pedersen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+concentrations+of+ppGpp+decrease+the+RNA+chain+growth+rate.+Implications+for+protein+synthesis+and+translational+fidelity+during+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High concentrations of ppGpp decrease the RNA chain growth rate. Implications for protein synthesis and translational fidelity during amino acid starvation in Escherichia coli.</a> J Mol Biol. 236 (2), 441-454 (1994).</li>
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</ol>

著者が明らかに何もありません。

このプロトコルは、特定の大腸菌の充電レベルを同時に測定する方法をについて説明します Trna と異なったサンプルの Trna の相対的なレベルを比較します。1) 携帯電話の tRNA 充電レベルが保持されます、tRNA は、異なったサンプルの相対的な tRNA のレベルを確実に比較できる、そのような方法で数量を正規化するには 2) と 3) sp を確実にこのような方法でサンプルを処理するプロトコルの重要なポイントは、します。興味の Trna の選択したプローブの ecificity。これらのポイントは、以下個別に解決されます。
tRNA の浄化
Trna は大腸菌から自分の携帯電話の充電レベルを保持するために最適化された穏やかな方法で浄化されます。それは私たちの経験をこのプロトコルは主に 150 より短い Rna を抽出する nt、したがって tRNA の浄化された RNA の大部分を構成します。この理由から、エシェリヒア属大腸菌からの総 RNA の浄化するためにこのプロトコル...

以下では、特定の Trna の定量化手法を提案し、北にしみが付くことによってレベルに充電を測定します。最初 Varshneyらが開発した技術に基づく1。 トリクロロ酢酸 (TCA) に細胞を収穫し、RNA 精製中の 0 の ° C でサンプルを維持する、tRNA とアミノ酸のエステル結合が保存された2,3,4。Aminoacylated Trna で区別できる nonacylated 対応ゲル電気泳動とブロッティング、ため、aminoacylated の減少移動する共有結合アミノ酸5によるゲルの tRNA。さらに、使用頻度の低い tRNAselC 4を過剰発現細胞のスパイクの添加 tRNA の量の正規化のためのプロトコルを提案する.
細菌の細胞の翻訳機械の絶対に不可欠な部分の最も豊富な分子である Trna。Trna はアミノ酸をバインドし、翻訳のリボゾームにそれらを転送します。Trna のアミノアシル化 (充電) するためにアミノ酸の結合は、アミノアシル tRNA シンテターゼによって促進されます。別の充電された Trna の相対的な豊かさはタンパク質合成の忠実性を確保するため重要な同系の過少請求指定されたメッセンジャー RNA (mRNA) コドンの tRNA 同系近く tRNA がされる可能性が高くなりますので誤ってそのアミノ酸をリボソーム6成長ポリペプチド鎖に配信します。充電された tRNA の重要性は、tRNA; の充電レベルの深刻な低下にエシェリヒア属大腸菌細胞の広範な応答に反映されます。厳格な応答です。厳格な応答時に Trna、リボソーム Rna とほとんど Mrna の合成はアミノ酸の生合成やストレスの生存に関連付けられている特定の Mrna の転写を支持して低下され、細胞の成長率を劇的に下げた7.さらに、われわれや他の最近の作品は、大腸菌が tRNA レベルの調整可能性があることを示唆している制限する翻訳4,8ストレスへの応答で、tRNA の大半を積極的に劣化することを示しています。このようなストレスに対処するために重要です。したがって、tRNA 微量含有量と充電レベルの信頼性の高い計測は完全に細菌のストレス反応を理解するための重要なツールになります。
エシェリヒア属大腸菌組換え蛋白質を表現する使用され、種のコドン使用の違い、最適な表現はしばしば直面する問題9。これは組換え mRNA10を変換に必要な追加の Trna の式によって回避できます。TRNA のような株のレベルを充電の測定ことができるトラブルシューティングの努力を導くし、蛋白質の表現を最適化するため。
このメソッドは、また"mischarging"の検出を可能にします。非同種のアミノ酸を tRNA 分子 aminoacylated。種類のアミノ酸によってアミノアシル化は、ポリアクリルアミドゲル1,11をわずかに異なる速度で移行する tRNA を引き起こす可能性があります。いくつかのケースでは、そうでなければ同じ Trna3異なる修飾パターンを区別するためにメソッドを使用できます。
別は、tRNA の充電レベルの調査は酸化を過ヨウ素酸の生化学的なプロシージャを設立しました。メソッドは、tRNA から保護 aminoacylated に酸化が過ヨウ素酸中性 tRNA ではない観察に依存します。後、酸化処理収穫された RNA の充電レベルの見積もりに使用、tRNA の充電過ヨウ素酸します。しかし、このようにいくつかの不正確さ12を提供する治療によって影響を受けるいくつかの Trna の充電を示されています。メソッドは、浄化された RNA から直接充電、化学か酵素の反応からどんな先入観を排除対策を紹介しました。このメソッドの制限の 1 つは時間がかかり、やや多く Trna のデータを収集するは面倒だが、同じ北のしみの除去および複数の Trna の reprobed できるように、時だけ 1 つの tRNA 種が検出されました。
互いにサンプルの正規化の信頼性の高い方法は、異なるサンプルの間で分子の相対的なレベルを比較することの研究で不可欠です。ここまれな tRNAselCを過剰発現大腸菌細胞の小さい因数のスパイクでとしての RNA の浄化の前にすべての実験サンプルに追加されます RNA の正規化の手順を紹介します。このメソッドは、Trna を調べるときだけでなく、RNA の任意の種の相対的な定量化のためのすべてのサンプルで同じ細胞濃度で提示実験のセットアップがこのような内因性 RNA がないする信頼できる便利です。たとえば、「ハウスキーピング」RNA のようなリボソーム RNA レベルは別の RNA 間の相対的な量を比較する内因性参照サンプル13、によく使用されます。しかし、これは少し使用の参照 RNA の細胞濃度のサンプル間の相違ストレス応答15,16,17中または中にサンプリングが発生した場合、リボソーム RNA のためのケースをすることができます。固定相17へ参入。スパイクで細胞の RNA の浄化の前に実験サンプルへの添加は、正規化サンプリング設定の独立の堅実で正確な方法を提供します。標準化の別の方法は、RNA 精製後 1 つまたは複数のスパイクで Rna の実験サンプルに追加です。ただし、このメソッドは、サンプルの RNA の回復の違いについては考慮しません。
エシェリヒア属大腸菌細胞を用いた大腸菌の実験でスパイクの細胞 (図 1を参照) として参照 RNA が欠点があるその過剰さらに外因性大腸菌の少量の合計する RNA、サンプル。我々 はスパイクでのみセル (参照図 2,の車線「selC」というラベルの付いたしみ北) 実験サンプルと並行を含むサンプルを分析することによりこのほかの修正します。提示プロトコルエシェリヒア属大腸菌K-12 の開発がほとんどの細菌種に適用する可能性があります。

<table><tbody><tr><td>尿素メル</td><td>ク</td><td>57-13-6</td><td>純度>99%</td></tr><tr><td>ポリアクリルアミド</td><td>Serva</td><td>79-06-7</td><td></td></tr><tr><td>ビス(N、N'-メチレンビスアクリルアミド)</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0201</td><td></td></tr><tr><td>トリクロロ酢酸(TCA)</td><td>Sigma</td><td>76-03-9</td><td></td></tr>フェ<tr><td>ノール</td><td>メルク</td><td>108-95-2</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td></td><td></td><td></td></tr>、<tr><td>酢酸</td><td></td><td></td><td></td>ナトリウム</tr><tr><td>、EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>、エタノール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリス</td><td></td><td></td><td></td></tr>、<tr><td>塩酸</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>、塩化</td><td></td><td></td><td></td>ナトリウム</tr><tr><td>、NaH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>クエン酸</td><td></td><td></td><td></td>ナトリウム</tr><tr><td>SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニシン精子DNA</td><td>シグマ</td><td>100403-24-5</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリビニルピロリドン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>フィコール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P32&ガンマ;ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAオリゴ(プローブ)</td><td>TAG コペンハーゲン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hybond N+ メンブレン</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>架橋剤</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>エレクトロブロッター</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000 スキャナー</td><td>GE Healthcare</td><td>28955809</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydridization oven</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geiger-M&uuml;ller tube</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛍光体イメージャー スクリーン</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hybridization tube</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>培養フラスコ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微量遠心チューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ml 遠心チューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>マイクロソフト</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

豊かさと充電転送エシェリヒア属大腸菌の rna のレベルの定量化

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

トランスファー RNA (tRNA) は、あらゆる有機体の並進機械の重要な部分です。Trna はバインドし、アミノ酸をリボソーム翻訳に転送します。別の Trna の相対的なレベルと aminoacylated の比を合計 tRNA、充電レベルとして知られている tRNA が精度と翻訳のスピードを決める重要な要素。したがって、豊かさと Trna の充電レベルは、たとえば種々 の応力条件下でのタンパク質合成の勉強を測定する重要な変数です。ここでは、tRNA を収穫し、相対的な豊かさと大腸菌における特定の tRNA 種の絶対的な充電レベルを直接測定する方法をについて説明します。TRNA は、tRNA とアミノ酸の間不安定な結合が維持されることそのような方法で収穫されます。RNA ゲル電気泳動および北しみが付くこと、充電、非荷電の Trna の分離の結果にさらされます。正規化のためのスパイクの細胞のための異なるサンプルで特定の Trna のレベルを比較できます。RNA 精製の前に、各サンプルにまれな tRNAselCの過剰大腸菌細胞の 5% を追加します。サンプルの興味の tRNA 種の量は、同じサンプルの tRNAselCの量に正規化されます。スパイクで細胞の RNA の浄化前の追加サンプルのセル換散の効率の違いも占める浄化されたスパイクで Rna のさらに利点があります。

豊かさと充電前に、とアミノ酸飢餓の中に 3 つの Trna のレベルがエシェリヒア属大腸菌K-12 で測定されたここで説明手順を使用しています。
アルギニン auxotroph ひずみ NF9154 (木ルー彼くっティ mtl supE44) 0.4% グリセロール、50 μ g/mL スレオニン、ロイシン、アルギニン、37 ° c で揺れ 5 μ G/ml ヒスチジンとモップ最小培で少なくとも 10 世代の育ち160 rpm。アルギニン不足は、文化の上なくアルギニンとして新鮮なモップ中濁ろ過によって導入されました。アルギニン飢餓タンパク質合成は強く減るが既存の蛋白質の売り上げ高が発表したアルギニンを使用して低レベルで続けています。サンプルの時点で収穫された点は、図 4に示します。示すように、tRNA...

スパイクの追加に基づく異なるサンプル間転移 RNA の相対的なレベルまたは他の短い RNA を比較する方法と同様、精製されたエシェリヒア属大腸菌RNA からレベルを充電転送の RNA を直接測定法を紹介します。参照の遺伝子を発現する細胞。

豊かさと充電転送エシェリヒア属大腸菌の Rna のレベルの定量化

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

この実験の全体的な目標は、大腸菌のトランスファーRNAの存在量と電荷レベルを定量化することです。この方法は、tRNAの充電レベルがさまざまな成長状態でどのように変化するかなど、細胞生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法の主な利点は、細胞内のRNAの組成を劇的に変化させる成長状態間でも、RNAレベルを定量的に比較できることです。この実験は、テキストプロトコルに従って実験的およびスパイクイン大腸菌培養物を増殖させることから始めます。160 RPMで振とうしながら、スパイクイン培養物を摂氏37度で成長させます。スパイクイン培養がOD436が約0.1に達したら、IPTGを添加してtRNA細胞Cの発現を誘導します。OD436が約0.5に達するまで培養物を成長させます。次に、すべてのサンプルが採取されるまで、培養物を氷に移します。その後、摂氏37度の水浴中で、各サンプルに対して4ミリリットルの10%TCAを含む100ミリリットルのキャップ付き培養フラスコ1つを予温します。細胞回収の直前に実験培養物のOD436を測定し、記録します。次に、4ミリリットルの培養物をフラスコを含む予熱したTCAに移します。フラスコを手で渦巻かせながらサンプルを5秒間混合すると、tRNAの充電レベルを維持しながら、すべての酵素活性が直ちに無効になります。すべてのサンプルを採取したら、各サンプルに5%スパイクイン細胞を添加します。また、テキストプロトコルに記載されているスパイクイン細胞のみからなるコントロールサンプルを調製します。RNA抽出を開始するには、各サンプル(コントロールを含む)を氷冷遠心チューブに注ぎます。サンプルを9, 500 x Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を完全に取り除いた後、ペレットを10ミリモルEDTAを含む0.3ミリリットルの冷たい酢酸ナトリウムに再懸濁します。.各サンプルを冷たい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、緩衝液と平衡化した0.3ミリリットルのフェノールを加えて、ペレットを再懸濁します。次に、各サンプルを毎回15秒間、10回ボルテックスします。各渦の間に摂氏0度で少なくとも1分間、サンプルを冷たく保つため。次に、サンプルを20, 000 x Gで摂氏4度で15分間遠心分離します。上部または水面を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。0.3ミリリットルの冷たいフェノールを水面に加え、前述のようにサンプルをそれぞれ15秒ずつ4回ボルテックスします。次に、サンプルを20, 000 x Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。水面を新しい冷たい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、2.5容量の冷たい96%エタノールを加えます。次に、チューブを摂氏20度で1時間インキュベートして、RNAを沈殿させます。サンプルを 20, 000 x G で摂氏 4 度で 30 分間遠心分離します。上清を取り除いた後、RNAペレットを邪魔しないように注意しながら、冷たい70%エタノール1ミリリットルを慎重に加えます。チューブを一度静かに反転させて、エタノールで洗います。最後に、摂氏4度で20, 000 x Gで10分間遠心分離します。上清を完全に取り除き、エタノールが完全に除去されるまでペレットを風乾します。1ミリモルEDTAを含む20マイクロリットルの冷たい酢酸ナトリウムで、激しく渦巻いてペレットを再懸濁します。電気泳動を開始するには、各サンプルの4マイクロリットルを6マイクロリットルのローディングバッファーと混合します。コントロールを含むサンプルを、8モルの尿量と0.1モルの酢酸ナトリウム緩衝液を含む厚さ0.4mmの6.5ポリアクリルアミドゲルにロードします。次に、ブロモフェノールブルー色素がゲルの底に到達するまで、摂氏4度で10ボルト/センチメートルの電気泳動を約20時間実行することにより、RNAを分離します。2枚のガラス板を慎重に分離し、ゲルが片方に残るようにします。キシレンシアノール染料のゲル領域とブロモフェノール染料に向かって20cm下のゲル領域をブロモフェノール染料に使用します。薄い濾紙を目的の吸い取り領域のサイズにカットします。ブロッティングに使用するゲルの部分の上に濾紙を置きます。濾紙で覆われていないゲルの部分を切り取り、廃棄します。次に、濾紙を使用して、ゲルをガラスプレートから慎重に持ち上げます。プラスに帯電したナイロンメンブレンをゲルの上に置き、20ボルトの転写バッファーで90分間エレクトロブロットします。UV光を用いてRNAをメンブレンに架橋して仕上げます。次に、架橋メンブレンをハイブリダイゼーションチューブに入れ、6ミリリットルのハイブリダイゼーション溶液を加えます。チューブを摂氏42度で1時間回転させて、メンブレンをプレハイブリダイズします。次に、30 ピークモル放射性オリゴ DNA プローブ (5 基、P32 で標識) を追加します。メンブレンを回転させて、プローブと42°Cで一晩インキュベートします。インキュベーション後、使い捨ての10ミリリットルピペットを使用してプローブを取り出します。次に、ハイブリダイゼーションチューブ内でメンブレンを室温で15ミリリットルの洗浄液で2回すばやく洗浄します。メンブレンを平らなプラスチック容器に移し、洗浄液で覆い、蓋を閉めます。メンブレンをシェーカーで室温で30分間インキュベートします。溶液を交換し、満足のいく信号対雑音比が得られるまで洗浄を続けます。ガイガーミュラー管を使用して、プローブがtRNAにハイブリダイズした領域からの放射線と空の領域からの放射線を比較することにより、信号対雑音比を取得します。その後、メンブレンをラップでしっかりと包み、溶接で気密に密封します。このメンブレンをリン光イメージングスクリーンに置きます。十分な露光時間が経過した後、レーザースキャナーで画面をスキャンし、ファイルをゲル形式で保存します。次に、ゲルファイルをイメージングソフトウェアにロードします。各サンプルレーンに沿って垂直線を引き、レーンの幅の大部分に広がるようにし、信号が不均一になる可能性のあるバンドの端を除外します。各レーンのカウントを視覚化するには、[分析] をクリックし、[グラフの作成] をクリックします。各レーンの荷電tRNAと非荷電tRNAを表す2つのピークを手動で定義します。その後、分析をクリックし、次にエリアレポートをクリックして、各ピークからカウントを取得します。最後に、2つのピークのそれぞれの下の領域を記録します。テキストプロトコルに記載されているように、tRNAレベルを計算します。この方法は、アルギニン飢餓前および飢餓中のさまざまなtRNAおよび大腸菌nf915の存在量を測定するために使用されました。異なるtRNAプローブとハイブリダイズした上のプロットでは、電荷tRNAを表すバンドと非荷電tRNAを表すバンドとの間に明確な分離があります。各レーンに沿った放射線プロファイルは、イメージングソフトウェアを使用してノーザンブロットから取得されました。各レーンからの放射信号は、ブロットからそれぞれを分離することにより定量化しました。1 つのレーンからの信号の定量化を表すグラフは、2 つのピークを示しています。左のピークはアミノアシル化tRNAに由来し、右のピークは脱アシル化tRNAに由来します。各ピークの下の領域は、さらに分析するためにエクスポートされます。ノーザンブロットからのバンドの定量化は、試験されたすべてのtRNA種の相対的な存在量がアミノ酸飢餓中に急速かつ有意に減少したことを示しています。一方、tRNAを受け入れるアルギニンのtRNAの充電レベルは、アルギニンの除去時に急速に低下し、飢餓期間中にわずかに増加しました。しかし、他のtRNAの充電レベルは、飢餓時にわずかに増加し、その後、ほぼ飢餓前のレベルまで減少しました。このビデオを見れば、tRNAのチャージと存在量を定量化する方法でRNAを精製する方法や、スパイクイン細胞をノーマライゼーションに使用する方法についてよく理解できるはずです。この手順全体を通して、RNAの加水分解を防ぐために、RNAを冷たく酸性に保つことを覚えておくことが重要です。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

私達はからすべてのtRNAの相対的アミノアシル化レベルを決定するためにマイクロアレイ解析のための方法を説明します。...

マイクロアレイを用いたtRNAのアミノアシル化（充電）レベルのゲノムワイド解析

出典: Stenum, T. S. ら。 大 腸菌におけるトランスファーRNAの存在比および荷射レベルの定量化。 J. Vis. Exp. (2017年)このビデオでは、ゲル電気泳動とノーザンブロッティングを用いて、アミノアシル化型と脱アシル化型を分離することで大 腸菌...

大腸菌におけるtRNAチャージレベルを検出するためのゲル電気泳動およびノーザンブロッティング

生体内の生体分子の研究は、生物学的な文脈における分子機能を理解するために非常に重要です。ここでは、DNAやタンパク質などの蛍光生体分子を生きた微生物に取り込むことができる新しい方法について説明します。蛍光顕微鏡で記録されたin...

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ここでは、非コーディング DNA...

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本稿では、蛍光標識 DNA プローブ、エシェリヒア属大腸菌の in situハイブリダイゼーション (smFISH) 実験単一分子蛍光用と個々 のメッセンジャー RNA (mRNA) の成績証明書を表示する方法について説明します。smFISH は、同時検出、ローカリゼーション、および固定の個々 の細胞における mRNA...

単一分子蛍光In Situハイブリダイゼーション実験のため個々 の大腸菌細胞の転写物を自動ラベリング手法

この方法では、細菌細胞における簡潔な生きたレポーターアッセイを用いて、RNA結合タンパク質(RBP)の結合親和性を、簡潔で生きたレポーターアッセイを用いて認知および非認知結合部位に定量する。アッセイはレポーター遺伝子の抑圧に基づいています。...

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このプロトコルは、mRNA合成および分解のインビボ運動を測定するための一分子蛍光をその場所でのハイブリダイゼーション(smFISH)での適用について説明する。...

Situハイブリダイゼーションにおける2色単分子蛍光を用いた 大腸菌 における空間と時間におけるmRNA運動学の探査

MAPS技術は、生体内の特定の調節RNAの標的を精査するために開発されました。目的のsRNAは、そのRNAパートナーの共精製とRNAシーケンシングによるそれらの同定を可能にするMS2アプタマーでタグ付けされます。この改変プロトコルは、特にグラム陽性菌に適しています。...

グラム陽性菌におけるRNAシーケンシングと結合したMS2-アフィニティ精製

Absolute quantification RNA Sequencing (AQRNA-seq) は、生物学的混合物中のすべての低分子 RNA の状況を定量するために開発された技術です。ここでは、AQRNA-seqのライブラリー調製とデータ処理の両方のステップを実証し、飢餓誘発性休眠中の Mycobacterium bovis...

低分子RNAの定量のためのAQRNA-seq

本プロトコルは、非炎症条件下で pks+大腸菌 をマウスに定着させるために必要な手順と、便中での pks+大腸菌 の拡大の定着と評価のための非侵襲的手法を説明しています。...

非炎症条件下でのマウス pks+大腸菌 の定殖

学ぼう、Escherichia coliにおけるtRNA充電レベルと豊かさの定量化手法。スパイクイン細胞を用いた正確な比較分析により、異なる成長状態におけるRNA動態を解明する方法です。

豊かさと充電転送エシェリヒア属大腸菌の Rna のレベルの定量化

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