Name: 生体内で単純および複雑な DNA 損傷に対する細胞応答を研究するレーザー Microirradiation (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 学ぶレーザーマイクロ照射法による単純および複雑なDNA損傷の誘導と修復因子動態のリアルタイム解析。この技術は生体内でのDNA損傷応答シグナル伝達と修復メカニズムの理解に貢献する。

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NTH1 GFP 発現プラスミドの東北大学、日本で博士明安井と TRF2 YFP と EGFP 53BP11220-1711発現プラスミドのラホーヤ、カリフォルニア州スクリップス研究所で博士エロス サヴィ電池に感謝しますこの作品は、空軍科学研究局 (FA9550-04-1-0101) と (M.W.B) にベックマン レーザー研究所株式会社財団、フォード財団フェローシップ CRCC と NSF MCB 1615701 (B.A.S) に科学の国民アカデミーから支えられ(K. Y.) に 426665 CRR 17

著者が明らかに何もありません。

DDR 研究レーザー microirradiation を使用する利点は次のとおりです。
1 種類を誘導することは不可能で、複雑な DNA の損傷に単純な鎖から量の DNA の損傷を検出する DNA リペア要因はレーザー照射パラメーターを調整することによってサイトを損傷します。また、(図 3) のようにトランス効果を評価するために同じ細胞核内で複数回のダメージを与えることが可能です。
2. 重要なことは、事象被害サイトと核の場所で発生する二次イベントは簡単に区別できます。
3. 蛍光タグ付きタンパク質の動態を含む、単一細胞レベルで損傷に応答の高解像度のリアルタイム計測を行うことに限定されない: 蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET)、蛍光寿命イメージング (FLIM) ペア相関関数 (pCF)など、生きた細胞で DDR をキャプチャします。
<p class="jove_...

生体内でよくわかりませんが DNA 損傷のシグナル伝達 生体内でDNA はヒストンとフォーム クロマチン繊維と他の要因との複合体です。クロマチン構造の規制は、DNA 代謝に非常に重要です。たとえば、ヒストン異型 H2AX は - 毛細血管拡張性運動失調変異 (ATM) と次の二重鎖改 (DSB) 誘導と DSB 被害増幅だけでなく、他のドッキング サイトを提供することが重要です他のキナーゼによりリン酸化されます。要因。損傷シグナリングと修復経路の選択肢の広がり被害サイト1ローカル クロマチン構造に影響される批判的に表示されます。クロマチン因子、ヒストン シャペロンとヒストンの修正の酵素を再構築の数サイト被害を募集して実際に DDR でクロマチン制御の意義を強調、効率的な DNA 修理のため重要し、修復2,3,4しますさらに、クラスタ リングまたは再配置の被害サイトが観察された酵母、ショウジョウバエ5,6,7、8、内在する遺伝子座の染色体を連想させる、。遺伝子調節9,10に関連付けられている核コンパートメントです。マウスとヒトの細胞での最近の研究はまた、DSB サイト、影響を与える修復再現性と経路選択11,12の動員を明らかにしました。これは、DDR/修理も密接につながるかもしれない核内構造、高次クロマチンと染色体細胞核ダイナミクス可能性を発生させます。したがって、DDR の研究および DNA 損傷の短期および長期結果を理解するために生細胞の内因性核環境のコンテキストでプロセスを修復する高分解能手法の開発が重要です。
パー ポリメラーゼ (PARP) 測定範囲と被害の種類と被害サイトで蛋白質の集合を調節する重要な役割 化における PARP1 は急速に重要な役割を果たしている DNA 修理13DNA 損傷によって活性化 DNA ニック センサーです。化における PARP1 は x 線修理クロスを補完する 1 (XRCC1) 塩基除去修復 (BER) を容易にするとともに機能と考えられていたが、最近の研究は、DSB 修復14を含む、他の DNA 修復経路におけるその役割を明らかにします。ADP ribosylate を基質としてそれ自身を含む複数のターゲット蛋白質の化における PARP1 使用してニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド (NAD+) を活性化。PARP 阻害剤はがん治療薬として有望な浮上するいると、この酵素と他の家族のメンバーでは、近年、注目をされています。PARP 阻害剤は、乳癌の遺伝子 (BRCA) で効果を発揮する発見された当初が-乳房のがん細胞を変異と DNA 損傷に対してエージェント/照射とモノとの組み合わせ治療の効果のための証拠の茄多は今突然変異で BRCA15,16,17,18,,1920に限らず癌の広いスペクトル。
分子レベルで損傷のサイトでローカルのクロマチン構造を整理するのに重要な役割を果たす PARP 活性化を示した。クロマチン修飾酵素のパー依存型募集を容易に DSB の修復とおもむくまま修復経路の選択肢、損傷のサイトで PAR 変更の重要な足場の役割を示唆しています。13、21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30パー 32、非相同 endjoining (53BP1 依存陰嚢の代替説明を提供することによってサイトを我々 は最近、損傷から p53 結合蛋白質 1 (53BP1) の除外を示した,31NHEJ) PARP 阻害剤と DSB の PARP の意義を強調修復経路選択33,34。化における PARP1 も複数の DNA の活動を修復 PARylates、影響を与える直接の要因14。
生体内での DDR/修理勉強するツールとしてレーザー Microirradiation を使用してください。 個々 の染色体におけるサブミクロン変化を生成するレーザー microirradiation 最初 1969年35で説明され 1981年36で詳細に検討します。数十年後、レーザー microirradiation 細胞核内の定義されたサブミクロン領域での DNA 損傷を誘導することが示され、募集や DNA 病変で生体内にさまざまな要因の変更を研究する貴重な方法であることが証明されました13,37,38,39,40,41。 このメソッドの被害サイト39,42異なる照射誘起巣 (IRIF) を形成しないそれらの要因の検出が可能。また、被害現場と核の残りの部分の両方のクロマチン構造変化の時空間ダイナミクスを検討することが可能です。我々 は慎重に異なるレーザー システムによる Ddr を比較し、DNA 損傷の種類と microirradiation 条件32,43,44との関係を評価する力を入力 45。53BP1 とテロメア異常募集パターンを繰り返す結合因子 2 (TRF2) が定期的なレーザ誘起損傷46 の「生理学」の自然へ関心基盤を提供以前のレーザー損傷研究で観察された ,47,48,49。ゲージ量と損傷32の複雑さをシグナリング今差分 PARP で説明できるは、そのこれらの明白な不一致であることがわかった。確認した: 1) (高入力電力照射) 後もレーザー microirradiated 細胞が損傷チェックポイント制御依存的に中間期に逮捕され、実行可能に残る (少なくともまで 48 h)32,50;・ 2) 修復因子募集/修正を忠実に要約エンドヌクレアーゼ32,39,42、従来の DNA 有害な代理店との処置と DSB 誘導, 44,50,51,52。これらの結果は、レーザー損傷による細胞応答を勉強の生理学的な関連性を強くサポートします。

<table><tbody><tr><td>Ti:Sapphire NIRパルスフェムト秒レーザ Mira-900</td><td>Coherent Inc.</td><td>Mira 900</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡&nbsp;</td><td>カールツァイス</td><td>アクシオバート 200M</td><td></td></tr><tr><td>63X/1.4 NA 対物</td>レンズ <td>ツァイス</td><td>アポクロマート Ph3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>コンパクト回転ステージ&nbsp;</td><td>ニューポートコーポレーション</td><td>PR50PP</td><td></td></tr><tr><td>温度コントローラー</td><td>ワー</td><td>ナーTC-344B</td><td></td></tr><tr><td>暖房システム</td><td>同上&nbsp;</td><td>10918</td><td></td></tr><tr><td>ガスインキュベーションシステム</td>同<td>上&nbsp;</td><td>11920</td><td></td></tr><tr><td>レーザー出力およびエネルギーメーター (RoHS)</td><td>Coherent</td><td>FieldMaxII-TOP&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-R2 デジタルCCDカメラ</td><td>浜松</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>LSM 510 META レーザー走査型顕微鏡</td><td>カールツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100X/1.3 NA ツァイスプラン APO</td><td>カールツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35mm グリッドディッシュ&nbsp;</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-CGRD-D</td><td></td></tr><tr><td>PtK2腎臓上皮細胞</td><td>ATCC</td><td>CCL 56&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HeLa細胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11885-092</td><td></td></tr><tr><td>CO2-Independent Medium&nbsp;</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>アドバンストMEM&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12492-013</td><td>L-グルタミン、4% FBS</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>オメガ サイエンティフィ</td>ック <td>FB-02</td><td></td></tr><tr><td>チミジン&nbsp;</td><td>&nbsp;SIGMA</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>無血清培地&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;(Opti-MEM I 還元型血清培地)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>抗シコルブタンスピリミジン二量体 (CPD) (マウス)</td><td>神谷バイオメディカルカンパニー</td><td>MC-062</td><td></td></tr><tr><td>抗XRCC1 (マウス)</td><td>Gene Tex Inc</td><td>GTX72311</td> Anti-53BP1 <td></td></tr><tr><td>(ウサギ)</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-22760</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CtIP (ウサギ)</td><td>Abcam</td><td>ab70163</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PAR polymers (マウス)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-SA216-0100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PAR (rabbit)</td><td>Trevigen</td><td>4336-BPC-100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRF2 (mouse)</td><td>Novus Biological&nbsp;</td><td>NB100-56506</td><td></td></tr><tr><td>抗6-4PP(マウス)</td><td>神谷バイオメディカル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗Rad21(ウサギ)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;(コヒーシン検出用)</td><td>横森(ケンタッキー州)研究所</td><td></td><td></td>で生成</tr><tr><td>Anti-Rad51 (Rabbit)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-8349</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ku70 (mouse)</td><td>&nbsp;Novus Biologicals</td><td>NB100-102</td><td></td></tr><tr><td>8-オキシグアニン&nbsp;</td><td>トレビゲン株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アンチPARP1&nbsp;(うさぎ)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>KYラボ</td><td></td>で生成 <td>ref 43</td></tr><tr><td>&nbsp;反hCAPG(ウサギ)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;(コンデンシン検出用)</td><td>KYラボ</td><td></td>で生成 <td>ref 42</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>&nbsp;Jackson ImmunoResearch Inc</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>HiPerFect siRNA トランスフェクション試薬</td><td>Qiagen</td><td>301705</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 トランスフェクション試薬</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>GFP-SMC1 安定細胞株&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>KYラボ</td><td></td>で生成 <td>ref 49&nbsp;</td></tr><tr><td>KYラボ</td><td></td>で生成された<td>GFP-NEIL2安定細胞株</td><td>ref 54</td></tr><tr><td>KYラボ</td><td></td>で生成された<td>GFP-NTH1安定細胞株</td><td>ref 32</td></tr><tr><td>KYラボ</td><td></td><td></td>で生成された<td>GFP-SMC1プラスミド</td></tr><tr><td>KYラボ</td><td></td><td></td>で生成された<td>GFP-Kuプラスミド</td></tr><tr><td>Anti-MDC1(ウサギ)</td><td>&nbsp;Novus Biologicals</td><td>NB100&ndash;395</td><td></td></tr><tr><td>抗gH2AX(ウサギ)</td><td>&nbsp;ミリポア</td><td>07&ndash;164</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-53BP1(1220-1711)</td><td>Berns研究室</td><td></td>で生成されたPtK2安定細胞株 <td>ref 32</td></tr><tr><td>TRF2-YFP PtK2 Berns</td><td>研究室</td><td></td>で生成された安定細胞株 <td>ref 32</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>PARG阻害剤</td><td>Trevigen</td><td>4680-096-03</td><td></td></tr><tr><td>DNA&ndash;PKcs阻害剤&nbsp;NU7026&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>N1537</td><td></td></tr><tr><td>ATM阻害剤 KU55933</td><td>&nbsp;Calbiochem</td><td>118500</td><td></td></tr><tr><td>オラパリブ&nbsp;</td><td>Apexbio Technology</td><td>A4154</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド&nbsp;</td><td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS</td><td>100503-916 (EA)</td><td></td></tr><tr><td>数量 1 次元解析ソフトウェア バージョン 4.6.9</td><td>Bio-Rad</td><td>SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC&nbsp;</td><td>画像解析プログラム</td></tr><tr><td>Excel</td><td>マイクロソフト</td><td></td><td>スプレッドシート プログラム</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>BP151-500</td><td>洗剤</td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水 (DPBS) 10X カルシウムとマグネシウムなし</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>14200166</td><td>1X&nbsp;</td></tr></tbody></table>

生体内で単純および複雑な dna 損傷に対する細胞応答を研究するレーザー microirradiation

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA 損傷は、ゲノムの整合性の保護のために重大である細胞のシグナル伝達と修理の特定の応答を誘発します。レーザー microirradiation DNA 損傷応答 (DDR) は、生体内で調査する貴重な実験ツールとなりました。細胞核内のサブミクロン領域に閉じ込められたレーザ誘起損傷に応答高分子ダイナミクスの実時間高分解能単一細胞解析をことができます。ただし、損傷の種類の違いの感謝せず様々 なレーザーの条件が使用されています。その結果、損傷の性質は頻繁にはよく特徴付けられるまたは制御、採用または変更プロファイルに明白な矛盾を引き起こしています。別々 の DDR と修理蛋白質アセンブリを異なる照射条件 (すなわち波長と同様、さまざまな入力力 (域) (fs) 近赤外線 (NIR) レーザー) に誘導を行った。これは、DNA 損傷の種類を反映します。このプロトコルはどのようにレーザー入力電力の滴定により異なる量の誘導と、ベースと架橋損害、シグナル伝達、差動ポリ (adp-リボース) (PAR) の検出が簡単に監視できる DNA 損傷の複雑さについて説明しますと被害サイトで経路特定修復因子アセンブリ。被害の条件が決まったら、さまざまな損傷が複雑さと差分の損傷のシグナル伝達の効果だけでなく、関心の任意の因子に上流因子の枯渇を調査することが可能です。

EGFP 53BP11220-1711または TRF2 YFP を安定に発現する PtK2 セルを使用して、レーザー入力電力滴定を行った彼らの募集 (図 1)32の最適条件を決定します。
高入力出力レーザー被害サイトで基本ダメージを特異的に認識する GFP NTH1 DNA グリコシラーゼ、CPD (通常紫外線 (UV) 損傷で生成される架橋損傷) の重要なクラスタ リングが観察されました。さらに、鎖切断数の増加を反映しており、この状況で (図 2 a) 複雑な DNA 損傷を誘発する、XRCC1 および CtIP の高信号が観察されました。蛍光タンパク質を融合した他の DNA の glycosylases (例えば、GFP ネイ エンドヌクレアーゼ VIII のような 2 (NEIL2) と GFP-8-オキソグアニン グリコシラーゼ (OGG1)) コンデンシンだけでなく、...

このプロトコルの目標はレーザー microirradiation を使用してさまざまな種類の比較的単純な鎖切断と被害サイト体内に DNA 損傷シグナル伝達と修復因子アセンブリを勉強する、複雑な損傷を含む DNA の損傷を誘発する方法を記述することです。.

生体内で単純および複雑な DNA 損傷に対する細胞応答を研究するレーザー Microirradiation

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

このプロトコルの総合的な目的は、単純な鎖切断や複合的な損傷を含む異なる種類のDNA損傷を誘導するためにレーザー微小照射法を用いる方法を解説し、生体内におけるDNA損傷シグナリングおよび修復因子の集合を研究することです。1960年代から70年代にかけて、私たちは背後にあるような顕微鏡を通してレーザービームを集光させ、染色体の狭い領域に損傷を与えることができました。細胞は分裂し、生存しましたが、私たちはその理由を理解することができませんでした。それから40年が経過した現在、私たちはこの手法を用いてDNA修復を選択的に研究しており、本日はその内容について解説します。この手法は、DNA損傷がどのように認識・処理されるのか、また損傷シグナルが細胞内でどのように伝播するのかといった、DNA修復分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。レーザー微小照射法を用いることで、細胞核内の数マイクロメートルの領域に限定してDNA損傷を与え、それに対する高分子ダイナミクスのリアルタイムかつ高解像度な単一細胞解析が可能になります。しかしながら、誘発される損傷の種類による違いが十分に考慮されないまま、さまざまなレーザー条件が使用されてきたため、細胞応答や因子のリクルート、および修飾に不一致が生じています。HeLa細胞で蛍光タグ付きタンパク質を発現させるには、1日目に、24ウェルプレートの1ウェルに0.5 mLの培地を用いて6～8 × 10⁴個の細胞を播種します。その後、プレートを組織培養インキュベーターに入れます。2日目に、蛍光タグ付きDNA修復因子をコードする哺乳類発現プラスミドDNA 0.3 µgを25 µLの無血清培地で希釈し、リポソーム媒介DNAトランスフェクションを行います。ここでは、二本鎖切断損傷にはGFP融合53BP1の損傷部位標的ドメインを、塩基損傷にはGFP融合DNAグリコシラーゼNTH1を使用します。別の1.5 mLチューブで、リポソームベースのDNAトランスフェクション試薬1 µLを25 µLの無血清培地で希釈し、その後、希釈したDNAとトランスフェクション試薬を含む2つのチューブの中身を混合し、室温で10分間インキュベートしてDNA-リピッド複合体を形成させます。細胞を0.5 millilitersの培地で1回洗浄し、その後、培地を除去して0.5 millilitersの新鮮な培地を細胞に加えます。DNA-脂質複合体を細胞に加え、プレートを数回ゆっくりと揺らして静かに混ぜ合わせます。その後、細胞をインキュベーターに戻します。4〜6時間後、細胞から培地を除去し、0.5% Trypsin-EDTAを300 µL加えます。溶液を除去した後、Trypsin-EDTAを200 µL加え、細胞を37 °Cで3〜4分間インキュベートします。細胞が剥離したことを確認後、培地を

laser-microirradiation-to-study-vivo-cellular-responses-to-simple

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Genetics

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