リアルタイムで開発を可視化する多光子タイムラプス イメージング: ゼブラフィッシュ胚の神経堤細胞の可視化

多光子タイムラプスイメージングの全体的な目標は、遊走性細胞集団の高解像度の3次元リアルタイム画像をキャプチャすることです。この方法は、さまざまな細胞集団の移動経路のマッピングなど、発生生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術が従来の共焦点顕微鏡法と比較した場合の主な利点は、多光子レーザーの方が組織への浸透が深く、光毒性が低いことです。

これにより、より厚い組織での有用性が向上し、より長い期間の画像取得が可能になります。午後3:00から9:00の間に胚収集を設定するには、繁殖タンクを組み立て、逆浸透、またはRO水で満たします。

最大3人の女性と3人の男性を分割されたタンクの反対側に移します。翌朝、ビバリウムのライトが点灯した直後に仕切りを取り外します。20分間、または十分な数の胚が生成されるまで、邪魔されずに交配を許可します。

胚は繁殖タンクの底にあります。卵が観察されたら、スロット付きのインナータンクを魚と一緒に持ち上げ、RO水で満たされた清潔で頑丈なアウタータンクにすばやく入れます。採卵スクリーンを使用して、外側のタンクから卵を収集し、30ミリリットルの1X胚培地を含むシャーレに卵を移します。

集めた卵を摂氏28.5度で孵化させます。トランスジェニック胚の場合、受精後またはHPF後24時間で、死んだ卵子を取り出し、胚の発生段階を評価します。鉗子を使用して、GFPを発現する3〜4個の胚から絨毛膜を取り除きます。

標準的な460〜490ナノメートルのバンドパス励起フィルターを備えた解剖蛍光実体顕微鏡の下で、GFP陽性胚をスクリーニングします。これらの胚を、30ミリリットルの新鮮な1X胚培地を含む別のシャーレに移します。20 HPF後、スクリーニングおよびデコレーションしたGFP陽性胚を0.003%PTU溶液に入れて、色素沈着を抑制します。

早期に治療を開始することは、神経堤や神経上皮の発達に悪影響を及ぼす可能性があるため、避けてください。0.4gのLowMeltアガロースパウダーを20mLの1x胚培地に加えます。混合物を1〜2分間、または溶液が透明になり、すべての粒子が溶解するまで加熱します。

約1mLのアガロース溶液を新鮮な1.5mLの遠心分離チューブに分注して保存します。オープンバスチャンバーを設置するには、オープンバスチャンバーのベースに少量の高真空グリースを置きます。円形のガラスカバースリップをベースに置き、開いたバスチャンバーの上部をしっかりと固定するまでベースにねじ込みます。

ベースが約3/4s満たされるまで、約500〜700マイクロリットルの2%アガロース溶液をオープンバスチャンバーにピペットで移します。30秒待って、アガロースが完全に重合せずにわずかに冷えるまで待ってから、1つの胚を塩基の中心に移します。蛍光実体顕微鏡下で、10マイクロリットルのマイクロピペットチップを使用して胚の向きを合わせ、胚培地を追加したときに浮かび上がらないように、胚をアガロースの底近くに配置します。

重要なステップは、胚がアガロースに正しく配置されていることを確認することです。これらの実験では、胚を横方向に向けますが、胚を背側と腹側の領域に焦点を合わせるように配置することもできます。アガロースが固まるまで胚をモニターし、再配置します。

次に、トランスファーピペットを使用して、組み立てたオープンチャンバーをタイムラプス胚培地で完全に満たします。セットアップ全体を顕微鏡のステージに置いた後、テキストプロトコルに従って、5倍の対物レンズを使用して胚を特定します。次に、ステージを手動で最も高い位置まで上げ、ファインフォーカスを使用して胚を顕微鏡範囲の中央に配置します。

手動でステージを下げ、5時間の目標を25時間の水浸目標に変更します。胚の焦点を戻すために、ステージを慎重に上げます。ソフトウェアで、XYTZモードをクリックして、Zの深さにわたってXY平面の時間またはT間隔で複数の画像を取得します。

これらの実験では、目の横方向のエッジが z スタックの始まりです。ここにフォーカスがある場合は、ソフトウェアで開始ボタンをクリックします。Zスタックの終わりである胚の正中線まで焦点を合わせた後、終了ボタンをクリックします。

重要なステップは、Z ステップが対象領域を網羅していることを確認することです。私たちの場合、外側から内側の縁までの目の幅をキャプチャする必要があります。取得時間とイメージング周波数を調整するためのメニューをクリックします。

fluor4の適切な回復と胚の生存のためには、レーザー出力がオンのときのzスタック取得とレーザー出力がオフのときの回復時間の間に少なくとも1対3の比率を考慮してください。胚の回復に適切な時間で、指定されたウィンドウでzスタック間の時間を設定します。次に、適切なウィンドウで実験の合計時間を設定します。

次に、ライブ画像設定をオンにして、レーザー設定の最終調整を行います。ソフトウェア内でレーザー透過率、ゲイン、オフセットスライダーバーを調整して、蛍光画像を最適化します。また、実験の長さ、胚の予想される成長などに応じて、必要に応じて胚の向きを調整します。

実験の期間中、対象領域がフレーム内に留まることを確認します。タイムラプス撮影中は、落射蛍光光源をオフにし、背景光から保護するのに十分なレーザーセーフティボックスでステージを覆い、スタートを押します。レーザーセーフティボックスのスライドドアからオープンバスチャンバーにアクセスし、8〜12時間ごとにタイムラプス胚培地を補充します。

画像取得後、画像処理ソフトウェアでファイルを開き、正しい画像シリーズを強調表示します。ソフトウェアで、プロセスメニューを選択し、[3Dデコンボリューション]をクリックして、各zスタックのデコンボリューションに適用します。個々のtifファイルをビデオ処理ソフトウェアにインポートし、すべてのtifファイルを選択してビデオエディターにドラッグします。

ビデオ内の各画像の長さを 0.1 秒に調整します。最後に、ビデオをmovまたはmp4ファイルとしてエクスポートします。ここでは、トランスジェニックsox10:EGFPおよびfoxd3:GFPゼブラフィッシュ系統において、頭蓋顔面構造と眼前部を生じさせる頭蓋神経堤細胞の遊走パターンが多光子蛍光イメージングによって見られます。

12〜30 hpfのSox 10陽性神経堤細胞は、神経管の端から頭蓋顔面領域に移動します。前頭脳と中脳の細胞は、背側と腹側に発達中の眼に移動し、眼周囲メセンシンに住み着きます。ここに示されているように、sox10陽性細胞は前頭の鼻突起を形成します。

菱脳からの神経堤細胞は腹側に移動し、咽頭弓を生じさせます。30〜60 hpfのfoxd3陽性神経堤細胞のタイムラプスイメージングは、これらの細胞が視カップと表面外胚葉の間を移動し、矢印でマークされた眼の裂け目を通って移動し、アスタリスクでマークされたレンズの周りで合体して虹彩間質を形成していることを示しています。一度習得すると、このテクニックは最初から最後まで、適切に実行されれば4日で完了することができます。

この手順を試みるときは、蛍光量の多い胚を選択することを忘れないでください。ソフトウェアのセットアップは最初は難しい場合がありますが、パラメータが決定されると、通常、追加の変更は最小限に抑えられます。このビデオを見れば、多光子タイムラプス顕微鏡を使用して胚内の移動する細胞を画像化する方法について十分に理解できるはずです。