密なトランスポゾン挿入ライブラリを使用して細菌活用腸内細菌系統など、大腸菌や赤痢菌の作成
September 23rd, 2017
ここに提示は、大腸菌や赤痢菌細菌の活用を使用して高密度トランスポゾン挿入ライブラリを作成するための簡単な方法です。このプロトコルは、トランスポゾンのランダムなゲノム挿入による細菌のユニークな突然変異体の何千もの何百ものコレクションの作成をできます。
この実験手順の全体的な目標は、細菌の結合を使用して、大腸菌または赤痢菌に高密度のトランスポゾン挿入ライブラリを作成することです。この技術により、Tn10トランスポゾンのランダムなゲノム挿入により、数十万のユニークな細菌変異体を作成することができます。この技術の主な利点は、トランスポゾンを抱くプラズマの移動が、エレクトロポレーションなどの他の効率の低い方法ではなく、細菌の結合を介して行われることです。
さらに、Tn10トランスポゾン自体は、他のトランスポゾンよりもバイアスが少なくゲノムに挿入されます。滅菌技術を使用して、ドナー株の1ミリリットルの一晩培養物を滅菌エッペンドルフチューブに加えます。チューブには、たとえばドナーのDのラベルを付ける必要があります。
レシピエント株についても同じことを行い、レシピエント株の1ミリリットルの一晩培養物を滅菌エッペンドルフチューブに移します。繰り返しになりますが、たとえば、受信者の場合は R でラベル付けされます。両方のチューブを室温でGの14,000倍で1分間遠心分離します。
これは、卓上型遠心分離機で行うことができます。遠心分離機が稼働している間に、結合用のフィルターを準備します。滅菌鉗子を使用して、抗生物質を含まない標識LB寒天プレートにニトロセルロースフィルターを配置します。
あるいは、ニトロセルロースフィルターの代わりに、滅菌ブロッティングペーパーを使用してもよい。コンタミネーションを最小限に抑えるために、各フィルターを別々のLB寒天プレートに置きます。各フィルターが、適切にラベル付けされたLB寒天プレートに配置されていることを確認してください。
プレートを3枚作り、それぞれにフィルターを入れます。1つはドナー株用、1つはレシピエント株用、もう1つはライブラリー用です。遠心分離機が終了したら、一晩培養物を取り出します。
抗生物質を含むすべての増殖培地をエッペンドルフチューブから取り出し、廃棄します。細菌細胞パレットを乱したり乱したりしないように注意してくださいが、すべての増殖培地を取り除くようにしてください。無菌的に作業し、各サンプル間でチップを交換するようにしてください。
各エッペンドルフチューブに、抗生物質を含まない110マイクロリットルの新鮮なLB培地を追加し、ピペットで上下させて培養液を再懸濁します。無菌的に作業するようにしてください。ピペッティングを数回繰り返して、細胞の塊が残らないようにします。
このステップは、細菌培養物を濃縮し、一晩培養物から残った抗生物質を除去するために行われます。ピペットを使用して、濃縮ドナー培養物の50マイクロリットルをドナーとラベル付けされたフィルターに置きます。50マイクロリットルをゆっくりとフィルターに滴下します。
再懸濁された培養物の50マイクロリットルを添加するレシピエント株についても同じことを行い、濃縮された再懸濁された培養物をレシピエントフィルターに滴賢く加えます。結合が起こるためには、レシピエント株とドナー株の両方を同じ濾紙に添加して、物理的に密接に接触させます。これを行うには、ドナー株とレシピエント株の両方の50マイクロリットルを、ライブラリとラベル付けされたプレート上の同じフィルターに加えます。
フィルターが入ったこれらの寒天プレートを37度で6時間置きます。抱合のプロセスは、摂氏37度で6時間以上にわたって行われます。標識中、pJA1プラスミンはレシピエント株に移動します。
結合後、細菌はボルテックスによってフィルターから解離し、1ミリモルのIPTGで誘導されます。IPTGはトランスポゼースを誘導し、カナマイシン耐性の遺伝子を含むトランスポゾンがレシピエント株のゲノムにランダムに挿入されます。細菌は、カナマイシンと別の抗生物質を含むLB寒天プレートに播種され、トランスポゾンを含むレシピエント株に選択します。
レシピエント株はLambda pir陰性であるため、pJA1プラスミンは失われます。摂氏37度で6時間成長した後、結合が完了します。フィルターが入ったプレートをインキュベーターから取り出します。
滅菌鉗子を使用して、ネガティブドナーコントロールを含むフィルターをLB寒天プレートから取り外します。チューブを軽くたたいて濾紙を円錐形バイアルの底に戻し、フィルターがLBメディアに完全に浸されていることを確認します。このチューブには、IPTGを含む2ミリリットルのLB媒体と1ミリモルの最終濃度が含まれています。
チューブを1分間ボルテックスして、バクテリアをニトロセルロースフィルターから分離します。LB培地は細菌細胞で濁るはずです。受信者制御とライブラリについても、これを繰り返します。
細菌細胞を含むフィルターを徹底的にボルテックスして細菌をフィルターから分離した後、細菌細胞を選択した培地に播種します。このステップでは、細菌をカナマイシンとナリジクス酸などの別の抗生物質を含むLB寒天プレートに播種します。カナマイシンは、カナマイシン耐性マーカーを含むトランスポゾンがゲノムにうまく組み込まれているレシピエント細胞を選択するために使用されます。
マーカーがゲノムに組み込まれていないレシピエント細胞が選択されます。ナリジクス酸などの別の抗生物質は、ドナー株に対して選択するために使用されます。ここで使用されるドナー株はナリジクス酸に感受性であり、レシピエント株はナリジクス酸に耐性があります。
この2つ目の抗生物質を用いることで、ドナー株を除去することが可能です。このステップでは、いくつかの希釈液を播種して、適切な間隔で多数のコロニーを生成するライブラリーの希釈を決定する必要があります。トランスポゾンライブラリーを含むすべてのプレート上のコロニー数をカウントして記録した後、一部のユーザーはライブラリーを1つのチューブにプールまたは結合したいと思うかもしれません。
これは、滅菌スプレッダーを使用して行うことができます。トランスポゾンライブラリーを含むLB寒天プレートに1ミリリットルのLB培地を加えます。培地をプレートに加えたら、滅菌スプレッダーを使用してプレートから細菌をこすり落とし、分離します。
多くの場合、プレートからすべての細菌を取り除くことは不可能です。細菌懸濁液を取り除き、50ミルまたは15ミルの円錐形のバイルに入れます。これをすべてのプレートで繰り返します。
すべてのプレートを掻き取りたら、プールされた細菌懸濁液を1分間ボルテックスして、細胞の塊を分解します。これがプールされたライブラリを構成しています。37°Cで18時間成長した後、ドナーまたはレシピエントのコントロールプレートに成長があってはなりません。
変異体ライブラリーを含むプレートは、理想的には、さまざまなサイズの多くのコロニーを含んでいます。コロニーサイズが異なると、適応度が異なるクローンが示されており、プロトコルが機能していることを示す良い兆候です。細菌における高密度トランスポゾン突然変異導入ライブラリーの作製は、病原性遺伝子や細菌病原体の発見から必須遺伝子の研究、遺伝的相互作用ネットワークの同定まで、多くのダウンストリームアプリケーションにとって有利な可能性があります。
これらのダウンストリームアプリケーションはすべて、高密度のトランスポゾン挿入ライブラリの構築に依存しています。ここで紹介する方法は、大腸菌や赤痢菌などの腸内細菌株で非常に高密度なトランスポゾンライブラリーを作製するための、簡単、迅速、安価な手順を提供します。
概要
この記事では、細菌接合を通じて大腸菌または赤痢桿菌に高密度トランスポゾン挿入ライブラリーを作成する方法を紹介します。このプロトコルにより、トランスポゾンのランダムなゲノム挿入を通じて数十万のユニークな細菌変異株を生成することができます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 微生物学
- 遺伝学
- トランスポゾン生物学
背景
- トランスポゾン挿入ライブラリーは遺伝子機能の研究に有用です。
- 細菌接合は電気穿孔よりも遺伝物質を転送する効率的な方法です。
- Tn10トランスポゾンは他のトランスポゾンよりも挿入バイアスが低いです。
- この方法により多様な変異体ライブラリーの作成が可能です。
研究目的
- トランスポゾン挿入ライブラリーを生成するための信頼性の高いプロトコルを開発すること。
- 細菌株における変異体生成の効率を向上させること。
- 大腸菌および赤痢桿菌における遺伝学的研究を促進すること。
使用された方法
- ドナーおよび受容体の細菌培養の準備。
- 細菌接合のためのニトロセルロースフィルターの使用。
- トランスポゾン挿入のためのIPTGによるトランスポナーゼの誘導。
- 耐性マーカーのための抗生物質による変異体の選択。
主要な結果
- 高密度トランスポゾン挿入ライブラリーの成功的な作成。
- カナマイシン耐性を持つユニークな細菌変異体の同定。
- 遺伝子転送のための細菌接合の効率性の実証。
- コロニー計数と選択を通じての方法の検証。
結論
- このプロトコルは多様な変異体ライブラリーを効果的に生成します。
- 細菌接合はトランスポゾン挿入のための優れた方法です。
- このアプローチは微生物遺伝学の様々な研究に適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Dense transposon insertion libraries generated via bacterial conjugation enable systematic gene disruption and high-throughput functional genomics in enterobacterial strains. This capability supports early-stage target validation and mechanistic de-risking by providing comprehensive mutant resources for pathway interrogation. The approach enhances predictive confidence and portfolio triage in antimicrobial and bacterial pathogenesis research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables genome-wide interrogation of gene function through random mutagenesis.
- Supports identification of essential genes and genetic interaction networks.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing non-essential and fitness-related loci.
- Provides a scalable platform for hypothesis-driven target validation.
Screening & Assay Development
- Generates validated mutant libraries for robust forward genetic screens.
- Delivers reproducible and quantitative outputs for downstream Tn-Seq analysis.
- Standardizes mutant resource preparation for cross-study comparability.
- Enables high-throughput screening of compound or genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant bacterial models for translational biomarker discovery.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation of antimicrobial targets.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on genetic essentiality data.
- Provides predictive insights into bacterial fitness and virulence determinants.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing foundational mutant resources for functional genomics and target prioritization workflows.
- Discovery Biology: Systematically disrupts genes to clarify pathways and de-risk biological mechanisms.
- Screening: Supplies high-density, reproducible mutant libraries for scalable screening platforms.
- Analytics: Enables quantitative mapping of gene essentiality and interaction networks via Tn-Seq.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical bacterial models for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable mutant resource for ongoing and future R&D initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target selection.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and cost-effective mutant library generation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation by enabling robust genetic screens.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of antimicrobial and bacterial pathogenesis programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial genetics and sterile technique.
- Needs access to standard microbiology instrumentation and selective media.
- Demands cross-team standardization for library pooling and downstream analytics.
- Adaptation may be necessary for non-enterobacterial strains or alternative model systems.
- Library density and insertional randomness should be validated for each application.
