Name: 密なトランスポゾン挿入ライブラリを使用して細菌活用腸内細菌系統など、大腸菌や赤痢菌の作成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: 学ぶ細菌接合法を用いた高密度トランスポゾン挿入ライブラリ作成法。Escherichia coliやShigella flexneriで数十万の独自変異体を効率的に生成し、遺伝子機能解析やTn-Seqなどの下流応用に活用できます。

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ジョージ教会ラボ pJA1 プラスミドの種類のギフトのために感謝します。感謝ファビエンヌ ハンバーガーと Urs Jenal 研究室からアレックス ベーム バーゼル Biozentrum で細菌の活用でについて、BW20767 株を提供するため。また有用な編集のオリン Silander に感謝します。この研究のための資金は、バーゼル、スイス連邦共和国の大学にニュージーランドのマッセイ大学とシステム生物学 (プロジェクト"戦い X"Dirk Bumann に授与) のスイスの取り組みからの資金によって提供されました。

注意: S. 菌 を使用すると、受信者のひずみとして場合、s. 菌 が胃腸の病気を引き起こす可能性が人間の病原体であることに注意してください。適切なバイオ セーフティ対策 (ヨーロッパおよび米国の BSL 2 またはニュージーランドで PC2 を指定) と 米菌 を含む実験を行う必要があります。このプロトコルに関連付けられているビデオのすべての実験が行われた非病原性 大腸菌 のよ特徴付けられた受信者ひずみを用いた MG1655 PC1 の設定で。赤痢菌 と以前行ったバーゼル, Biozentrum BSL 2 研究室の 6 で説明した。
 注: 2 回効果的に次の実験を行っています。(ステップ 1.1-ステップ 4.5) の最初の部分は、めっき用最高希釈を見つける目標が与えるプレートあたりの多くの個々 のコロニーが多く活用の希釈に芝生フォームを見つけるには、ライブラリに実行されます。これは、大幅に削減できるフィットネスの突然変異体とより堅牢なフィットネスとのそれら間の競争を減らすことです。(手順 5.1 7.4) の 2 番目の部分は、多くのプレートは、ライブラリの適切な希釈に広がっている最後のライブラリの作成。
 1。 に準備 1 日事前実験する <ol><li>Inoculate、冷凍在庫、流体培養基 LB の 2 mL でドナーのひずみからミラーズ レシピ (10 g/L の NaCl) メディア 100 μ g/mL にアンピシリンを含みます。ここで使用されるドナーひずみは 大腸菌 BW20767 15 pJA1 プラスミド 11 をかくまっています。アンピシリンの使用 pJA1 のプラスミッドのための選択を保持します</li>。
	<li>単一コロニーや冷凍ストック以外、かカナマイシン、アンピシリン抵抗性マーカーと LB 媒体の 2 mL で受信者のひずみからの Inoculate。ここで使用される受信者のひずみは 大腸菌 &#34; 野生型 &#34; ナリジクス酸に対する自然抵抗性変異株による MG1655 17 , 18 のひずみ。それは 30 μ g/mL ナリジクス酸で栽培されています</li>。
	<li>(90 mM シャーレ、約 12.5 mL) で準備 20 ルリアスープ含む 1.5% 寒天版。抗生物質を欠けている寒天を使用するまで数ヶ月の 4 ° C で保存ことができます</li>。
	<li>(90 mM シャーレ、約 12.5 mL) で準備 20 ルリアスープ含む 1.5% 寒天版両方 30 μ G/ml でナリジクス酸で 50 μ g/mL (LBA Nal30 Kan50) カナマイシンを含みます。抗生物質を含む寒天を使用するまで数ヶ月の 4 ° C で暗闇の中で保存ことができます</li>。
	<li>は、200 mL 滅菌 LB 媒体を準備します。LB メディアが数ヶ月常温で保存できます</li>。
	<li>メーカーによると 1 mL 100 mM の IPTG、滅菌在庫を準備 &#39; の指示</li>。
</ol> 2。細菌の交配や共役 室温で <ol><li>1 分 14,000 x のためのドナーのひずみの一晩文化の遠心 1 mL g。成長媒体を破棄します。抗生物質を含むすべての成長媒体を削除するこの手順を実行します</li>。
	<li>文化を集中の LB (抗生物質を含まない)、110 μ L に細胞ペレットを再懸濁します</li>。
	<li>使用して滅菌鉗子位置滅菌硝酸セルロース フィルター (または滅菌一枚のあぶらとり紙は使用できますが、資料を参照してくださいリスト) (抗生物質を含まない) LBA プレートの真ん中に。ラベル プレート &#34; ネガティブ コントロール: ドナー &#34;.</li>
	<li>フィルター上に濃縮されたドナー文化の 50 μ L をドロップ、ピペットを使用しています</li>。
	<li>手順 2.1-4 受信者のひずみのプレートをラベル付け &#34; ネガティブ コントロール: 受信者 &#34;</li>。
	<li>ライブラリの (これらのプレートが抗生物質を含めないでください) LBA プレートに 1 つの滅菌フィルターに (ステップ 2.5) から受信者負担の (手順 2.2) からドナーと 50 μ L の 50 μ L をドロップします。このプレートをラベル &#34; ライブラリ &#34; 交配が発生するためドナーと受信者フィルターに近く物理的な接触で</li>。
	<li>6 h の 37 ° C でフィルターを含む寒天プレートを配置</li>
</ol> 3。PJA1、トランスポザーゼの IPTG 誘導によるトランスポゾンの活性化 <ol><li>準備 3 15 mL コニカル バイアル 1 mM (すなわち IPTG の 100 mM の在庫の 20 μ L) の最終的な集中に IPTG と LB の 2 mL を含みます。それぞれのラベル: ドナー管理、受信者コントロールおよびライブラリ</li>。
	<li>は、(ステップ 2.4) から 37 ° C で成長の 6 h 後インキュベーターからプレートを削除します。いくつかの細菌の増殖は、フィルター上に表示する必要があります</li>。
	<li>使用滅菌鉗子は、ドナー管理からろ紙を削除し、15 mL コニカル バイアル (ステップ 3.1) からドナー コントロールをラベルに配置。受信者コントロールとライブラリの同じ操作を行います</li>。
	<li>15 mL コニカル バイアルの底にろ紙を取得し、ポンドに完全に浸漬を確保する管をタップ</li>
	<li>渦管を完全な少なくとも分高硝酸セルロース フィルターから細菌の関連付けを解除します。LB は細菌細胞 ( 図 2) と曇りになります</li>。
	<li>というラベルの付いた LBA Nal30 Kan50 プレートの上にドナーの管理から vortexed 細菌懸濁液 200 μ L をプレート滅菌ガラス ビーズまたは滅菌スプレッダーを使用して &#34; ドナー管理、200 μ L &#34; です</li>。
	<li>プレートをラベリング、受信者コントロールについて (3.6) 上記手順を繰り返します &#34; 受信者コントロール、200 μ L &#34; です</li>。
	<li>プレートをラベリング ライブラリに (3.7) 上記手順を繰り返します &#34; ライブラリ、200 μ L &#34; です</li>。
	<li>(すなわち 1:5、1:10 と 1: 100 希釈液、希釈剤として抗生物質を含まない LB を使用して) 追加の希薄を作るライブラリの。適切なラベル LBA Nal30 Kan50 プレートをプレート 200 μ l の原液ライブラリおよび追加希薄にします</li>。
	フィットネスの大規模な損失を引き起こす遺伝子に挿入されたトランスポゾンと 18 h のクローンの <li>37 ° C に場所プレート インキュベーターは成長し、プレート上に表示に時間がかかります。コロニーのサイズ ( 図 3) の様々 な必要があります。ドナーと受信者のひずみプレートはありませんそれらのコロニーです</li>。
</ol> 4。最終的な突然変異体のライブラリに使用するライブラリの適切な希釈を選択 <ol><li>を決定するさまざまなサイズの多くの植民地をもたらすステップ 3.9 からライブラリの希釈の間隔は十分に。目的は、植民地が互いにマージし、リソースの競合として 1 つの皿の上可能ですが、あまりに多くの植民地を得ることです。この番号は、プレート当たり約 500-2,000 の植民地をする必要があります。皿の上の適切なコロニーの密度の例は 図 3 に示す.</li>
	<li>版のコロニーの数を記録します</li>。
	<li>共役 (受信者の細胞 1 個あたりの conjugants 数) の周波数を計算します。これは 1 x 10 -6 19 1 x 10 -4 の範囲にする必要があります</li>。
	<li>は、ダウン ストリーム アプリケーションに基づいて最終的なライブラリで必要な突然変異体の数を決定します。多くのユーザーは単に可能な限りとして多くのミュータントとライブラリを必要と。可能な理論としての多くトランスポゾン挿入を生成する (1 つ挿入すべての塩基対)、おおよその目的ly (すなわち、エシェリヒア属大腸菌 の ~4.5 x 10 6) ゲノムの塩基対と同じ数のコロニーのすべての可能なトランスポゾン挿入でゲノムを完全に飽和します。それは、エッセンシャルで挿入を抱いて多くの突然変異体に注意してくださいすることが重要または機能的に重要な遺伝子はこれらの突然変異は受信者に致命的になるよう、回復することができません</li>。
	<li>は、最初のライブラリの容量がどの程度が希望するサイズのライブラリを作成する必要を計算します。たとえば、目的のライブラリのサイズは 5 × 10 4 変異体です。ステップ 3.9 からコロニーの最も適した間隔で希釈された 200 μ L、1:10 の希釈。このプレートのコロニーの数は、約 2,000 のコロニーをすると推定されます。5 × 10 4 変異体が必要し各プレートは 2,000 の植民地なら 25 枚この希釈に必要になります</li>。
</ol> 5。最終的な突然変異体ライブラリの作成 <ol><li>手順 1 から 3.8 (手順 4.4 参照) を必要に応じて手順 1.4 で板の数を調整します</li>。
	<li>3.9 のステップで目的のサイズのライブラリを作成する必要に応じて、できるだけ多くのプレートの上に 4.1 で希釈をプレート (手順 4.4 参照).</li>
</ol> 6。ライブラリ密度推定 <ol><li>プレートあたりどのように多くのコロニーをカウントし、それによってライブラリがどのように高密度の大まかな見積もりを得る。たとえば: 2 x 10 5 植民地の合計はメッキします。大腸菌 MG1655 ゲノムは約 4.5 × 10 6 塩基対です。したがって、約 2 × 10 5 ライブラリを挿入、挿入 の平均 があることを意味すべての 22 の塩基対と、約 1 × 10 の 3 塩基対の各遺伝子必要があります変更約 45 倍、その 1 つの遺伝子を与えられました。必須遺伝子の挿入がこのライブラリの非常に過小評価する可能性があります、したがって非必須遺伝子の密度がこれよりも大きくなる可能性が。この種の計算はトランスポゾン密度の広範な見積もりとの 1 つを提供します</li>。
</ol> 7。トランスポゾン ライブラリおよびストレージ プール <ol><li>コロニーを数え、ライブラリ プレートに LB (または必要に応じてなど) の 1 つの mL を追加し、プレートから細菌をこすり落とすため滅菌の拡散機を使用します。細菌懸濁液を除去し、50 mL と 15 mL コニカル バイアルに置き。すべての版の繰り返し</li>。
	<li>渦完全な分のプールされた細菌懸濁液懸濁液を均一にします</li>。
	<li>最終濃度 20% に滅菌グリセリンを追加。
	<ol><li>簡単再成長のための 0.25 mL 管 100 x 20 μ 因数を準備します</li>。
		<li>少なくとも 2 つ以上クリオバイアルで分注 1 mL を準備します</li>。
	</ol></li> <li>-80 ° C ですべての因数を保存</li></ol>

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</ol>

著者は、何を開示します。

ここで説明されているプロトコルは、密なカーソル ライブラリの構築のためことができます。このメソッドは、以上 2 x 105ユニークなトランスポゾン変異体文化ボリューム6の 5 mL を用いた下をトランスポゾン ライブラリの作成できます。比較的簡単に実行し、最も基本的な微生物学実験室で使用可能な試薬を使用しは拡張性が高く、高価な機器やエレクトロポレーション キュヴェットなど消耗品の方法で少しを必要とします。
この方法の重要な利点は、ユーザーは理論的には、腸内細菌の受信者菌株の選択の広い緯度を持っている、です。これは紙、だけでなく、他の11、pJA1 プラスミドは赤痢菌6とサルモネラなど他の腸内細菌の受信者の種で正常に使用されていますが、受信者のひずみとしてエシェリヒア属大腸菌を使用型ネズミチフス菌ひずみ SL134410。理論的には、pJA1 の複製 (織R6Kγ) γ 起源により、広いホストの範囲19、受信者の歪みであることができますで維持されるこのプラスミドpir +.最近では、 pir +腸内細菌株の20、さらなる柔軟性を与える範囲での構築を可能にする新しい方法を記載されています。また、pJA1 の RP4 プラスミッドから300 塩基対暴徒地域は、グラム陰性細菌系統19の広い範囲にこのプラスミドの伝達できます。簡単に言えば、このメソッド理論で使用できる受信者の系統の様々 ないくつかの条件が満たされている限り: ひずみはpir+、抗生物質カナマイシン以外とドナーの負担以外にマークされています。
プロトコルの重要なステップは、適切な手順 4.1 うち板に細胞数の推定であります。植民地はあまりにも密接に間隔が、彼らはプレート上の栄養素を競うその少ないフィットの変異体が outcompeted。これは変異体の合計数の削減につながる可能性があります。また場合植民地の間隔が離れすぎて、板上には、あまりにも少数のコロニーがあるし、寒天の大規模なライブラリを達成するために必要な数の合計が負担になります。したがって、プレートあたりのコロニー数の面で適切なバランスを達成することは重要です。
手順は、説明されているように作業していることを確認するためのプロトコルのコントロールを行うことが重要です。特に、ドナー株に対するカウンター選択としてナリジクス酸を使用する場合、負ドナー制御板、コロニーの自由を確保することが重要です。これは、ナリジクス酸、偽陽性を降伏へ自然の抵抗率が低い (約 1 × 10-10)21があるためにです。通常、抱合と転位の速度は約 2 × 10-4 19です。したがって、抱合と転位の速度は桁違いナリジクス酸に対する自然抵抗性の率よりも大きいです。したがって、真の転位のイベントと比較して、偽陽性の率は非常に低く、プロトコルを使用する場合、無視できるとみなされます。ただし場合活用または転位の料金を大幅に削減 (効率が低いため交尾や IPTG とトランスポザーゼの遺伝子の誘導の欠如) から、プロトコルがスケール アップし、偽陽性の数を補うために (のクローンを作成します。トランスポゾンの挿入はありません) も増加します。
ステップ 3.2 および 3.10 でインキュベーション時間をいくつかの変更が可能です。6 h の共役が発生する 3.2 状態が、私たちの経験ではこの時間ステップをすることができます結果を著しく変更することがなく (すなわち4-7 h) に変化します。さらに、ステップ 3.10 で植民地に寒天版で孵化する時間の長さも調整できます。これは、受信者のひずみの時間または成長率の 2 倍の平均によって変えることができます。さらに、私たちの経験では 18 h は多様なフィットネスのライブラリを示すコロニー サイズの様々 なをもたらした。ただし、非常に減らされたフィットネスと共に植民地成長に時間がかかることがあります、したがってが表示されない後 18 時間。非常に減らされたフィットネスの複製を検索するこのメソッドを使用している場合は、インキュベーション時間が長くなると (すなわち、48 h、50-300 コロニー) の混雑を減らすためにプレートの少ない植民地が使用可能性があります。
このメソッドの追加の落とし穴がありますそれはカナマイシン耐性の既に受信者ひずみを使用することは不可能です。このハードルを克服するためにクロロアムフェニ コールの抵抗など、代替の選択可能なマーカーの pJA1 プラスミドのカナマイシン耐性マーカーを交換することがあります。、理論的には、アンピシリン耐性のある受信者のひずみを使用することは注目に値することもあります、、pJA1 としてアンピシリン抵抗性マーカーを含んでいるプラスミッドが転位の直後に失われます。
好みの遺伝的背景の緻密なトランスポゾン ライブラリの作成は、多くのダウン ストリーム アプリケーションで潜在的有利です。たとえば、スレオ レプリカ メッキ22を使用してを識別するか、感染1,2の確立で欠陥がある変異体を識別するためには、密なトランスポゾン ライブラリを使用できます。もっと最近、DNA シーケンシング コストを落としているし、次世代シーケンシングなどの新しい技術となっている平凡なトランスポゾン ライブラリで使用されている深い DNA シーケンシング遺伝子かんじん、遺伝子の働きに洞察力を得るためにおよび遺伝相互作用。これらのメソッドのいくつかは23で見直され、監督のトランスポゾンの挿入サイト シーケンス (TraDIS)、トランスポゾン配列 (Tn seq)、ディープ シーケンス (安打)、し挿入配列 (追跡高スループットの挿入などの方法があります。INSeq)。これらのすべてのダウン ストリーム メソッドは、密なトランスポゾン挿入ライブラリの構造に依存します。他のベクトルは、特定のダウン ストリーム メソッドの使用する必要があります、ここで説明されているプロトコルは従う手順要点の概要を示します。

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56216/creation-dense-transposon-insertion-library-using-bacterial">Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri</a>. The Discussion and References sections have been corrected.
The second paragraph in the Discussion section was updated from:
A significant benefit of this method is that, in theory, the user has wide latitude in the choice of enterobacterial recipient strains. This paper, as well as others11, use&#160;E. coli&#160;as a recipient strain, however the pJA1 plasmid has been used successfully with other enterobacterial recipient species such as&#160;Shigella flexneri6&#160;and&#160;Salmonella enterica&#160;serovar Typhimurium strain SL134410. Theoretically, the &#947; origin of replication (oriR6K&#947;) in pJA1 allows this plasmid to be maintained in a broad host range19, allowing that the recipient strain is&#160;pir+.&#160;Recently, new methods have been described that allow for construction of the&#160;pir+&#160;in a range of enterobacterial strains20, giving additional flexibility. Additionally, the300 base pair mob&#160;region from the RP4 plasmid in pJA1 allows conjugative transfer of this plasmid to a wide range of gram negative bacterial strains19. Simply put, this method could theoretically be used with a variety of recipient strains, as long as several conditions are met: the strain is&#160;pir+, and is marked with an antibiotic resistance other than kanamycin and other than the donor strain.
to:
A significant benefit of this method is that, in theory, the user has wide latitude in the choice of enterobacterial recipient strains. This paper, as well as others11, use&#160;E. coli&#160;as a recipient strain, however the pJA1 plasmid has been used successfully with other enterobacterial recipient species such as&#160;Shigella flexneri6&#160;and&#160;Salmonella enterica&#160;serovar Typhimurium strain SL134410. Theoretically, the &#947; origin of replication (oriR6K&#947;) in pJA1 allows this plasmid to be maintained in a broad host range19, allowing that the recipient strain is&#160;pir-.&#160;The&#160;300 base pair mob&#160;region from the RP4 plasmid in pJA1 allows conjugative transfer of this plasmid to a wide range of gram negative bacterial strains19. Simply put, this method could theoretically be used with a variety of recipient strains, as long as several conditions are met: the strain is&#160;pir-, and is marked with an antibiotic resistance other than kanamycin and other than the donor strain.
The References&#160;section was updated from:
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	<li>Jacobs, M. A., Alwood, A.,&#160;et al.&#160;Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.&#160;PNAS.&#160;100&#160;(24), 14339-14344 (2003).</li>
	<li>van Opijnen, T., &#38; Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms.&#160;Nature Rev Microbiol.&#160;11&#160;(7), 435-442 (2013).</li>
</ol>
to:
<ol start="18">
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	<li>Barrick, J. E., Yu, D. S.,&#160;et al.&#160;Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli.&#160;Nature.&#160;461&#160;(7268), 1243-1247 (2009).</li>
	<li>Jacobs, M. A., Alwood, A.,&#160;et al.&#160;Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.&#160;PNAS.&#160;100&#160;(24), 14339-14344 (2003).</li>
	<li>van Opijnen, T., &#38; Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms.&#160;Nature Rev Microbiol.&#160;11&#160;(7), 435-442 (2013).</li>
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An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56216/creation-dense-transposon-insertion-library-using-bacterial">Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri</a>.&#160;The Discussion and References sections have been corrected.

Erratum: Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

細菌性病原体1、2、病原性遺伝子の発見から必須遺伝子3,の研究に至るまで、アプリケーションのさまざまな役に細菌トランスポゾン変異ライブラリの作成4,5,6、遺伝的相互作用の同定には、7、8,9 をネットワークします。これらの研究に重要なは、変異体の大規模なライブラリを作成する能力です。トランスポゾン (短い断片 DNA のゲノムにランダムに挿入する) の使用は、関数または式、開いたリーディング ・ フレームまたは遺伝子の転写調節領域内でトランスポゾンの挿入は中断しばしば遺伝子機能を中断することの簡単な手段遺伝子。
プラスミド pJA110を使用して細菌の活用によるエシェリヒア属大腸菌またはs. 菌でトランスポゾン ライブラリの作成方法は、ここで説明しました。このプラスミドを使用する 2 つの主な利点があります。最初の利点は pJA1 プラスミドから表現 Tn10 トランスポザーゼのバリアント誘導性があり、低挿入バイアス11,12, トランスポゾンがゲノムに統合するランダムにことを意味するときイソプロピルΒ-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) は、メディアに追加されます。トランスポゾンには、受信者の株の染色体にトランスポゾン挿入変異体の選択できるカナマイシン耐性マーカーが含まれています。PJA1 プラスミドの 2 番目の利点は、レプリケーションの R6K 変異原点が含まれていることです。レプリケーションの R6K 変異起源13プラスミドの維持のための順序でラムダのpirの遺伝子が必要です。プラスミッドをpir -系統でレプリケートできませんとは、受信者の負担 (図 1) で失われます。これにより Tn10 トランスポザーゼがセルから削除されます、アクティブ、初期転位イベント後さらに突然変異を減らすにはや。
ドナーの負担から受信者のひずみに pJA1 プラスミドを移動する細菌の活用の使用は、いくつかの理由のため有利です。抱合はシンプルで安価を実行して、遺伝子導入装置などの特別な機器を必要としません。さらに、細菌の活用高効率は、非常に大規模なライブラリ (&#62; 2 × 105ユニークな挿入) 一晩培養6のわずか数ミリリットル (mL) を達成します。プロセスには、約 2 時間の孵化のため時間とともに実践的な時間と菌の増殖がかかります。ラングリッジら14サイズのトランスポゾン変異ライブラリのような作成する 130 electroporations の実行を報告はここで説明8単一接合を実現します。130 electroporations の使用は、electrocompetent セルの労働集約的な時間のかかる準備と消耗品だけでの以上 $1,000 ドルのコストで多くの高価な材料 (例えば、エレクトロポレーション キュヴェット) の使用に必要です。10その他の研究は、同様のメソッドを使用しているが、異なる菌株と達成までライブラリ (5 × 104コロニー形成単位) よりも小さなサイズはここで報告されます。
ドナーひずみに関するノート: ここで使用されるドナーひずみは大腸菌の菌株 BW2076715 pJA1 トランスポゾン プラスミド16を含みます。ひずみ BW20767 は、pJA1 プラスミドの伝達を効率的に作成他系統に共役することができます。また、重要なは、BW20767 はラムダpir +.前述したように、プラスミド pJA1、ラムダpir遺伝子を含んでいる系統で維持することができるのみ。この株は、カナマイシン、アンピシリン耐性。PJA1 プラスミドはアンピシリン抵抗性マーカーを含み、トランスポゾン内カナマイシン耐性マーカーにあります。この株は、100 μ g/mL にアンピシリンを使用してプラスミッドの選択で栽培されています。それはまた恒常発現トランスポザーゼの遺伝子の他の系統が安定するため知られていることは注目に値するとトランスポザーゼ使用中ここは下誘導制御、漏れやすい表現の低リスクが残っています。このため、このひずみの通路を最小限にし各の新しいライブラリの準備のため冷凍文化から新鮮なストリークをすべきであることをお勧めします。ここで使用されるドナー株はリクエストに応じて研究室から入手可能です。
受信者ひずみに関するノート: 受信者のひずみは、ラボの K12 由来大腸菌の系統や系統のS.flexneri (また、議論を参照) などの任意のひずみをすることができます.受信者のひずみがカナマイシン抵抗がない追加の抗生物質耐性マーカーに対して選択できるドナーの負担が必要です。受信者のひずみ大腸菌 MG1655が導入された自発的なナリジクス酸突然変異とここで使用されます。ナリジクス酸の自然突然変異は、30 μ G/ml でナリジクス酸を含むプレートの上に 200 μ L 因数で一晩かけて培養の 2 mL をめっきによって選ばれました。MG1655 の単一のクローンは、受信者の負担になるナリジクス酸に耐性が選ばれました。さらに、前述のよう、受信者のひずみのラムダpir 、否定的な必要があります。
概要: 細菌の活用が行われると pJA1 プラスミドは受信者のひずみにドナーの負担から移動して、メディアに IPTG の添加を誘発する IPTG 誘導の制御下にあるtnp遺伝子の発現lacIq/Ptac プロモーター (図 1)。PJA1 tnp遺伝子はホット スポット6,10,11の挿入の低い周波数を持つ変異トランスポザーゼ。また、IPTG 誘導トランスポゾンが活性化、ゲノムに挿入されたランダムに。プラスミッドはラムダの pir 受信者負担を確保できない、失われます。

<table><tbody><tr><td>0.45ミクロンのニトロセルロースフィルター(滅菌)</td><td>ミリポア</td><td>HAWP02500</td><td>あるいは、あぶらとり紙(下記参照)を使用することができます~</td></tr><tr><td>1インチの円にカットされた吸い取り紙を、その後、ホイルでオートクレーブ/滅菌します。ニトロセルロースフィルターまたはあぶらとり紙GEライフサイエンス間の効率に違いはありません</td><td>:製品グレード3MMチャーブロッティングペーパー、シート、46 &times; 57 cm</td><td>3030-917</td><td>あるいはニトロセルロースフィルターを使用することができます(上記)</td></tr><tr><td>金属鉗子、滅菌</td><td>VWR /グローバルサイエンスニュージーランド</td><td>MURRE009/01</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿、滅菌、直径90 mm、容量68 mL、&nbsp;12.5mLの作業量。</td><td>Interlab New Zealand</td><td>2303-1090</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ガラススプレッダー</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>NZNZSPREADER</td><td>あるいは、滅菌ガラスビーズを使用して、培養をプレートに広げることができます（下記に記載）滅菌</td></tr><tr><td>ガラスビーズ</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>HERE1080603</td><td>あるいは、滅菌ガラススプレッダーを使用して、培養物をプレートに広げることができます（上記に記載)</td></tr><tr><td>ナリジク酸(オプション)</td><td>GoldBio.com</td><td>N-015-250</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリンナトリウム塩 BioChemica</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>APLIA0839.0025</td><td>メーカーの推奨に従って調製</td></tr><tr><td>カナマイシン硫酸 BioChemica</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>APLIA1493.0010</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (イソプロピル &beta;-D-1-チオガラクトピラノシド)&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー ニュージーランド</td><td>FMTR0393</td><td></td></tr><tr><td>ディフコ寒天粒</td><td>フォート リチャード ラボラトリーズ/インターラボ ニュージーランド</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>ルリア ブロス ベース (ミラーズ LB ブロス ベース)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>12795-084</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール二蒸留 99,5 %</td><td>VWR/グローバル サイエンス</td><td>ニュージーランド VWRC24388.320</td><td></td></tr><tr><td>15 ml ポリプロペレン滅菌円錐形バイアル&nbsp;</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>CORN430791</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ、フラットキャップ、1.7ml、超透明PP、目盛り付き、オートクレーブ可能、冷凍可能</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>AXYGMCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>50ml 遠心分離チューブ、ファルコン、PP、円錐形、印刷目盛り、フラットスクリューキャップ付き、滅菌済み</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>BDAA352070</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator at 37C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoclave for sterilizing media&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

密なトランスポゾン挿入ライブラリを使用して細菌活用腸内細菌系統など、大腸菌や赤痢菌の作成

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

トランスポゾン変異は、トランスポゾンと呼ばれる DNA の一部のランダムなゲノム挿入を介して遺伝子破壊を可能にする方法です。以下のプロトコルは、カナマイシン耐性マーカーを含むトランスポゾンを有するプラスミドの菌株間の高効率転送の方法をについて説明します。プラスミド媒介トランスポザーゼは、非常に低い挿入バイアスを持つ受信者株のゲノムのトランスポゾンの挿入するバリアントtnp遺伝子によってエンコードされます。このメソッドは、このように細菌エシェリヒア属大腸菌や赤痢菌の受信者の緊張でユニークなゲノム位置にトランスポゾンが挿入されて大規模な変異ライブラリの作成をできます。エレクトロポレーションや化学的変化など他の方法ではなく、細菌の活用を使用してユニークなクローンの数千人の何百もの大規模なライブラリを作成できます。これは非必須遺伝子のすべての 4-6 塩基として頻繁に発生する挿入と高密度挿入ライブラリを生成します。このメソッドは、密なトランスポゾン挿入ライブラリを作成するための安価な使いやすい、高効率法の他の方法より優れています。トランスポゾン遺伝子相互作用ネットワークを推測する (テネシー州-Seq) をシーケンスなどのダウン ストリーム アプリケーションでまたはもっと単に、突然変異で、トランスポゾン ライブラリを使用することができます (前方遺伝) 画面。

成長の 18 時間後のプレートはコロニー サイズの様々 な多くの植民地を含める必要があります(図 3)。異なるコロニー サイズさまざまなフィットネスのクローンを示すで、プロトコルが働いている良い兆候です。皿の上は成長ドナーとレシピエントのコントロール必要がありますありません。上記のプロトコルを使用すると、優に 2 x 10 の5のコロニー形成単位 (CFU) 得られるはず。一度に 5 複製活用するプロトコルをスケール アップ約 1 × 106 CFU をもたらす必要があります。前作、次世代シーケンシングによる分析が示されたこのようなスケール アップ ライブラリが得られる &#62; 2 × 105ユニークな挿入6。非常に高い CFU (すなわち1 x 106 CFU) でユニークな挿入の比率は、すべての利用可能な (非致命的な) 挿入になる表される高原、する予定です。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56216/56216fig1.jpg"> 
図 1: 細菌の活用と染色体にトランスポゾンの挿入のスケマティック。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56216/56216fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56216/56216fig2.jpg"> 
図 2: LB 媒体に水没してボルテックスの前後のフィルターのイメージ。ボルテックス前、に細胞はフィルターに立ち往生しているし、メディアが明確。ボルテックス後、としてセル フィルターから、メディアは、メディアが曇りになります。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56216/56216fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56216/56216fig3.jpg"> 
図 3: (A) トランスポゾン ライブラリ成長の 18 時間後の代表的な板。(B) コロニー サイズのクローズ アップ。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56216/56216fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

ここに提示は、大腸菌や赤痢菌細菌の活用を使用して高密度トランスポゾン挿入ライブラリを作成するための簡単な方法です。このプロトコルは、トランスポゾンのランダムなゲノム挿入による細菌のユニークな突然変異体の何千もの何百ものコレクションの作成をできます。

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

本実験手順の目的は、細菌接合を用いてEscherichia coliまたはShigella flexneriにおいて高密度のトランスポゾン挿入ライブラリを作成することです。この手法により、Tn10トランスポゾンのランダムなゲノム挿入を通じて、数十万個のユニークな細菌変異株を作成することが可能になります。本手法の主な利点は、トランスポゾンを保持するプラスミドの導入を、エレクトロポレーションなどの効率の低い他の手法ではなく、細菌接合によって行う点にあります。さらに、Tn10トランスポゾン自体は、他のトランスポゾンよりも偏りの少ない状態でゲノムに挿入されます。無菌操作を用いて、ドナー株のオーバーナイト培養液1 mLを滅菌済みエッペンドルフチューブに加えます。チューブには、例えばドナーを示す「D」などのラベルを貼付してください。受容菌株についても同様に、1 mLのオーバーナイト培養液を滅菌済みエッペンドルフチューブに移します。このとき、受容菌を意味する「R」などのラベルを貼ってください。両方のチューブを室温で14,000 ×gにて1分間遠心分離します。これはベンチトップ遠心機で行うことができます。遠心分離を行っている間に、結合用のフィルターを準備します。滅菌済みのピンセットを使用して、抗生物質を含まないラベル付きのLB寒天プレートの上にニトロセルロースフィルターを配置します。あるいは、ニトロセルロースフィルターの代わりに、滅菌済みのブロッティングペーパーを使用することもできます。コンタミネーションを最小限に抑えるため、各フィルターを個別のLBアガープレート上に配置してください。各フィルターが、適切にラベル付けされたLBアガープレート上に配置されていることを確認してください。フィルターを1枚ずつ含めたプレートを3枚作製します。それぞれドナー株用、レシピエント株用、およびライブラリー用に用意します。遠心分離機の運転が終了したら、オーバーナイト培養物を取り出します。エッペンドルフチューブから抗生物質を含む増殖培地をすべて取り除き、廃棄します。細菌細胞のペレットを壊したり乱したりしないよう注意しながら、増殖培地をすべて取り除くようにしてください。必ず無菌的に操作を行い、サンプルごとにチップを交換してください。各エッペンドルフチューブに、抗生物質を含まない新鮮なLB培地を110 µL加え、ピペッティングして培養物を再懸濁します。必ず無菌的に操作してください。細胞の凝集塊が残らないよう、数回ピペッティングを行います。このステップは、細菌培養液を濃縮し、オーバーナイト培養で残った抗生物質を除去するために行います。ピペットを使用して、濃縮したドナー培養液50 µLを「Donor」と記されたフィルター上に滴下します。50 µLをフィルターにゆっくりと1滴ずつ加えてください。受容菌株についても同様に、再懸濁した培養液50 µLを、受容菌のフィルター上に滴下するように加えてください。接合を起こさせるため、受容菌株と供与菌株の両方を同じフィルターペーパーに添加し、物理的に密接に接触させます。この操作を行うために、「library」と表記されたプレート上の同一フィルターに、供与菌株と受容菌株をそれぞれ50 µLずつ添加してください。フィルターを含むこれらの寒天プレートを37°Cで6時間培養します。接合プロセスは37°Cで6時間にわたって進行します。接合中、pJA1プラスミドがレシピエント株へと移動します。接合後、ボルテックスを用いてフィルターから細菌を遊離させ、1 mMのIPTGで誘導します。IPTGによりトランスポゼースが誘導され、カナマイシン耐性遺伝子を含むトランスポゾンが、レシピエント株のゲノムにランダムに挿入されます。その後、カナマイシンと別の抗生物質を含むLB寒天培地に細菌を塗布し、トランスポゾンを保持するレシピエント株を選択します。レシピエント株はLambda pir陰性であるため、pJA1プラスミドは脱落します。37 °Cで6時間培養した後、接合が完了します。フィルターを載せたプレートをインキュベーターから取り出してください。滅菌済みのピンセットを使用して、LB寒天プレートから陰性ドナーコントロールを含むフィルターを取り出します。チューブを軽く叩いてフィルターペーパーを円錐形バイアルの底に沈め、フィルターがLB培地に完全に浸かっていることを確認します。このチューブには、最終濃度1 mMのIPTGを含むLB培地が2 mL入っています。チューブを1分間ボルテックスし、ニトロセルロースフィルターから細菌を遊離させます。LB培地が細菌細胞によって混濁した状態になります。レシピエントコントロールおよびライブラリーについても同様に繰り返します。細菌細胞を含むフィルターを十分にボルテックスして、フィルターから細菌を遊離させた後、細菌細胞を選択培地に塗布します。このステップでは、カナマイシンとナリジクス酸などの別の抗生物質を含むLB寒天プレートに細菌を塗布します。カナマイシンは、カナマイシン耐性マーカーを含むトランスポゾンがゲノムに正常に組み込まれたレシピエント細胞を選択するために使用されます。ゲノムにマーカーが組み込まれていない受容細胞は、ネガティブセレクションによって除外されます。ドナー株を除外するために、ナリジクス酸などの別の抗生物質が使用されます。ここで使用するドナー株はナリジクス酸に感受性がありますが、受容株はナリジクス酸に耐性を持っています。2剤目の抗生物質を用いることで、ドナー株を除去することが可能です。この段階で、コロニーが十分に分散して多数形成されるライブラリの希釈倍率を決定するために、いくつかの希釈系列をプレートに播種してください。トランスポゾンライブラリを含むすべてのプレートのコロニー数を計数し記録した後、ライブラリを1本のチューブにプールまたは統合させたい場合があるでしょう。これは滅菌済みのスプレッダーを用いて行うことができます。トランスポゾンライブラリーを含むLB寒天プレートに、LB培地を1 mL加えます。プレートに培地を加えた後、滅菌済みのスプレッダーを用いて、プレートから細菌を掻き取り、分散させます。プレートからすべての細菌を回収することは、多くの場合困難です。細菌懸濁液を取り除き、50 mLまたは15 mLの円錐チューブに移します。すべてのプレートでこの操作を繰り返します。すべてのプレートの掻き取りが完了したら、プールした細菌懸濁液を1分間完全にボルテックスし、細胞の凝集を解消させます。これで、プールされたライブラリが完成します。37°Cで18時間培養した後、ドナーおよびレシピエントのコントロールプレートに菌の増殖が見られないことを確認してください。変異体ライブラリを含むプレートには、理想的には様々なサイズのコロニーが多く含まれています。コロニーのサイズが異なることは、クローンのフィットネスが多様であることを示しており、プロトコルが正常に機能した良い兆候となります。細菌において高密度のトランスポゾン変異導入ライブラリを構築することは、病原性遺伝子や病原細菌の発見から、必須遺伝子の研究、遺伝的相互作用ネットワークの特定に至るまで、多くの下流アプリケーションにとって潜在的に有利です。これらのダウンストリームアプリケーションはすべて、高密度のトランスポゾン挿入ライブラリの構築に依存しています。本手法では、E coliやShigella flexneriなどの腸内細菌科菌株において、極めて高密度のトランスポゾンライブラリを作成するための、簡便かつ迅速で低コストな手順を提供します。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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これは、 バークホルデリア 有益な共生者における候補昆虫コロニー形成因子を同定するための適応的方法である。このカブトムシ宿主はトランスポゾン変異生成を介して生成されたランダム変異体ライブラリーに感染し、コロニー形成後のライブラリーの複雑さは 、インビトロで増殖した対照と比較される。...

ラグリア・ビロサ・カブトムシのバークホルデリア・グラディオリ・シンビエントにおける細菌コロニー形成因子を解明するためのツールとしてのトランスポゾン挿入シーケンシング

学ぶ細菌接合法を用いた高密度トランスポゾン挿入ライブラリ作成法。Escherichia coliやShigella flexneriで数十万の独自変異体を効率的に生成し、遺伝子機能解析やTn-Seqなどの下流応用に活用できます。

密なトランスポゾン挿入ライブラリを使用して細菌活用腸内細菌系統など、大腸菌や赤痢菌の作成

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