密なトランスポゾン挿入ライブラリを使用して細菌活用腸内細菌系統など、大腸菌や赤痢菌の作成

この実験手順の全体的な目標は、細菌の結合を使用して、大腸菌または赤痢菌に高密度のトランスポゾン挿入ライブラリを作成することです。この技術により、Tn10トランスポゾンのランダムなゲノム挿入により、数十万のユニークな細菌変異体を作成することができます。この技術の主な利点は、トランスポゾンを抱くプラズマの移動が、エレクトロポレーションなどの他の効率の低い方法ではなく、細菌の結合を介して行われることです。

さらに、Tn10トランスポゾン自体は、他のトランスポゾンよりもバイアスが少なくゲノムに挿入されます。滅菌技術を使用して、ドナー株の1ミリリットルの一晩培養物を滅菌エッペンドルフチューブに加えます。チューブには、たとえばドナーのDのラベルを付ける必要があります。

レシピエント株についても同じことを行い、レシピエント株の1ミリリットルの一晩培養物を滅菌エッペンドルフチューブに移します。繰り返しになりますが、たとえば、受信者の場合は R でラベル付けされます。両方のチューブを室温でGの14,000倍で1分間遠心分離します。

これは、卓上型遠心分離機で行うことができます。遠心分離機が稼働している間に、結合用のフィルターを準備します。滅菌鉗子を使用して、抗生物質を含まない標識LB寒天プレートにニトロセルロースフィルターを配置します。

あるいは、ニトロセルロースフィルターの代わりに、滅菌ブロッティングペーパーを使用してもよい。コンタミネーションを最小限に抑えるために、各フィルターを別々のLB寒天プレートに置きます。各フィルターが、適切にラベル付けされたLB寒天プレートに配置されていることを確認してください。

プレートを3枚作り、それぞれにフィルターを入れます。1つはドナー株用、1つはレシピエント株用、もう1つはライブラリー用です。遠心分離機が終了したら、一晩培養物を取り出します。

抗生物質を含むすべての増殖培地をエッペンドルフチューブから取り出し、廃棄します。細菌細胞パレットを乱したり乱したりしないように注意してくださいが、すべての増殖培地を取り除くようにしてください。無菌的に作業し、各サンプル間でチップを交換するようにしてください。

各エッペンドルフチューブに、抗生物質を含まない110マイクロリットルの新鮮なLB培地を追加し、ピペットで上下させて培養液を再懸濁します。無菌的に作業するようにしてください。ピペッティングを数回繰り返して、細胞の塊が残らないようにします。

このステップは、細菌培養物を濃縮し、一晩培養物から残った抗生物質を除去するために行われます。ピペットを使用して、濃縮ドナー培養物の50マイクロリットルをドナーとラベル付けされたフィルターに置きます。50マイクロリットルをゆっくりとフィルターに滴下します。

再懸濁された培養物の50マイクロリットルを添加するレシピエント株についても同じことを行い、濃縮された再懸濁された培養物をレシピエントフィルターに滴賢く加えます。結合が起こるためには、レシピエント株とドナー株の両方を同じ濾紙に添加して、物理的に密接に接触させます。これを行うには、ドナー株とレシピエント株の両方の50マイクロリットルを、ライブラリとラベル付けされたプレート上の同じフィルターに加えます。

フィルターが入ったこれらの寒天プレートを37度で6時間置きます。抱合のプロセスは、摂氏37度で6時間以上にわたって行われます。標識中、pJA1プラスミンはレシピエント株に移動します。

結合後、細菌はボルテックスによってフィルターから解離し、1ミリモルのIPTGで誘導されます。IPTGはトランスポゼースを誘導し、カナマイシン耐性の遺伝子を含むトランスポゾンがレシピエント株のゲノムにランダムに挿入されます。細菌は、カナマイシンと別の抗生物質を含むLB寒天プレートに播種され、トランスポゾンを含むレシピエント株に選択します。

レシピエント株はLambda pir陰性であるため、pJA1プラスミンは失われます。摂氏37度で6時間成長した後、結合が完了します。フィルターが入ったプレートをインキュベーターから取り出します。

滅菌鉗子を使用して、ネガティブドナーコントロールを含むフィルターをLB寒天プレートから取り外します。チューブを軽くたたいて濾紙を円錐形バイアルの底に戻し、フィルターがLBメディアに完全に浸されていることを確認します。このチューブには、IPTGを含む2ミリリットルのLB媒体と1ミリモルの最終濃度が含まれています。

チューブを1分間ボルテックスして、バクテリアをニトロセルロースフィルターから分離します。LB培地は細菌細胞で濁るはずです。受信者制御とライブラリについても、これを繰り返します。

細菌細胞を含むフィルターを徹底的にボルテックスして細菌をフィルターから分離した後、細菌細胞を選択した培地に播種します。このステップでは、細菌をカナマイシンとナリジクス酸などの別の抗生物質を含むLB寒天プレートに播種します。カナマイシンは、カナマイシン耐性マーカーを含むトランスポゾンがゲノムにうまく組み込まれているレシピエント細胞を選択するために使用されます。

マーカーがゲノムに組み込まれていないレシピエント細胞が選択されます。ナリジクス酸などの別の抗生物質は、ドナー株に対して選択するために使用されます。ここで使用されるドナー株はナリジクス酸に感受性であり、レシピエント株はナリジクス酸に耐性があります。

この2つ目の抗生物質を用いることで、ドナー株を除去することが可能です。このステップでは、いくつかの希釈液を播種して、適切な間隔で多数のコロニーを生成するライブラリーの希釈を決定する必要があります。トランスポゾンライブラリーを含むすべてのプレート上のコロニー数をカウントして記録した後、一部のユーザーはライブラリーを1つのチューブにプールまたは結合したいと思うかもしれません。

これは、滅菌スプレッダーを使用して行うことができます。トランスポゾンライブラリーを含むLB寒天プレートに1ミリリットルのLB培地を加えます。培地をプレートに加えたら、滅菌スプレッダーを使用してプレートから細菌をこすり落とし、分離します。

多くの場合、プレートからすべての細菌を取り除くことは不可能です。細菌懸濁液を取り除き、50ミルまたは15ミルの円錐形のバイルに入れます。これをすべてのプレートで繰り返します。

すべてのプレートを掻き取りたら、プールされた細菌懸濁液を1分間ボルテックスして、細胞の塊を分解します。これがプールされたライブラリを構成しています。37°Cで18時間成長した後、ドナーまたはレシピエントのコントロールプレートに成長があってはなりません。

変異体ライブラリーを含むプレートは、理想的には、さまざまなサイズの多くのコロニーを含んでいます。コロニーサイズが異なると、適応度が異なるクローンが示されており、プロトコルが機能していることを示す良い兆候です。細菌における高密度トランスポゾン突然変異導入ライブラリーの作製は、病原性遺伝子や細菌病原体の発見から必須遺伝子の研究、遺伝的相互作用ネットワークの同定まで、多くのダウンストリームアプリケーションにとって有利な可能性があります。

これらのダウンストリームアプリケーションはすべて、高密度のトランスポゾン挿入ライブラリの構築に依存しています。ここで紹介する方法は、大腸菌や赤痢菌などの腸内細菌株で非常に高密度なトランスポゾンライブラリーを作製するための、簡単、迅速、安価な手順を提供します。