Name: S の酵母酵母の低酸素応答中に時間をかけての mRNA のレベルを測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学ぶRNA-seqを用いてSaccharomyces cerevisiaeの低酸素応答におけるmRNAレベルの時間変化を測定する方法。このプロトコルは細胞応答における遺伝子発現動態の研究に応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

技術的な助言および RNA ライブラリの準備とシーケンス プリンストン大学統合ゲノミクス シーケンス中核施設、ルイス Sigler 研究所に感謝しますこの作品は、ローワン大学と NIH 日の出 R15GM113187 からの M.J.H. に補助金によって支えられました。

1. 低酸素血症を誘発します。
<ol><li>低酸素状態の時間経過前に 1 日以上: インキュベーターを準備、携帯フィルタ リング システム、真空、ガスのタンク、フラスコ、ストッパー、ガラス管、管材料表のように。</li>
	<li>細胞の迅速な処理を有効にする、近くに N2槽、インキュベーター、真空およびフィルタ リング システムを配置します。</li>
	<li>ガラス瓶とオートクレーブ内のコンポーネントを混合することによって滅菌液体 YPD 培 (1% 酵母エキス、ペプトン 2%、2% グルコース) を準備します。</li>
	<li>インキュベーターでフラスコのレイアウトを計画します。 注: N2タンクから最初フラスコが水トラップ、2 番目のフラスコは最後の時間ポイントになります、第 3 フラスコなります最後から 2 番目の時点に最終的な水のトラップである最後のフラスコまで。図 1は、フラスコの間の順序と接続を示します。</li>
	<li>時間コース前日は、5 mL の液体 YPD 滅菌試験管内での培養に酵母コロニーを接種します。具体的には、滅菌アプリケータ スティックを用いた平板からの完全植民地をピックアップします。液体 YPD に棒を置き、細胞の大部分が懸濁液になるまで棒を振る。</li>
	<li>30 ° c 一晩 (~ 16 h) チューブを回転させます。 注: 16 時間後野生型細胞は飽和 (~ 108セル/mL x 2)、非常に曇りの文化によって示されるを実現します。他の系統は飽和に到達する時間がかかることがあり、ステップ 1.9.4 に示すように、分光光度計での細胞濃度の測定によるテスト必要があります。</li>
	<li>時間経過の日、16 時間、飽和させた文化を希薄化後 1:50 の 4 ml に 5 mL のピペットを使用して一晩で文化 196 mL 滅菌 500 mL フラスコ内の液体 YPD に。30 ° C で 4 時間 〜 200 rpm で振とうしながら成長します。 注: 1 〜 2 × 107セル/mL の中間ログ濃度がなる可能性があります野生型文化 4 時間後としていること。</li>
	<li>4 時間培養中のラベル (低酸素と水のトラップ) をフラスコと 50 mL 採血管。低酸素状態の時間のコースの上記のステップ 1.7 でインキュベーターを使用しない場合他のインキュベーターをオンにし、30 ° C に設定</li>
	<li>
低酸素細胞の服従: 直前
	<ol>
<li>水トラップとなる滅菌 250 mL フラスコ 2 〜 50 mL の水を追加します。</li>
		<li>1を埋める/氷3液体窒素でバケットし、50 mL 遠沈管を保持するために発泡スチロール ラックが水没します。</li>
		<li>細胞を収集するためのフィルター システムを設定します。滅菌フィルター ディスク フィルター ディスクの端にのみ接触に注意しながら滅菌ピンセットを使用してろ過システムの下の単位を追加します。フィルタ ユニットの下にフィルターのトップ ユニットを置き、システムに付属のクランプで固定します。タイトなシール、漏れ無し、上部と下部のユニットが並んでいることを確認します。</li>
		<li>分光光度計での細胞濃度を測定します。分光光度計-~0.2 - 分光光度計によって 0.6 間 OD600の線形の範囲で測定することができますので、細胞を希釈します。 注: 1 OD600単位は細胞の形態や分光光度計によって 107セル/mL、x ~ 3。~0.33 - 0.66 の OD600に対応する 1 〜 2 × 107セル/mL の濃度が予想されます。</li>
		<li>
時間 0 サンプルを迅速に取得します。
		<ol>
<li>真空チューブと 1,000 mL フラスコ トラップを介して強力な (~ 10 mbar) 真空フィルター システムを接続します。真空をオンにします。トップ ユニットに文化 (通常 〜 20 mL) を注ぎ、フィルターを通して引っ張られる液体を待つ (~ 10 秒、真空の強度によって)。</li>
			<li>慎重にきれいなピンセットでフィルター ディスクを削除し、50 mL の遠心管に配置します。すぐに液体窒素に浸漬ラックに遠心管を配置します。重要なは、行う前冷えていないチューブ チューブが爆発するようにフィルターを挿入する前に。</li>
			<li>後 > 30 s、場所後の RNA 抽出-80 ° C のフリーザーに挿入するチューブ。各濾過後掃除、フィルター システムを組み立て直します。10 水を引いてシステムを洗浄フィルター ディスクなし s。最後に、システムをワイプ乾燥ペーパー タオルで。</li>
		</ol>
</li>
		<li>各フラスコ低酸素症の示された時点で中間ログ濃度 (1 〜 2 × 107セル/mL) に達すると、さまざまな時点の異なるフラスコに 4 h 文化を希釈します。 注意: 表 1 に示します希釈野生型 S288C HAP1+の半数体系統で使用されました。これらの低酸素培養条件で各ひずみをテストし、それに応じて希釈を調整することをお勧めします。</li>
		<li>フラスコに電池とメディアを追加すると、挿入された 2 つのガラス管を含んでいるストッパーを開くフラスコをカバーするアルミ箔を取り付けます。</li>
		<li>以前決定レイアウトのインキュベーターに、フラスコを配置します。</li>
		<li>図 1に示すように、しっかりとチューブを接続します。</li>
		<li>すべてのストッパーがフラスコの開口部にしっかりとプッシュすることを確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>0 時に、レギュレータ バルブを開きます。流量計を 3 L/分に設定します。 注: バブル観測される両方の水筒に適切なガスの流れを示します。そうでない場合は、すべてストッパーが締まっているとチューブが正しく接続されていることを確認します。</li>
	<li>インキュベーターを閉じて ~ 200 rpm に揺れのスピードを設定します。タイマーを起動します。</li>
	<li>各時間ポイントの前に記述する上 1.9.3 の手順でフィルター システムのセットアップします。</li>
	<li>
各時点で (例えば5 分、10 分のなど)、2 人の細胞のように迅速に処理があります。
	<ol>
<li>一人称: ホルダーから適切なフラスコを外し、(接続されているガラス管) とストッパーを取る。 注: これは残りの培養フラスコを N2の流れを中断されませんが、最後の水トラップに一時的に流れが壊れます。</li>
		<li>二人目: 文化の 1 mL をピペットで移しなさいキュベットに分配し、。最後の水トラップ (1 つの管と 1 つのストッパーがプロセスで削除される) の行の末尾に今培養用フラスコからチューブを接続し直します。1.9.4 の手順で前述、キュベット、細胞濃度を測定します。</li>
		<li>一人称: 文化の残りの部分を注ぎ真空ろ過システム、フィルタ リングと 1.9.5 の手順で上記のように凍結を行います。</li>
	</ol>
</li>
	<li>すべての時間のポイントを完了したら、N2ガスをオフします。レギュレータを閉じてし、解放するために圧力を待つ、流量計の電源を切ります。最後に、システムを分解して水とし、70% エタノールですべての材料を掃除します。</li>
</ol>2. RNA の抽出
<ol><li>材料表のとおり列の RNA の浄化の RLT バッファーを準備します。</li>
	<li>サンプルごとにバッファー RDD の 70 μ L に DNase ストック溶液 10 μ L を追加して DNase の実用的なソリューションを準備 (材料表を参照してください)。</li>
	<li>フィルターと-80 ° C のフリーザーからの細胞を含む 50 mL チューブを取り外し、氷上 (~ 15 分) を解凍します。氷のチューブで次の手順を実行します。</li>
	<li>2 mL スクリュー キャップ チューブにラベルを付けるし、氷、サンプルごとに 1 つの管の上に置きます。酸洗浄したビーズの ~0.6 mL をスクープし、ビーズを測定する 1.5 mL 遠心管を使用して、各チューブに追加します。</li>
	<li>50 mL チューブに 0.6 mL の冷たい RLT バッファーを追加します。</li>
	<li>フィルターからセルを削除し、ソリューションに中断を上下にピペットで移しなさい。ソリューションにソリューションを浸すフィルターのままフィルターをさせることを避けます。すべてのソリューションを削除する管の壁に対してフィルターを圧迫するピペット先端部を使用してフィルターに吸収されます。</li>
	<li>ビーズを含むスクリュー キャップ チューブに 50 mL のチューブから液体のすべてを転送します。</li>
	<li>ビーズ工場ホモジナイザーにスクリュー キャップ チューブを置き、1 つ分を実行します。 すぐに 3 分間氷の上管を配置します。もう一度、ホモジナイザーに管を配置し、1 つ分の実行します。</li>
	<li>ホモジナイザーと 5 分間氷の上場所からチューブを取り外します。ビーズは、チューブの底に解決します。</li>
	<li>室温での手順の残りの部分を実行します。</li>
	<li>ピペットを使い、転送のみ、ライセート (~ 350 μ L)、新しい 1.5 mL 遠心チューブに、ビーズを回避します。</li>
	<li>最大速度と新しい 1.5 mL 遠心チューブにし、転送上清で 2 分間遠心します。</li>
	<li>(200 証拠分子生物学グレード エタノール製) 70% のエタノールの 1 ボリュームを追加します。ピペッティングでよく混ぜます。</li>
	<li>ソリューションといずれか転送 2 mL コレクション チューブ内に配置されている RNA 列に沈殿物。</li>
	<li>(管内液体) 15 ≥12 で s、000 x gの流れを破棄に遠心分離します。</li>
	<li>バッファー RW1 の 350 μ L を列に追加します。15 ≥12 で s、000 x g の流れを破棄に遠心します。</li>
	<li>80 μ L を追加 DNase 私列膜にインキュベーション ミックス (管の両側は得ること) と 15 分間座ることができます。</li>
	<li>バッファー RW1 の 350 μ L を列に追加します。15 ≥12 で s、000 x gの流れを破棄に遠心。</li>
	<li>バッファー RPE の 500 μ L を列に追加します。15 の ≥12 で s, 000 x gと破棄の遠心流れを介して。</li>
	<li>バッファー RPE の 500 μ L を列に追加します。≥12, 000 x gで 2 分間遠心します。</li>
	<li>慎重に列を削除し、新しい 2 mL 管に配置します。(完全に乾燥膜) にフルスピードで 1 分間遠心</li>
	<li>コレクション チューブを破棄し、1.5 mL 遠心チューブに列を配置します。列膜に RNase フリーの水の 30 μ L を追加します。</li>
	<li>≥12, 000 × gで 1 分の microcentrifuging で列からの RNA を溶出します。遠心に列を読み込み、コレクション チューブの蓋に打ち切る蓋を防ぐために、遠心分離機の回転方向に直面していることを確認します。</li>
	<li>同じ遠心チューブに列を維持しながら列膜に RNase フリー水の別の 30 μ L を追加します。</li>
	<li>≥12, 000 x gで 1 分間遠心して最終的な溶出量が 60 μ L。</li>
	<li>-80 ° C のフリーザーで RNA の 60 μ L を含む各 1.5 mL チューブを格納します。</li>
</ol>3. RNA 濃度と品質を決定します。
<ol><li>材料表の (a) 蛍光光度計、(b) DNA および RNA 固有蛍光染料 (c) アッセイ チューブを使用して、各 RNA サンプルの RNA と DNA の濃度を測定します。染料、蛍光光度計の指示に従います。</li>
	<li>また、260 セット紫外線分光光度計と核酸濃度を測定 nm。 注: 1.0 A260読書 〜 40 μ g/mL 一本鎖 RNA と同等です。</li>
	<li>商業核酸・ アナライザーの RNA を実行することにより RNA の品質をテスト (材料表参照) または標準的なホルムアルデヒド/agarose のゲルの26。</li>
</ol>4. RNA シーケンス解析
<ol><li>総 RNA の在庫から 21 μ 100 ng/μ L の RNA の RNase フリー水を補います。この 21 μ L の 1 μ L を使用すると、上記の RNA 濃度をテストします。提出する mRNA の濃縮のため外部シーケンス拠点、ストランド固有のライブラリ (に多重化するための 8 つ以上のバーコード) 準備に残り 20 μ L (2 μ g) 総 RNA シーケンス (材料表を参照してください)。また、ローカルで実行する mRNA の濃縮とライブラリの準備し送信シーケンス処理用ライブラリ。</li>
	<li>8 つ以上の多重サンプルと次世代シーケンサーの 1 車線のシーケンスをプールします。</li>
	<li>シーケンス リードをすべて含む FASTQ ファイルをダウンロードし、対応するインデックスを読み取ります。また、多重のバーコードを含むテキスト ファイルをダウンロードします。 注: インデックス読み取りが別の FASTQ ファイルに現在あります。1 つのディレクトリにすべてのこれらのファイルを配置します。</li>
	<li>ここで、"fastq_pipeline.sh"と同じディレクトリに提供されているシェル スクリプトを配置します。このスクリプトに応じて、実験およびコンピューター ディレクトリを編集します。 注: このスクリプトには、手順を説明する広範なコメントが含まれています。簡単に言えば、スクリプト品質は読み取りをトリム、読み取りをゲノムにマップし、各サンプルの遺伝子あたりの読み取り数を含むタブ区切りのファイルを生成します。</li>
	<li>パブリケーション27前に NCBI の遺伝子表現のオムニバスに FASTQ ファイルと raw 読み取りカウント データを入金します。「ゲオと高スループット シーケンス データの送信」の手順に従います: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html。</li>
	<li>R の統計的環境読み取りカウント データをインポートし、「time_course_script ここでは、提供される R スクリプトを使用して、統計分析を実行。R"。このスクリプトに応じて、実験およびコンピューター ディレクトリを編集します。 注: このスクリプトには、手順を説明する広範なコメントが含まれています。簡単に言うと、このスクリプトは、読み取りデータをインポート、読み取りを正規化時間コースによって有意な変化、主成分分析を実行してグラフの選択した遺伝子の発現の遺伝子を識別します。</li>
</ol>

<ol><li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+sensing%2C+homeostasis%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+Eng.+J+Med%22%5BJournal%5D)">Oxygen sensing, homeostasis, and disease.</a> New Eng. J Med. 365 (6), 537-547 (2011).</li>
<li>Butler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+gene+expression+in+eukaryotic+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Micro%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and gene expression in eukaryotic microbes.</a> Annu. Rev. Micro. 67, 291-312 (2013).</li>
<li>Ratcliffe, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+sensing+and+hypoxia+signalling+pathways+in+animals%3A+the+implications+of+physiology+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Oxygen sensing and hypoxia signalling pathways in animals: the implications of physiology for cancer.</a> J. Physiol. 591 (Pt 8), 2027-2042 (2013).</li>
<li>Rosenfeld, E., Beauvoit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+non-respiratory+pathways+in+the+utilization+of+molecular+oxygen+bySaccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen bySaccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).</li>
<li>Ter Linde, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+transcriptional+analysis+of+aerobic+and+anaerobic+chemostat+cultures+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Bacteriol. 181 (24), 7409-7413 (1999).</li>
<li>Ter Linde, J. J., Steensma, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microarray-assisted+screen+for+potential+Hap1+and+Rox1+target+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">A microarray-assisted screen for potential Hap1 and Rox1 target genes in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 19 (10), 825-840 (2002).</li>
<li>Kwast, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analyses+of+anaerobically+induced+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+functional+roles+of+Rox1+and+other+factors+in+mediating+the+anoxic+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Genomic analyses of anaerobically induced genes in Saccharomyces cerevisiae: functional roles of Rox1 and other factors in mediating the anoxic response.</a> J. Bacteriol. 184 (1), 250-265 (2002).</li>
<li>Becerra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+transcriptome+in+aerobic+and+hypoxic+conditions%3A+effects+of+hap1%2C+rox1%2C+rox3+and+srb10+deletions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The yeast transcriptome in aerobic and hypoxic conditions: effects of hap1, rox1, rox3 and srb10 deletions.</a> Mol. Microbiol. 43 (3), 545-555 (2002).</li>
<li>Lai, L. -C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamical+remodeling+of+the+transcriptome+during+short-term+anaerobiosis+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+differential+response+and+role+of+Msn2+and%2For+Msn4+and+other+factors+in+galactose+and+glucose+media%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamical remodeling of the transcriptome during short-term anaerobiosis in Saccharomyces cerevisiae: differential response and role of Msn2 and/or Msn4 and other factors in galactose and glucose media.</a> Mol. Cell. Biol. 25 (10), 4075-4091 (2005).</li>
<li>Lai, L. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic-State-Dependent+Remodeling+of+the+Transcriptome+in+Response+to+Anoxia+and+Subsequent+Reoxygenation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Euk.+Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic-State-Dependent Remodeling of the Transcriptome in Response to Anoxia and Subsequent Reoxygenation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Euk. Cell. 5 (9), 1468-1489 (2006).</li>
<li>Hickman, M. J., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heme+levels+switch+the+function+of+Hap1+of+Saccharomyces+cerevisiae+between+transcriptional+activator+and+transcriptional+repressor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Heme levels switch the function of Hap1 of Saccharomyces cerevisiae between transcriptional activator and transcriptional repressor.</a> Mol. Cell. Biol. 27 (21), 7414-7424 (2007).</li>
<li>Hickman, M. J., Spatt, D., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hog1+mitogen-activated+protein+kinase+mediates+a+hypoxic+response+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Hog1 mitogen-activated protein kinase mediates a hypoxic response in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 188 (2), 325-338 (2011).</li>
<li>Bendjilali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Course+Analysis+of+Gene+Expression+During+the+Saccharomyces+cerevisiae+Hypoxic+Response%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Time-Course Analysis of Gene Expression During the Saccharomyces cerevisiae Hypoxic Response.</a> G3. 7 (1), 221-231 (2017).</li>
<li>Chellappa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane+proteins%2C+Spt23p+and+Mga2p%2C+play+distinct+roles+in+the+activation+of+Saccharomyces+cerevisiae+OLE1+gene+expression.+Fatty+acid-mediated+regulation+of+Mga2p+activity+is+independent+of+its+proteolytic+processing+into+a+soluble+transcription+activator%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The membrane proteins, Spt23p and Mga2p, play distinct roles in the activation of Saccharomyces cerevisiae OLE1 gene expression. Fatty acid-mediated regulation of Mga2p activity is independent of its proteolytic processing into a soluble transcription activator.</a> J. Biol. Chem. 276 (47), 43548-43556 (2001).</li>
<li>Abramova, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+mechanisms+controlling+expression+of+the+DAN%2FTIR+mannoprotein+genes+during+anaerobic+remodeling+of+the+cell+wall+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulatory mechanisms controlling expression of the DAN/TIR mannoprotein genes during anaerobic remodeling of the cell wall in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 157 (3), 1169-1177 (2001).</li>
<li>Hughes, A. L., Todd, B. L., Espenshade, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SREBP+Pathway+Responds+to+Sterols+and+Functions+as+an+Oxygen+Sensor+in+Fission+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SREBP Pathway Responds to Sterols and Functions as an Oxygen Sensor in Fission Yeast.</a> Cell. 120 (6), 831-842 (2005).</li>
<li>Gaisne, M., Bécam, A. M., Verdière, J., Herbert, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%26%2334%3Bnatural%26%2334%3B+mutation+in+Saccharomyces+cerevisiae+strains+derived+from+S288c+affects+the+complex+regulatory+gene+HAP1+%28CYP1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gen%22%5BJournal%5D)">A &#34;natural&#34; mutation in Saccharomyces cerevisiae strains derived from S288c affects the complex regulatory gene HAP1 (CYP1).</a> Curr. Gen. 36 (4), 195-200 (1999).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Gen%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Gen. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Anders, S., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+analysis+for+sequence+count+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential expression analysis for sequence count data.</a> Genome Biol. 11 (10), R106(2010).</li>
<li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biol. 17 (1), 13(2016).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinf%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinf. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat2%3A+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions%2C+deletions+and+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biol. 14 (4), R36(2013).</li>
<li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTSeq--A+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinf%22%5BJournal%5D)">HTSeq--A Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinf. 31 (2), 166-169 (2015).</li>
<li>R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.R-project.org">https://www.R-project.org</a> (2015).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>Brown, T., Mackey, K., Du, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+RNA+by+Northern+and+Slot+Blot+Hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Prot.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of RNA by Northern and Slot Blot Hybridization.</a> Curr. Prot. Mol. Biol. 74, 4.9.1-4.9.19 (2004).</li>
<li>Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+Omnibus%3A+NCBI+gene+expression+and+hybridization+array+data+repository%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository.</a> Nuc. Acids Res. 30 (1), 207-210 (2002).</li>
<li>Cherry, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+Genome+Database%3A+the+genomics+resource+of+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast.</a> Nuc. Acids Res. 40, D700-D705 (2012).</li>
<li>Hothorn, T., Everitt, B. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHothorn%2C+T+%22A+Handbook+of+Statistical+Analyses+using+R%22">A Handbook of Statistical Analyses using R</a>. , 3rd ed, CRC Press: Taylor & Francis Group. Boca Raton, FL. (2014).</li>
<li>Saldanha, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Java+Treeview--extensible+visualization+of+microarray+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Java Treeview--extensible visualization of microarray data.</a> Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).</li>
<li>Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cluster+analysis+and+display+of+genome-wide+expression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 95 (25), 14863-14868 (1998).</li>
<li>Davies, B. S. J., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Role+for+Sterol+Levels+in+Oxygen+Sensing+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Role for Sterol Levels in Oxygen Sensing in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 174 (1), 191-201 (2006).</li>
<li>Meena, R. C., Kumar, N., Nath, S., Chakrabarti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+Recombination+is+Activated+at+Early+Time+Points+Following+Exposure+to+Cobalt+Chloride+Induced+Hypoxic+Conditions+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Ind.+J.+Microb%22%5BJournal%5D)">Homologous Recombination is Activated at Early Time Points Following Exposure to Cobalt Chloride Induced Hypoxic Conditions in Saccharomyces cerevisiae.</a> Ind. J. Microb. 52 (2), 209-214 (2012).</li>
<li>Snoek, I. S. I., Tai, S. L., Pronk, J. T., Yde Steensma, H., Daran, J. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+Snf7p+and+Rim101p+in+the+transcriptional+regulation+of+TIR1+and+other+anaerobically+upregulated+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Involvement of Snf7p and Rim101p in the transcriptional regulation of TIR1 and other anaerobically upregulated genes in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEMS Yeast Res. 10 (4), 367-384 (2010).</li>
<li>Ellahi, A., Thurtle, D. M., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Chromatin+and+Transcriptional+Landscape+of+Native+Saccharomyces+cerevisiae+Telomeres+and+Subtelomeric+Domains%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Chromatin and Transcriptional Landscape of Native Saccharomyces cerevisiae Telomeres and Subtelomeric Domains.</a> Genetics. 200 (2), 505-521 (2015).</li>
<li>Collart, M. A., Oliviero, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+yeast+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Prot.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of yeast RNA.</a> Curr. Prot. Mol. Biol. , (2001).</li>
<li>Blankenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+FASTQ+data+with+Galaxy%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinf%22%5BJournal%5D)">Manipulation of FASTQ data with Galaxy.</a> Bioinf. 24 (14), 1783-1785 (2010).</li>
<li>Martini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((timeClip%3A+pathway+analysis+for+time+course+data+without+replicates%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">timeClip: pathway analysis for time course data without replicates.</a> BMC Bioinf. 15, Suppl 5. (2014).</li>
<li>Oh, S., Song, S., Grabowski, G., Zhao, H., Noonan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+series+expression+analyses+using+RNA-seq%3A+a+statistical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Res.+Int%22%5BJournal%5D)">Time series expression analyses using RNA-seq: a statistical approach.</a> BioMed Res. Int. 2013, 1-16 (2013).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

本研究では酵母出芽酵母における低酸素の中にすべての遺伝子の mRNA のレベルを測定しました。目標は、制御 - 無酸素環境で成長のためにどのようにグローバル遺伝子発現変動を分析することでした。いくつかの手順は、ここで説明したメソッドが慎重に制御され、再現可能なことを確認に運ばれました。まず、セルの正確に定義された低酸素環境にさらされた: リッチ メディア (YPD) で 99.999% N2 。低酸素症の他の研究がフラスコまたは32を空気管を閉鎖、低酸素・ ミメティック コバルト塩化33を使用または低酸素血症を誘発する嫌気性チャンバーや袋34を採用します。これらの各メソッドは、低酸素血症やその他の意図しない環境の変化のさまざまなレベルであります。野生の酵母より少なく深刻な低酸素状態を経験する可能性がある (例えば90% N2および 10% O2)、混合ガスを系統的に変化させて中の遺伝子発現の研究...

多くの生物は、遺伝子発現1,2,3を変更することにより低酸素症、または低 O2に応答します。この応答細胞の有酸素呼吸のため、いくつかの生合成反応の重要な基板の欠如と、変化する酸化還元状態4を対処するために役立ちます。出芽酵母で実行されるいくつかのマイクロ アレイ研究を示す低酸素5,6,7,8,9への応答で何百もの遺伝子の mRNA のレベルが変更されます。,10,11,12です。 最近、RNA シーケンスは低酸素症13時に時間をかけて遺伝子発現変動を特徴付けるために使用されました。ここでは、実験の詳細が表示されますと説明しました。
低酸素は O2の別のレベルがそれぞれ、様々 な方法で実現できます。ここでは、低酸素血症が継続的に流れるによって設立された超高純度 N2フラスコに [2] を下げるが再現速度10のすぐに溶解しました。いくつか O2分子存在代謝と遺伝子発現に寄与するが、この環境で嫌気性の近くに非常にあることが可能です。O2がない場合は、酵母細胞は、ピロールポリアミド ヘム、エルゴステ ロール、不飽和脂肪酸4,12,14をことはできません。したがって、酸素5,10,15なし酵母を育てるときは、以前の研究にこれらの代謝物質が含まれています。ただし、これらの代謝物質の枯渇によって仲介される多くの低酸素応答し低酸素遺伝子発現応答12,16を反転従ってそれらを補充します。自然な低酸素状態を模倣するために、これらの代謝物はメディアに追加されませんでした。細胞がこれらの重要な代謝物質が存在しなくても低酸素にさらされた短い時間で細胞死 (データは示されていない) も長期のストレス応答13の顕著な増加がなかった。
応答は、ひずみとその遺伝子型に依存しています。特に重要なは、低酸素応答2の知られている規制当局の対立遺伝子は。S288C 株の背景は、この歪みを使用して実行するその他のゲノム研究と結果を比較することが望ましい。ただし、S288C にはHAP1遺伝子17、低酸素応答の重要な転写因子の部分的な機能喪失の対立遺伝子が含まれています。この対立遺伝子は S288C で修復された、野生型を使用して、Σ1278b からコピーひずみ背景11。
遺伝子の発現は細胞の環境に大きく依存しています。したがって、mRNA 全ゲノム解析を実行すると、時間、刺激、または遺伝子型など別のパラメーターを変えながら一定の環境を維持するために重要です。再現性の高い結果を達成するため、これらの 3 つの事例研究とその生物学的または技術的な複製のすべてを検討してください。まず、同じ experimenter(s) を実行し、研究技術プラクティスは実験者間で異なる場合がありますので。第二に、各バッチがある遺伝子発現に影響を与えることができますわずかに異なる組成としては、成分の同じバッチを成長媒体で使用ください。第三に、細胞周期の影響を最小限に抑えるために各時点で構成されます非同期セルの成長 (1-2 x 107セル/mL) の中間ログの段階で。
低酸素遺伝子発現応答のような複雑な応答を特性評価する際時間コースは様々 なイベントの速度を決定するため有利です。応答の主要な変更をキャプチャする、特定の時間ポイントを選択必要があります。本研究では、過去の実験は、この期間の13の間に遺伝子発現の広範な変化を明らかにしたので、0 と 4 h の時間ポイントが観察された.
世界的な遺伝子発現を測定するには、RNA シーケンス使用18,19であった。このメソッドでは、次世代シーケンサーを使用して、各遺伝子の転写産物の相対量を決定します。RNA seq DNA マイクロ アレイ解析と比較して、(より少なく豊富な転写産物を検出) に対する感受性も高い、(大きいフォールドの変更を測定) に大きなダイナミック レンジ、優れた再現性に正確に時間をかけて遺伝子発現を展示しています。通常、ほとんどの携帯電話の RNA はリボソーム RNA 特定 RNA 種20を豊かにするとても多くの方法が開発されているです。ここでは、浄化するためにポリ A を含む mrna もさまざまな商業的使用されたポリ T ビーズ - 入手可能な rRNA 枯渇キットは mRNA 濃縮に有効である可能性があります。
ここでは、低酸素に出芽酵母遺伝子の発現は特徴付けられました。細胞が低酸素にさらされ、8 の時点でサンプリングし、(0、5、10、30、60、120、180 と 240 分)。再現性を確認するためおよび統計的に変更された成績証明書を識別するには、3 つの生物学的複製を行った。RNA だった機械的破壊とカラム精製により抽出し、RNA シーケンス解析処理し、.ポスト シーケンス処理パイプラインは記述されプログラミング スクリプトは解析の厳密な複製を実行できます。具体的には、Trimmomatic 21、TopHat2 22、HTseq 23、R 統計環境24、DESeq2 パッケージ25を用いて RNA シーケンス データを処理し、中に大幅変更 607 の遺伝子を識別するには低酸素血症。主成分分析 (PCA) および複製の遺伝子発現手法の再現性を示した。クラスタ リングとヒートマップなどは遺伝子の ontology (GO) の分析を示した酸素遺伝子のセットで好気性の呼吸のような多くの細胞プロセスが濃縮され、広範な発現動態を明らかにしました。

<table><tbody><tr><td>密閉型ドライインキュベーター</td><td>Thermo Scientific</td><td>MaxQ 4000</td><td>30°Cに設定 ドアを変更して、Tygonチューブを1本入れられるようにします。あるいは、チューブポートを含むニューブランズウィックG25インキュベーターを使用してください。フラスコ間のチューブに結露が集まり、培養物が交差汚染する可能性があるため、屋外のウォーターシェーカーは使用しないでください。</td></tr><tr><td>マイクロ分析フィルターホルダー</td><td>ミリポア</td><td>XX1002530</td><td>直径25mm、ステンレス鋼サポート、No.5穴あきシリコンストッパーマウント、標準125mLろ過フラスコ</td></tr><tr><td>強力真空</td><td>Edwards</td><td>E-LAB 2</td><td>The "家"真空が弱すぎる可能性があります。または、ここに記載されているような電動ポータブル真空ポンプを使用してください。</td></tr><tr><td>1,000mLフラスコ</td><td></td><td></td><td>真空トラップとして機能します。</td></tr><tr><td>~2フィートの長さのヘビーウォール真空チューブ、内径3/8インチ、タイゴン38TTの外径7/8</td><td></td><td></td><td>2ピース:1つ目は真空をトラップに接続し、2つ目はトラップをフィルターシステムに接続します。</td></tr><tr><td>高圧N2ガスタンク</td><td></td><td></td><td>純度99.999%、>1,000psi、レギュレーターとガスフローコントローラー付き</td></tr><tr><td>オートクレーブ処理された500mLフラスコ</td><td></td><td></td><td>開口部はアルミホイルで覆われています。酵母株ごとに1つ。</td></tr><tr><td>オートクレーブ処理された250mLフラスコ開口部</td><td></td><td></td>は<td>アルミホイルで覆われています。各時点に 1 つ、さらにウォーター トラップ用に 2 つ。</td></tr><tr><td>フラスコストッパー(サイズ6、穴5mm径2個)</td><td></td><td></td><td>エタノール70%で滅菌。フラスコごとに1つ。</td></tr><tr><td>ガラス管、長さ9cmまたは17cm、内径2mm、外径5mm70</td><td></td><td></td><td>%エタノールで滅菌されています。各フラスコに2本のチューブ。各ストッパーの穴に入れます。9cmと17cmのチューブの配置については、図1を参照してください。</td></tr><tr><td>~25 cmの長さのプラスチックチューブ、内径5 mm</td><td>Tygon</td><td>E-3603</td><td>フラスコごとに1個。70%エタノールで滅菌。</td></tr><tr><td>滅菌フィルターディスクミリ</td><td>ポア</td><td>HAWP02500</td><td>直径25mm、0.45&micro;m孔径、各時点に1つずつ</td></tr><tr><td>滅菌dH2O(~100 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mLキュベット</td><td></td><td></td><td>OD600(細胞濃度)の測定用</td></tr><tr><td>50 mL 滅菌遠心チューブ</td><td></td><td></td><td>各時点に1本</td></tr><tr><td>清潔で滅菌済みのピンセット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>液体窒素</td><td></td><td></td><td>細胞の凍結用</td></tr><tr><td>酸洗浄ビーズ</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td>4°C;細胞を溶解するためのC</td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>RNAカラム精製用</td></tr><tr><td>Qiagen RLTバッファー</td><td></td><td></td><td>10 & microを追加して調製します。RLT緩衝液1 mLあたりのβ-メルカプトエタノールのLは、4°Cに保ちます。</td></tr><tr><td>2 mLコレクションチューブ</td><td>Qiagen Qiagen</td><td></td><td>Rneasy Mini Kit</td></tr><tr><td>Buffer RPE</td><td>Qiagen</td> に含まれる Qiagen <td></td><td>Rneasy Mini Kit</td></tr><tr><td>Buffer RW1</td><td>Qiagen</td> に含まれる <td>Qiagen</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>79254</td><td>DNase I酵素は、ガラスバイアルに入った凍結乾燥粉末として提供されます。滅菌針とシリンジを使用して、550 &microを注入します。バイアルにRNaseを含まない水(Qiagenキットで提供)のL。ボトルを静かにひっくり返して混ぜます。酵素の変性を防ぐため、ボルテックスしないでください。ピペットを使用して、このストック溶液をバイアルから取り出し、冷凍庫(-20°C;C)使い捨てアリコート(80&micro;L各)。原液は解凍して再凍結しないでください。</td></tr><tr><td>Qiagen DNaseキットに含まれる</td><td>バッファーRDD</td><td>Qiagen</td><td></td></tr> 氷<tr><td>冷2mLスクリューキャップチューブ</td><td></td><td></td><td>RNA抽出ビー</td></tr><tr><td>ドミルホモジナイザー</td><td>Biospec Mini-Beadbeater-24</td><td>112011</td><td>冷蔵室に保管</td></tr><tr><td>バクトペプトン</td><td>BD</td><td>DF0118</td><td>液体YPD培地用</td></tr><tr><td>バクト酵母エキス</td><td>BD</td><td>DF0886</td> 液体<td>用YPD培地</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>フィ</td><td>ッシャーD16</td>(<td>液体用) YPD培地</td></tr><tr><td>Qubitアッセイチューブ</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーQ32856</td>(<td>核酸濃度測定用</td></tr><tr><td>) Quant-iTTM dsDNA BRアッセイキット</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーQ32853</td>(<td>核酸濃度測定用</td></tr>) <tr><td>Quant-iTTM RNAアッセイキット</td><td>サーモフィッシャーQ32855</td><td></td>(核<td>酸濃度測定用</td>)</tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td>核酸濃度測定用</td></tr><tr><td>商用電気泳動システム</td><td>Agilent</td><td>Bioanalyzer 2100</td><td>核酸品質測定用</td></tr><tr><td>次世代シーケンサー</td><td>Illumina</td><td>HiSeq 2500</td><td>シーケンシングライブラリ用</td></tr><tr><td>自動リキッドハンドリングシステム</td><td>Wafergen</td><td>Apollo 324</td><td>作成用シーケンシングライブラリ</td></tr><tr><td>PrepX PolyA mRNA Isolation Kit</td><td>Wafergen</td><td>400047</td> Total <td>RNAからmRNAを単離</td></tr><tr><td>PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit</td><td>Wafergen</td><td></td> Project Splitter <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>からストランド特異的シーケンシングライブラリを作成するためのWafergen 400039</td></tr><tr><td>https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d Samtools: gzip コマンド</td><td></td><td></td><td>http://www.htslib.org/download/</td></tr> <tr><td>Trimmomatic</td><td></td><td></td><td>http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td></tr><tr><td>Bowtie2 (TopHat より前にインストール) が含まれています。</td><td></td><td></td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml</td></tr><tr><td>TopHat</td><td></td><td></td><td>https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml</td></tr><tr><td>HTSeq</td><td></td><td></td><td>http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html</td></tr><tr><td>R(R Studioより前にインストール)</td><td></td><td></td><td>https://cran.rstudio.com</td></tr><tr><td>R Studio(無料版)</td><td></td><td></td><td>https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td></tr></tbody></table>

s の酵母酵母の低酸素応答中に時間をかけての mrna のレベルを測定

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

遺伝子発現の複雑な変化は通常大部分の細胞応答を仲介します。各遺伝子は、遺伝子は多くの刺激、信号経路または二次的な影響の 1 つの特定のタイミングで規制されて、ユニークな反応速度で式を変更可能性があります。全体の遺伝子をキャプチャするために酵母、RNA シーケンス解析における低酸素応答は低酸素への露出の後の特定の時間にすべての遺伝子の mRNA のレベルを監視する使用されました。低酸素症は、〜 100% N2ガス細胞の成長によって設立されました。重要なは、その他の低酸素の研究とは異なりエルゴステ ロール、不飽和脂肪酸に追加されませんでしたメディアこれら代謝遺伝子発現に影響を与えるため。その期間は遺伝子発現に大きな変化をキャプチャするため、タイム ポイントは 0 - 低酸素後 4 h の範囲に選ばれました。各時点で中間ログ低酸素細胞がすぐにフィルタ リングされ、凍結、遺伝子発現の O2と併用変更への露出を制限します。総 RNA は細胞から抽出され、cDNA に変えられたし、mrna を豊かにするために使用します。この cDNA から多重ライブラリが作成された、8 個以上のサンプルが次世代シーケンサーの 1 つの車線に配列されました。マッピングと遺伝子ごとの読み取り数を決定する品質基本トリミングを含むポスト シーケンス処理パイプラインを説明します。R 統計環境の中で DESeq2 は、低酸素時点のいずれかで大きく変化する遺伝子を識別するために使用されました。3 生物的複製の分析は、高い再現性を明らかにした、異なる速度の遺伝子と多数の期待 O2-遺伝子。これらのメソッドは、時間をかけて様々 な生物の細胞が低酸素に対応方法を研究するために使用し、他の細胞に発現する遺伝子の研究に適応できます。

低酸素症の経過と RNA シーケンス解析を独立して 3 回行った。3 つのレプリケートの再現性を確認するには、すべての遺伝子の遺伝子発現データを主成分分析 (PCA) を使用して行った。図 2は、サンプルが一緒に可変性の 58.9% を表す最初の 2 つの主要コンポーネントを変更する方法を示しています。この分析では、(各曲線の似たような形で描かれている)、各時間コースが同様の変化を示すことを示した。さらに、最後の 2 つの複製最初のレプリケートするよりも互いに類似していた。これは実際に最後の 2 つの複製が最初の複製を行った別の人とバッチ間メディア コンポーネントの同じバッチを使用している同じ人によって行われたこと。この発見は、技法と化学物質の整合性が高い再現性を得る場合の重要な要素であるという事実を強調表示します。最後に、PCA 分析は、選ばれた時ポイントをキャプチャ時間経過中に発生する主要な変更かどうかを評価する上で便利です。遺伝子発現と小さい変化と可能性を好気性からスイッチの終わりを示す後のサンプル間の距離...

ここでは、RNA シーケンスを使用して酵母細胞の低酸素応答中に時間をかけての mRNA のレベルを監視するプロトコルを提案する.このメソッドは、任意の携帯電話応答中に遺伝子発現を解析する合わせることができます。

S の酵母酵母の低酸素応答中に時間をかけての mRNA のレベルを測定

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

この実験の全体的な目的は、S.Cerevisiae細胞を低酸素状態にさらした際の、全遺伝子のmRNAレベルの時間的変化をモニタリングすることです。この手法は、細胞応答中の遺伝子発現変化のキネティクスはどうなっているかなど、細胞シグナル伝達分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、細胞応答中の単一点で測定するのではなく、mRNAレベルを経時的に測定できることです。この方法は酵母の低酸素応答に関する知見を提供しますが、液体培地で培養可能な他の微生物種にも適用できます。この手法の視覚的なデモンストレーションは、フラスコとチューブの接続の詳細な配置や、低酸素状態からの迅速な細胞回収を伝えるために不可欠です。低酸素タイムコースの1日前までに、必要な資材を準備します。細胞を迅速に処理できるよう、窒素タンク、インキュベーター、真空装置、およびろ過システムを近接して配置します。グルコース、酵母エキス、ペプトンをガラス瓶に混ぜてオートクレーブし、滅菌液体YPD培地を調製します。次のステップは、この概略図に従って、インキュベーター内でのフラスコの配置を計画することです。窒素タンクから見て、最初のフラスコはウォータートラップになります。2番目のフラスコが最後のタイムポイントとなり、3番目のフラスコが最後から2番目のタイムポイントとなり、最後のフラスコである最終ウォータートラップまで同様に続きます。例えば、ここでは7つの低酸素タイムポイントに対するフラスコと接続の可能な配置例を示します。タイムコースの前日に、1つの酵母株の前培養を準備します。滅菌塗布棒を使用してプレートからコロニーを完全にピックアップし、その棒を滅菌試験管に入れた5 mLの液体YPDに入れ、ほとんどの細胞が懸濁するまで棒を振ります。チューブを30°で回転させます

measuring-mrna-levels-over-time-during-yeast-s-cerevisiae-hypoxic

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

遺伝子欠失と蛋白質の過剰発現は、タンパク質の機能を研究するための一般的な方法です。この記事では、我々は、人口および単一細胞レベルでのタンパク質の濃度の関数として表現型の開発の分析のためのプロトコルを記述する...

出芽酵母のタンパク質濃度の関数としての形態学的表現型の開発の分析

このプロトコルは、酵母の遺伝子発現（内...

マイクロアレイ解析のためのサッカロマイセスセレビシエ</em

このプロトコルは、蛍光を実行するための実験手順を説明...

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

我々は、単一セルの時系列データを抽出するために蛍光成長酵母細胞の顕微鏡ムービー、GUIベースのソフトウェアパッケージを取得する単純なプロトコルを提示する。分析では、目視検査と追跡対象データの手動キュレーションと統合され自動化された系統と分裂時間の割り当てが含まれています。...

出芽酵母の蛍光タイムラプス作品を取得し、移植片を使用したシングルセルダイナミクスの解析

フローサイトメトリーおよび顕微鏡検査に基づいて、二つの相補的な方法は、酵母におけるMAPK経路の活性化によって誘導される遺伝子発現の動態を、単一細胞レベルで、定量化を可能にする提示されている。...

シングル酵母細胞中のMAPK誘導発現の時間的な定量

特定のmRNAの定常状態レベルは、mRNAの合成および減衰の速度によって決定される。ゲノムワイドなmRNAの分解速度または特定のmRNAの崩壊速度は、mRNAの半減期を決定することによって測定することができる。このプロトコルは、Saccharomyces cerevisiae中のmRNA減衰率の測定に焦点を当てています。...

mRNAの崩壊料金の測定で<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em&gt;使い方<em&gt; rpb1-1</em&gt;株

翻訳制御蛋白質量の制御に重要な役割を果たしています。ここでは、我々...

リボソームのプロファイリングによる出芽酵母における翻訳のゲノムの定量化

ここで説明されているプロトコルは、4-チオウラシルが付いた酵母から精製した新しく合成された mRNA のゲノムワイドな定量化に基づいています。このメソッドは、mrna から非 mRNA 合成を測定することができ、したがって、RNA のポリメラーゼ II...

酵母4 チオウラシルの定量化とラベリング代謝新しく合成された mRNA RNA ポリメラーゼ II の活性のためのプロキシとして

このプロトコルは、mRNA合成および分解のインビボ運動を測定するための一分子蛍光をその場所でのハイブリダイゼーション(smFISH)での適用について説明する。...

Situハイブリダイゼーションにおける2色単分子蛍光を用いた 大腸菌 における空間と時間におけるmRNA運動学の探査

生きた酵母や哺乳動物細胞におけるホルムアルデヒド架橋を用いた翻訳(タンパク質生合成)複合体を迅速に安定化させる技術を紹介する。このアプローチにより、一過性の中間体と動的RNA:タンパク質相互作用の解剖が可能になります。架橋された複合体は、深いシーケンシングベースのプロファイリング方法、顕微鏡、質量分析など、複数のダウンストリームアプリケーションで使用できます。...

真核細胞からのトランスレーショナル複合体の迅速な インビボ 固定と分離

このプロトコルは生物発光レポーターを採用しており、 Saccharomyces eubayanus...

インビボ 酵母中の生物発光レポーターを用いた代謝移行期の転写活性のモニタリング

学ぶRNA-seqを用いてSaccharomyces cerevisiaeの低酸素応答におけるmRNAレベルの時間変化を測定する方法。このプロトコルは細胞応答における遺伝子発現動態の研究に応用可能です。

S の酵母酵母の低酸素応答中に時間をかけての mRNA のレベルを測定

さらに動画を探す