透過型電子顕微鏡における微生物の連続超薄切片を得る方法

本手順の全体的な目的は、連続超薄切片を安全かつ容易に作製することです。この手法は、細胞全体の定量的および三次元的な構造情報を電子顕微鏡レベルで提供し、細胞生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、高価な装置なしで連続超薄切片作成が可能であり、かつ本手法によって高解像度画像が得られることです。

この手順を開始するには、ガラススライドの表面を洗浄します。次に、ゴム球を使用して3方活栓から空気を送り込み、溶液を押し出して、Formvar支持膜作製装置の上部カラムにある1.5% Formvar溶液にガラススライドの半分を浸します。3方活栓を開いて空気を放出し、圧力を下げてカラムから溶液を排出します。

次に、装置からガラススライドを取り出し、風乾させてガラススライドの表面にフィルムを形成させます。カミソリでガラススライド上のフィルムの四辺を削り取ります。スライドに息を吹きかけてフィルムを剥離しやすくした後、ガラススライドを低い水平角度でゆっくりと水に浸し、フィルムを浮かせて剥離させます。

次に、穴あきのアルミラックを用いて、水中からFormvarフィルムをすくい上げます。ステレオ顕微鏡下で超音波トリミングブレードとカミソリを用いて試料ブロックをトリミングする前に、まず光学顕微鏡でブロックの先端を観察し、表面に細胞が存在することを確認してください。その後、試料ブロックをチャックに固定し、チャックをトリミングステージに取り付けます。

ブロックを0.7 × 1.0 mmのサイズにトリミングします。エポキシ樹脂が非常に硬い場合は、まず超音波トリミングブレードを用いてボックスをトリミングし、その後カミソリでさらにブロックをトリミングしてください。切断方向を標記するため、片側のショルダーをカットします。

ミクロトームとダイヤモンドナイフを用いて試料ブロックをトリミングするには、試料ブロックチャックをウルトラミクロトームの試料ホルダーにセットします。ダイヤモンドトリミングナイフでブロックの表面をカットします。ダイヤモンドナイフの刃先を試料ブロックの面に平行にセットし、試料を損なわないよう、表面を最小限にカットしてください。

ナイフステージを左に30度回転させ、トリミングナイフでブロックの左端を切り出します。この端が、連続切片作成時のサンプルの上辺となります。次に、ナイフステージを右に30度回転させ、試料の左端から約100 micronsの位置でブロック面を切り出します。

この端が連続切片作成時の試料の下側になります。トリミングナイフを取り外し、試料ブロックを時計回りに90度回転させます。超薄切片用ナイフをナイフステージにセットしてください。

試料表面の広い部分を用いて、試料表面とナイフのエッジが互いに平行になるように調整します。次に、マイクロトームのチャックとチャックホルダーにテープを貼り、境界部分でテープを切断します。試料チャックをマイクロトームから取り出し、実体顕微鏡の下に配置します。

カミソリを使用して、連続切片を採取するための細い部分を残し、検体の大部分を切り離します。パスツールピペットを用いて、連続切片採取に使用する検体に0.5%ネオプレン溶液を約1µL滴下し、切片の側面を接着しやすくします。次に、検体全体をネオプレン溶液で覆います。検体の近くにフィルターペーパーを配置し、余分なネオプレン溶液を直ちに吸収させます。

次に、連続切片をピックアップするためのスリットグリッドを3枚準備します。そのために、グリッドのハンドルを60度に曲げ、0.5% Neoprene溶液で処理します。その後、グロー放電によりグリッドを親水化させます。

テープを貼った部分を合わせて、標本ブロックチャックをマイクロトームの元の位置に戻します。これにより、ブロック面とナイフのエッジを完全に平行に保つことができます。次に、ナイフを標本に近づけます。

ナイフボートに水を満たした後、気流を防ぐためにミクロトームをプラスチックカバーで覆います。切片厚さを200 nanometersに設定し、試料の切削を開始します。最初の切片が切削された後、切片厚さを70 nanometersに設定します。

連続切片の数が20枚に達したら、切片の厚さを10 nanometersに設定します。ミクロトームでは10 nanometerの厚さで切断できないため、新しい切片は現れず、以前に切断された切片がナイフエッジから離れます。次に、切片の厚さを60 nanometersに設定します。

装置が前の10 nanometerの厚みを加算するため、これにより70 nanometerの切片が作成されます。最後に、切片厚を70 nanometersに戻し、1.8 millimeterの長さの切片が得られるまで切断を続けます。連続切片を回収するには、まず切片保持ループを3番目の切片グループに配置します。

次に、水面上昇ループをナイフステージ上に配置します。シャフトとハンドルを動かし、WSRLのループを連続切片の直上に位置させます。WSRLのループを水面に降ろし、ループが切片を囲むようにします。

ネジを下に回してループを押し下げ、表面張力によって水面が上昇するようにします。切片をループの中央へ移動させます。水面の頂点に切片を配置し、髪の毛を用いて切片の向きを調整します。

ピンセットを用いて、ベア・スリット・グリッドを水面と平行に保持しながら、切片グループに触れさせて拾い上げます。切片が付着したグリッドを、少量の水とともにFormvar支持膜の上に載せます。ろ紙を使用して、余分な水分を除去します。

切片が完全に乾燥した後、グリッド周囲のFormvarフィルムを破り、切片が載ったグリッドを取り出します。染色チューブの溝にグリッドを正しい順序でセットし、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で切片を染色します。5枚のグリッドをマルチ試料ホルダーに正しい順序でセットし、グリッドのスリットの長軸が試料ホルダーの軸と垂直になるように向きを調整します。

グリッド固定剤を用いてグリッドを固定し、透過電子顕微鏡に試料ホルダーを挿入します。目的の細胞およびすべての細胞切片を高倍率で撮影します。ここでは、連続切片を保持する5枚のグリッドを低倍率で見た様子を示しています。

18〜25枚の切片を1つのグリッド上にマウントしました。切片は互いに接着されており、厚みが均一であることに留意してください。ここでは、pericarionの筋形成の連続切片を示しています。

図には67個の完全な切片のうち12個が示されています。この細胞には、単一の核様体膜と、細菌に似た共生体を持つ、裸のDNA繊維からなる大きな核様体が存在し、ミトコンドリアは存在しないことが分かりました。したがって、この生物は原核生物から真核生物へと進化する過程にある中間的な生命体であると考えられます。

ここではEscherichia coliの連続切片を示しています。図には12枚の完全な切片が表示されています。興味深いことに、この細胞には21,700個のリボソームが含まれていることが分かりました。

このビデオを視聴することで、連続超薄切片の作製方法について十分に理解できるはずです。この手法を習得し、適切に実施すれば、3時間で完了させることができます。