2018年1月17日
本研究は、透過型電子顕微鏡の高価な機器なし微生物の連続超薄切片を得るため信頼性が高く、簡単な手順を示します。
この手順の全体的な目標は、シリアル超薄型切片を安全かつ簡単に作成することです。この方法は、細胞生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ち、電子顕微鏡レベルでの全細胞の定量的および三次元構造情報を提供します。この手法の主な利点は、高価な機械を使わずに連続的な極薄切片化を行うことができ、この方法で高解像度の画像を取得できることです。
この手順を開始するには、スライドガラスの表面を清掃します。次に、スライドガラスの半分をFormvarサポートフィルム製造装置の上部列に1.5%Formvar溶液に浸し、ゴムボールを使用して3方向ストップコックを介して溶液を空気で押します。三方活栓を開き、空気を放出して圧力を下げることにより、カラムから溶液を排出します。
次に、装置からスライドガラスを取り出し、空気中で乾燥させてスライドガラスの表面に膜を形成します。スライドガラスのフィルムの4つの端をカミソリの刃でこすり落とします。スライドに息を吹き込んでフィルムとスライドの分離を容易にした後、スライドガラスを低い水平角度でゆっくりと水に浸してフィルムから浮かせます。
次に、穴の開いたアルミラックを使用して、Formvarフィルムを水からすくい上げます。実体顕微鏡下で超音波トリミングブレードとカミソリブレードで標本ブロックをトリミングするには、まずブロックの先端を光学顕微鏡で観察して、ブロックの表面に細胞があることを確認します。次に、試料ブロックをチャックに取り付け、チャックをトリミングステージに取り付けます。
ブロックを 0.7 x 1.0 mm のサイズにトリムします。エポキシ樹脂が非常に硬い場合は、最初に超音波トリミングブレードを使用してボックスをトリミングし、次にカミソリのブレードでブロックをさらにトリミングします。片方の肩をカットして、カットの方向をマークします。
ミクロトームを使用してダイヤモンドナイフで試料ブロックをトリミングするには、試料ブロックチャックをウルトラミクロトームの試料ホルダーにセットします。ダイヤモンドトリミングナイフでブロックの表面を切ります。ダイヤモンドナイフの刃先を試験片ブロック面と平行にセットし、試験片を失わないように試料表面を最小限にカットします。
トリミングナイフを使用して、ナイフステージを左に30度回転させてブロックの左端を切り取ります。このエッジは、シリアルセクショニングでサンプルの上側になります。次に、ナイフステージを右に30度回転させて、試料の左端から約100ミクロンのところでブロック面を切断します。
このエッジは、連続切片化では試験片の下側になります。トリミングナイフを取り外し、試料ブロックを時計回りに90度回転させます。極薄切片ナイフをナイフステージにセットします。
試験片表面の大部分を使用して、試験片表面とナイフエッジが互いに平行になるように調整します。次に、ミクロトームのチャックとチャックホルダーにテープを貼り、その境界でテープをカットします。標本チャックをミクロトームから取り出し、実体顕微鏡の下に置きます。
カミソリの刃で試料の大部分を切り取り、そこからシリアルセクションが得られるスリムな部分を残します パスツールピペットを使用して、シリアルセクショニングに使用する試料に約1マイクロリットルのネオプレン溶液を落下させて、セクションの側面を接着させます。次に、試料全体をネオプレン溶液で覆います。余分なネオプレン溶液は、試料の近くに置いた濾紙ですぐに吸収します。
次に、シリアルセクションをピックアップするための3つのスリットグリッドを準備します。これを行うには、グリッドのハンドルを60度に曲げ、グリッドを0.5%ネオプレン溶液で処理します。次に、グロー放電によってグリッドを水質化します。
テープで留められた部品を位置合わせして、試料ブロックチャックをミクロトームの同じ位置に戻します。これにより、ブロック面とナイフエッジが互いに完全に平行に保たれます。次に、ナイフを標本に近づけます。
ナイフボートに水を入れた後、ミクロトームをプラスチックカバーで覆い、空気の流れを防ぎます。200ナノメートルの切片の厚さで試料の切断を開始します。最初のセクションをカットした後、セクションの厚さを70ナノメートルに設定します。
シリアルセクションの数が20に達したら、セクションの厚さを10ナノメートルに設定します。ミクロトームは10ナノメートルの厚さの切片を切断できないため、新しい切片は現れず、以前に切断された切片はナイフエッジから分離します。次に、セクションの厚さを60ナノメートルに設定します。
これにより、機械が前の10ナノメートルの厚さを追加するため、70ナノメートルのセクションが生成されます。最後に、切片の厚さを70ナノメートルに戻し、1.8mmの切片が得られるまで切断を続けます。シリアルセクションを取得するには、まずセクション保持ループを3番目のセクショングループに配置します。
次に、ナイフステージに水面上昇ループを配置します。WSRLのループをシャフトとハンドルを動かして、シリアルセクションのすぐ上に配置します。WSRLのループを水面に下げて、ループがセクションを囲むようにします。
表面張力によって水面が浮き上がるように、ネジを下向きに回してループを押し下げます。セクションをループの中央に移動します。それを水の頂点に置き、髪の毛を使用してセクションの方向を調整します。
セクショングループを拾うには、ピンセットで助けられ、水面と平行に保たれる裸のスリットグリッドで触れます。セクションのあるグリッドと小さな水滴をFormvarサポートフィルムに置きます。濾紙を使用して余分な水分を取り除きます。
セクションが完全に乾いたら、グリッドの周りのFormvarフィルムを引き裂きます。をクリックし、セクションを支えているグリッドを取り外します。染色チューブの溝にグリッドを適切な順序でセットし、切片を酢酸ウラニルとクエン酸鉛で染色します。マルチ試料ホルダーの5つのグリッドを適切な順序でセットし、グリッドスリットの長軸を試料ホルダーの軸に垂直に向けます。
グリッドをグリッドフィクサーで固定し、試料ホルダーを透過型電子顕微鏡に挿入します。ターゲット細胞とすべての細胞切片を高倍率で撮影します。ここに示されているのは、シリアル セクションを運ぶ 5 つのグリッドの低倍率ビューです。
18〜25のセクションが1つのグリッドに取り付けられました。セクションは一緒に取り付けられ、同じ厚さであることに注意してください。ここでは、周産期筋形成の連続切片を示します。
この図は、67 の完全なセクションのうち 12 を示しています。この細胞は、単一の核様膜を持つ裸のDNA繊維と、細菌に似ているがミトコンドリアに似ていない内部共生生物からなる大きな核様体を持っていることがわかりました。したがって、この生物は原核生物から真核生物に進化する中間生命体であるように見えます。
ここに示されているのは、大腸菌のシリアルセクションです。この図は、12 の完全なセクションを示しています。興味深いことに、この細胞には21, 700個のリボソームが含まれていることがわかりました。
このビデオを見れば、シリアルの極薄切片の作り方を十分に理解できるはずです。このテクニックは、一度マスターすれば、適切に実行すれば3時間で完了します。
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この研究は、透過型電子顕微鏡で高価な機器を使用せずに、微生物の連続的な超薄断面を入手するための信頼性の高い簡単な手順を提示します。この方法は、電子顕微鏡レベルで細胞全体の定量的および三次元構造情報を提供することを目指しています。
Serial ultrathin sectioning for transmission electron microscopy (TEM) enables high-resolution, three-dimensional analysis of microbial cell architecture, supporting early discovery and mechanistic de-risking in biopharma R&D. This method provides quantitative structural data without reliance on costly automated equipment, facilitating broader access to advanced cellular imaging. Its reproducibility and precision underpin confident target validation and inform risk-adjusted portfolio decisions.
This serial sectioning method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies and advanced imaging-based validation.