ミトコンドリアの Ca^{2 +}保持容量測定と Ca^{2 +}-ミトコンドリアの膨潤アッセイをトリガー

この実験の全体的な目標は、カルシウム誘発性ミトコンドリア腫脹におけるミトコンドリアカルシウム保持能力を決定することです。この方法は、異常なエネルギー代謝など、ミトコンドリアの機能障害の研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、非常にシンプルで効果的であることです。

まず、10cmの細胞培養皿あたり約300万個のSH-SY5Y細胞を播種します。培地を取り出し、10cmの細胞培養皿で約1ミリリットルの氷冷PBSで細胞を3回洗浄します。10cmの細胞培養皿に1ミリリットルの氷冷PBSを加え、接着細胞を新しい1.5ミリリットルのチューブにこすり落とします。

Gの800倍で摂氏4度で10分間遠心分離します。遠心分離中に、5ミリリットルのミトコンドリア分離バッファーを調製し、50マイクロリットルのプロテアーゼ阻害剤ストック溶液を補充します。上清を取り除き、ペレットを1ミリリットルのミトコンドリア分離バッファーで再懸濁します。

1.5ミリリットルのチューブを氷上で30分間インキュベートします。次に、懸濁した細胞をガラス製ホモジナイザーで氷上で手動で上下に溶解します。ホモジネートを1.5ミリリットルのチューブに移します。

次に、Gの1,000倍で摂氏4度で5分間遠心分離し、破片を取り除きます。遠心分離後、上清を新しい1.5ミリリットルのチューブに移してから、前と同じように再び遠心分離します。上清を新しいチューブに移した後、摂氏4度で15分間Gの14,000倍で遠心分離します。

上清を取り除き、ミトコンドリアを含むペレットを1ミリリットルのミトコンドリア分離バッファーで再懸濁します。次に、溶液を14,000倍Gおよび摂氏4度で15分間遠心分離し、ミトコンドリアを沈殿させる。得られたミトコンドリアペレットは、氷上に保持し、ペレットの量に応じて50〜100マイクロリットルの塩化カリウム培地に再懸濁する必要があります。

最後に、5マイクロリットルのミトコンドリア溶液を使用して、プレートリーダーを使用してOD562を測定する標準的なBCAアッセイでミトコンドリアタンパク質濃度を測定します。実験前に、塩化カリウム培地を調製し、カルシウム結合性緑色蛍光色素を最終濃度0.5マイクロモルまで添加します。ミトコンドリアのカルシウム保持能を測定するには、まず、0.5マイクロモルのカルシウム結合性緑色蛍光色素を含む塩化カリウム培地に単離された1ミリリットルのミトコンドリアを6ウェルプレートの各ウェルに移します。

ミトコンドリアとカルシウム結合性緑色蛍光色素を6ウェルプレートで室温でインキュベートし、周囲光から1分間保護します。インキュベーション後、自動分注設定を使用して、20ミリモルの塩化カルシウム溶液で4マイクロリットルのアリコートを6ウェルプレートの各ウェルに加え、ミトコンドリアタンパク質1ミリグラムあたり200ナノモルのカルシウムを導入します。蛍光分光器を使用して、励起波長506ナノメートル、発光波長531ナノメートルで、3秒ごとに2分間蛍光変化を監視します。

プレートは、ソフトウェアによって制御される読み取り間に3秒間、600rpmで振とうが装備されています。各ウェルに4マイクロリットルアリコートの20ミリモル塩化カルシウム溶液を追加し、3秒ごとに蛍光変化を2分間モニターします。カルシウム誘発性ミトコンドリア腫脹を測定するには、塩化カリウム培地中の単離されたミトコンドリア1ミリリットルを6ウェルプレートの各ウェルに移します。

次に、10マイクロリットルの20ミリモル塩化カルシウム水溶液をミトコンドリアタンパク質に加えて、ミトコンドリアの腫れを引き起こします。ソフトウェアで制御するマイクロプレートリーダーを使用して、540ナノメートルで3秒ごとに10分間、吸光度の減少を記録します。カルシウム誘導性ミトコンドリア透過性遷移細孔(MPTP)の阻害剤であるボンクレキッチのミトコンドリアカルシウム保持能の代表的な結果、カルシウム誘導性MPTP開口部の活性化剤であるアトラクチロシドを開くアトラクシロシド、およびブランクコントロールを以下に示します。

ボンクレキッチ治療の能力は、予想通り、アトラクチロシド群よりもはるかに高いです。カルシウム誘発性のミトコンドリア腫脹の代表的な結果を、ボンクレキッチ、アトラクチロシド、および無治療制御の代表的な結果を示します。540ナノメートルで監視される吸光度の低下は、ミトコンドリアの腫れを示しています。

この結果は、BKAがMPTPの開放を抑制し、ATRがMPTPの開放を促進することを示唆しています。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば5時間で完了します。この手順を試みるときは、すべての溶液を氷の上に置いておくことを忘れないでください。