Name: ミトコンドリアの Ca2 +保持容量測定と Ca2 +-ミトコンドリアの膨潤アッセイをトリガー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: 学ぶミトコンドリアのCa²⁺保持容量測定法とCa²⁺誘導膨潤アッセイ。SH-SY5Y細胞由来ミトコンドリアを用い、蛍光分光法でミトコンドリア機能障害とエネルギー代謝異常を評価する。

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本研究は、山東省卓越した科学者 (JQ201421) と NSFC (81371226) からの助成金の助成金からの助成金によって支えられました。

1. ミトコンドリアの分離
注: すべてのソリューションや機器 0 - 4 ° C に冷却、氷で保たれます。
<ol><li>10 cm 細胞培養ディッシュあたり種子約 3 x 10 の6 SH SY5Y 細胞。高グルコース ダルベッコの培養細胞の 10% 牛胎児血清ペニシリン (100 U/mL) とイーグル培地、変更された-ストレプトマイシン (100 μ g/mL)。一晩 5% CO2を含むインキュベーターで 37 ° C で維持します。 注: 少なくとも 1-2 107 SH SY5Y セル x は各分離アッセイに必要な。</li>
	<li>メディアを取り出して、3 回約 1 ml の 10 cm 細胞培養皿で氷冷 PBS のセルを洗浄します。</li>
	<li>10 cm 細胞培養皿に氷冷 PBS の新しい 1 mL を追加し、新しい 1.5 mL チューブに付着性のセルをこすり。800 x g で 4 ° C で 10 分間遠心</li>
	<li>、遠心分離中にプロテアーゼ阻害剤在庫の 50 μ L を添加した 5 mL ミトコンドリア分離バッファー (250 mM ショ糖、10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl) 1 ピペラジン ethanesulfonic 酸), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2、1 mM EDTA) の準備します。(100 倍の濃度; ddH2O の 500 μ L に溶解し 1 EDTA 無料タブレット) のソリューションです。</li>
	<li>上澄みを除去し、ミトコンドリア分離バッファーの 1 mL にペレットを再懸濁します。30 分間氷の上 1.5 mL チューブを孵化させなさい。</li>
	<li>上下に手動で氷の上ガラス ホモジナイザー (15-25 ストローク) と浮遊細胞を溶解します。 注: 細胞をホモジナイズ時に気泡がないことを確認します。視覚的に顕微鏡でそのままなセルとむく核をカウントし、ことを確認 > 90% 細胞破砕が発生しました。</li>
	<li>1.5 mL チューブと (核と残りのままなセル) の残骸を削除する 4 ° C で 5 分間 1,000 × g で遠心分離機に磨砕液を転送します。</li>
	<li>新しい 1.5 mL チューブに 1,000 x g で 5 分間遠心上清を転送 4 ° C</li>
	<li>上清を新しいチューブと 14,000 × g で 15 分間遠心するに転送 4 ° C</li>
	<li>上澄みを除去し、ミトコンドリア ミトコンドリア分離バッファーの 1 つの mL を含むペレットを再懸濁します。</li>
	<li>14,000 x g 4 ° C で 15 分のためのソリューションを遠心分離機、ミトコンドリアを沈殿させます。</li>
	<li>結果ミトコンドリア ペレットを氷で冷やして、50-100 お尻の前にペレットの量に応じて KCl メディアを μ L (125 mM KCl、2 ミリメートル K2HPO4、1 mM MgCl2、20 mM HEPES、5 mM グルタミン酸 5 mM マラテと 2 μ M ロテノン、pH 7.4) で再停止される必要があります。そう。</li>
	<li>標準 BCA アッセイ、OD562 を測定によってミトコンドリア蛋白質の集中を測定するミトコンドリア ソリューションの 5 μ L を使用してプレート リーダー13を使用して。</li>
</ol>2. ミトコンドリアの Ca2 +の保持容量の決定
<ol><li>KCl メディアを準備し、Ca2 +を追加-実験前に 0.5 μ M の最終的な集中に緑色の蛍光色素を結合します。</li>
	<li>0.5 μ M の Ca2 +を含む KCl メディア分離ミトコンドリア (0.4 mg/mL) の 1 mL を転送-よく各 6 ウェル プレートに緑色の蛍光色素を結合します。</li>
	<li>ミトコンドリアと Ca2 +を孵化させなさい-室温 20 mm CaCl2ソリューション (20 mM CaCl2, 127 mM KCl、1 mM MgCl2 1 分追加 4 μ 因数の周囲の光から保護 6 ウェル プレートで緑の蛍光色素を結合、20 mM HEPES、グルタミン酸 5 mM、5 mM のリンゴ酸、pH 7.4) 各 6 ウェル プレートに自動を使用してよく分配設定 200 nmol Ca2 +/mg ミトコンドリア蛋白質を紹介します。</li>
	<li>蛍光分析装置を使用するには、すべて 3 蛍光の変化を監視して s 励起波長 506 の 2 分を nm、発光波長 531 nm。プレートは 3 の 600 rpm で揺れ装備ソフトウェア (図 1) によって制御の測定値間の s。</li>
	<li>各ウェルに 20 mM CaCl2ソリューションの追加 4 μ 因数を追加し、すべての 3 の蛍光の変化を監視 2 分の s は、蛍光性は時間とともに増加するまでこの手順を繰り返します。 注: ミトコンドリアと追加された Ca2 +増加記録蛍光によって示される挑戦されています。MPTP が開いたら、蛍光性は時間とともに増加します。</li>
	<li>Ca2 +追加 Ca2 +保持能力として、mPTP が開くまでの総額を解釈します。</li>
</ol>3. Ca 2 +の定量-ミトコンドリアの膨潤を誘発
<ol><li>実験前に KCl メディアを準備します。<ol>
<li>KCl メディアでの分離ミトコンドリア (0.4 mg/mL) の 1 つの mL を各 6 ウェル プレートにも転送します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ミトコンドリアの膨潤をトリガーするミトコンドリアのタンパク質に 10 μ L の 20 mM CaCl2水溶液 (500 nmol/mg ミトコンドリア蛋白質) を追加します。</li>
	<li>540 で吸光度の減少を記録 nm 毎の 3 10 分 (図 2) のためのソフトウェアによって制御されるマイクロ プレート リーダーの s。蛍光変化は、ミトコンドリアの内膜に溶質の流入によって引き起こされます。 注: 540 で吸光度の低下腫れミトコンドリアに対応する nm。読者は、吸光度の減少を観察しない長い間隔を読書や読書の時間が適用できます。</li>
</ol>

<ol><li>Rossi, C. S., Lehninger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+respiratory+stimulation%2C+accumulation+of+Ca%2B%2B+and+phosphate%2C+and+oxidative+phosphorylation+in+rat+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria.</a> J Biol Chem. 239 (11), 3971-3980 (1964).</li>
<li>Gunter, T. E., Buntinas, L., Sparagna, G., Eliseev, R., Gunter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+transport%3A+mechanisms+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions.</a> Cell Calcium. 28 (5-6), 285-296 (2000).</li>
<li>Crofts, A. R., Chappell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Ion+Accumulation+and+Volume+Changes+of+Isolated+Liver+Mitochondria.+Reversal+of+Calcium+Ion-Induced+Swelling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Calcium Ion Accumulation and Volume Changes of Isolated Liver Mitochondria. Reversal of Calcium Ion-Induced Swelling.</a> Biochem J. 95, 387-392 (1965).</li>
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<li>Celsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+calcium+and+cell+death%3A+a+deadly+triad+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (5), 335-344 (2009).</li>
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<li>Muriel, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+free+calcium+levels+%28Rhod-2+fluorescence%29+and+ultrastructural+alterations+in+neuronally+differentiated+PC12+cells+during+ceramide-dependent+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death.</a> J Comp Neurol. 426 (2), 297-315 (2000).</li>
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<li>Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+bicinchoninic+acid+protein+assay%3A+identification+of+the+groups+responsible+for+color+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation.</a> Anal Biochem. 175 (1), 231-237 (1988).</li>
<li>Petronilli, V., Nicolli, A., Costantini, P., Colonna, R., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+permeability+transition+pore%2C+a+voltage-dependent+mitochondrial+channel+inhibited+by+cyclosporin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Regulation of the permeability transition pore, a voltage-dependent mitochondrial channel inhibited by cyclosporin A.</a> Biochim Biophys Acta. 1187 (2), 255-259 (1994).</li>
<li>Pastorino, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+consequences+of+the+sustained+or+transient+activation+by+Bax+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore.</a> J Biol Chem. 274 (44), 31734-31739 (1999).</li>
<li>Gunter, T. E., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+possible+functions+of+mitochondrial+Ca%282%2B%29+transport+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1291-1308 (2009).</li>
</ol>

X. 太陽監督実験です。魏の李は、実験を行った。陳張及び X 太陽を書いた紙。

ここでは、我々 はミトコンドリアの Ca2 +の保持の能力分析と Ca2 +のシンプルで効果的なプロトコルを記述した-ミトコンドリアの膨潤アッセイをトリガーされます。
ミトコンドリアの分離セルを均質化する場合は特にすべての材料およびチューブは氷の上が存在することを確認します。0.25% トリプシン-EDTA は、37 ° C で 5 分間料理から細胞を切り離す場合にも使用できます。15 25 ストローク後観察顕微鏡の下でそのまま細胞膜とミトコンドリア膜の破損を避けるために必要です。しかし、我々 が得られる分離ミトコンドリア粗ミトコンドリアと精製ミトコンドリアは、1.0 M を得ることができる/1.5M 蔗糖不連続密度勾配。生きている細胞内のミトコンドリアの生物学的特性は、ミトコンドリアを囲む培地成分の濃度のためそれら体内より分離ミトコンドリアのような詳細です。ミトコンドリアの Ca2 +の保持容量または Ca2 +-誘発ミトコンドリア膨潤試験通電条件下で決定されました。機能して...

ミトコンドリアは、酸化的リン酸化による哺乳類細胞で使用される ATP の約 95% を生産する主要な細胞器官です。合成 ATP1に ADP をリン酸化して使用できます、ADP と無機リン酸の存在、人里離れたマイクロモル濃度 Ca2 +ミトコンドリアによって報告されます。細胞内 Ca2 +濃度がしきい値を超えると、ミトコンドリアが取り込み Ca2 +急速および流出それゆっくり。したがって、機能しているミトコンドリアは、増加した細胞内 Ca2 +の流入をことができます。無関係酸化的リン酸化に関与する、ミトコンドリア Ca2 +もゾル性細胞質カルシウム信号の部分を取るし、mPTP のミトコンドリアの内側の開口部を誘導することによってミトコンドリアを介したアポトーシスのメカニズムをアクティブにします。膜2。細胞内 Ca2 +の異常上昇が mPTP3を開くことによってミトコンドリアの大規模な腫れを引き起こすことができる広く認識されています。したがって、このプロトコルがミトコンドリアの Ca2 +保持能力と Ca2 +を定量化することでミトコンドリアの機能を評価することを目的-ミトコンドリアの膨潤が起きるというものです。
Ca2 +保持能力ゾル性細胞質カルシウムを摂取するミトコンドリアの機能の測定であります。ミトコンドリアは細胞内遊離カルシウムをバッファーし、使用頻度の低い沈殿物の形でカルシウム摂取によってカルシウム依存性細胞プロセスを調整できます。障害者 Ca2 +保持能力にエネルギー制限とも神経変性疾患4,5に関連するストレス現象に発生します。ミトコンまたはジギトニン グリセリン細胞 Ca2 +保持能力を識別するために使用できます、追加グルタミン酸とリンゴ酸分離ミトコンドリアによる Ca2 +を蓄積する高い能力は受けない、ミトコンドリアの分離手順6。ジギトニンの滴定された量を使用して、異なる種類の細胞の細胞膜を permeabilize ください。Hexapotassium 塩 Ca2 +-緑色蛍光染料、Ca2 +の結合-敏感な細胞非透過性可視光興奮インジケーターは、広く使用されている7をされています。Ca2 +-(5 分) 刺激8延長バインド緑蛍光染料は低親和性インジケーターで、無料の細胞内 Ca2 +濃度が上昇し続けることを示すために使用します。このメソッドは、放射性フィルター技術よりも敏感だったが、大幅に簡略化します。追加 Ca2 +カルシウム緑色蛍光を高め、ミトコンドリアの Ca2 +吸収がベースラインに蛍光を返します。逐次追加の Ca2 +は、ミトコンドリア吸収 extramitochondrial Ca2 + 9に失敗するまで行われました。蛍光マイクロ プレート リーダーは、継続的にカルシウム緑色蛍光を報告する使用できます。
Ca2 +蓄積の後、ミトコンドリアが脱分極し、中に Ca2 +放出ははれだした。Ca2 +-腫れ、mPTP 開口部を示すためミトコンドリアをトリガーします。電子顕微鏡、Ca2 +の測定に使用に 540 nm の吸光度の減少-ミトコンドリアの膨潤10,11をトリガーします。前方角度光散乱で12、吸光度の減少がミトコンドリアのマトリックスの受動的な腫れを反映ミトコンドリア ボリュームを直接的に確認することができます。
ここで、我々 はミトコンドリアの Ca2 +保持能力と Ca2 +を検討する方法論を説明-SH SY5Y 細胞から分離ミトコンドリア ミトコンドリアの膨潤をトリガーします。

<table><tbody><tr><td>SH-SY5Y細胞株</td><td>ATCC(The Global Bioresource Center)</td><td>ATCC番号:CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>カルシウムグリーン-5N</td><td>Life Technologies</td><td>c-3737</td><td>Ca2+結合緑色蛍光色素</td></tr><tr><td>完全プロテアーゼ阻害剤</td><td>ロシュ・モレキュラー・バイオケミカル</td><td>ズ 4693116001</td><td></td></tr><tr><td>ガラス製ホモジナイザー</td><td>キンブル・チェイス</td><td>9885303002</td><td></td></tr><tr><td>グルタミン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES5063G-A7</td><td></td></tr><tr><td>リンゴ酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46940-U</td><td></td></tr><tr><td>ロテノン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>00457</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900050</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900266</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan フラッシュ装置</td><td>Thermo Scientific</td><td>IC100E</td><td></td></tr><tr><td>Bongkrekate</td><td>Biovision</td><td>1820-100</td><td></td></tr><tr><td>atractyloside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4992</td><td></td></tr><tr><td>高グルコースダルベッコ'</td><td></td><td>SH30022</td><td>4.5 g/L グルコース、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウムなし</td></tr>、<tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ヒクロン</td><td>SV30087</td><td></td></tr>ペ<tr><td>ニシリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>11860-038</td><td></td></tr><tr><td>BCA アッセイキット</td><td>Thermo Scientific</td><td>NCI3225CH</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>10cm細胞培養皿</td><td>NEST</td><td>704001</td><td></td></tr></tbody></table>

ミトコンドリアの ca2 +保持容量測定と ca2 +-ミトコンドリアの膨潤アッセイをトリガー

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

酸化的リン酸化による ATP の生産は、ミトコンドリアの主要な機能です。高等真核生物のミトコンドリアは細胞内 Ca2 +のバッファリングにも参加し、ミトコンドリアで、ATP を生産することができます無料のミトコンドリア内 Ca2 +濃度によって媒介されます。Ca2 +保持能力は、ミトコンドリアのマトリックスでカルシウムを保持するミトコンドリアの機能としてみなすことができます。蓄積された細胞内 Ca2 +の内ミトコンドリア膜透過性につながるでは、ミトコンドリア膜透過性遷移孔 (mPTP)、分子と分子の漏れにつながる重量未満 1.5 kDa の開口部と呼ばれます。Ca2 +-腫れ、mPTP 開口部を示すためミトコンドリアをトリガーします。ここで、Ca2 +保持能力と Ca2 +を検討する 2 つの試金を記述-分離ミトコンドリア ミトコンドリアの膨潤をトリガーします。一定量に Ca2 +が追加されますすべての手順を実行することができます 1 日で完了なりマイクロ プレート リーダーによって記録されました。したがって、これら 2 つのシンプルで効果的なアッセイを採用して、Ca2 +を評価できる-関連するミトコンドリアの機能。

Ca2 +保持能力の代表の結果: 結果は、蛍光値として表現されました。Ca2 + (200 nmols/mg ミトコンドリア蛋白質)、mPTP 開口基準上増蛍光付加パルス。5 μ M Bongkrekate (BKA)、Ca2 +の阻害剤-mPTP が開いたり、1 μ M atractyloside (ATR)、Ca2 +の活性化を誘導-mPTP オープニングを誘発、ミトコン ドリアにしました。合計追加 Ca2 +ベースライン蛍光上ダブルの増加によって示される mPTP オープニングまでの量は、Ca2 +保持能力と解釈されました。我々 のデータあったミトコンドリア Ca2 +保持容量 BKA 治療で ATR グループよりもはるかに高かった。これらのデータは、ミトコンドリア Ca2 +保持能力 (図 3) の適当な測定...

このプロトコルが Ca2 +保持能力と Ca2 +を調べる方法を説明することを目的 - トリガー SH SY5Y 分離ミトコンドリアの膨潤ミトコンドリア細胞ステップバイ ステップ。

ミトコンドリアの Ca2 +保持容量測定と Ca2 +-ミトコンドリアの膨潤アッセイをトリガー

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...

この実験の全体的な目的は、カルシウム誘発性ミトコンドリア腫脹におけるミトコンドリアのカルシウム保持能を決定することです。この手法は、異常なエネルギー代謝などのミトコンドリア機能不全の研究における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、非常に簡便で効果的であることです。まず、10 cm細胞培養ディッシュあたり約300万個のSH-SY5Y細胞を播種します。培地を除去し、10 cm細胞培養ディッシュ内の細胞を氷冷PBS約1 mLで3回洗浄します。10 cm細胞培養ディッシュに氷冷PBS 1 mLを加え、接着細胞をスクレイパーで回収し、新しい1.5 mLチューブに移します。4°Cで800 ×gにて10分間遠心分離します。遠心分離の間、50 µLのプロテアーゼ阻害剤ストック溶液を添加したミトコンドリア分離バッファーを5 mL調製します。上清を除去し、ペレットを1 mLのミトコンドリア分離バッファーで再懸濁します。1.5 milliliterチューブを氷上で30分間インキュベートします。次に、ガラスホモジナイザーを用いて、氷上で手動で上下に撹拌し、懸濁細胞を溶解させます。ホモジネートを別の1.5 milliliterチューブに移します。次に、デブリを除去するため、4°Cで1,000 ×g、5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を新しい1.5 mLチューブに移し、再度同様に遠心分離を行います。上清を新しいチューブに移した後、4°Cで14,000 ×g、15分間遠心分離します。上清を除去し、ミトコンドリアを含むペレットを1 mLのミトコンドリア単離バッファーで再懸濁します。次に、溶液を14,000 ×g、4 °Cで15分間遠心分離し、ミトコンドリアを沈殿させます。得られたミトコンドリアペレットは氷上に保持し、アッセイ前にペレットの容量に応じて50〜100 µLの塩化カリウム培地で再懸濁してください。最後に、5 µLのミトコンドリア溶液を用い、プレートリーダーでOD562を測定する標準BCAアッセイによりミトコンドリアタンパク質濃度を測定します。塩化カリウム培地を調製し、実験前にカルシウム結合緑色蛍光染料を最終濃度0.5 µMとなるように添加します。ミトコンドリアのカルシウム保持能を決定するために、まず0.5 µMのカルシウム結合緑色蛍光染料を含む塩化カリウム培地中の単離ミトコンドリア1 mLを、6ウェルプレートの各ウェルに分注します。ミトコンドリアとカルシウム結合性緑色蛍光染料を6ウェルプレートに入れ、室温かつ遮光条件下で1分間インキュベートします。インキュベート後、自動分注設定を用いて、20 mM 塩化カルシウム溶液を各ウェルに 4 µL ずつ添加し、ミトコンドリアタンパク質1 mgあたり 200 nmol のカルシウムを導入します。蛍光分光光度計を用い

mitochondrial-ca2-retention-capacity-assay-ca2-triggered

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このプロトコルは、蛍光イメージングによるミトコンドリアのカルシウムフラックスのリアルタイム測定のための方法を説明します。方法は、選択的にミトコンドリアで発現する循環permutated YFPベースのデュアル励起レシオメトリックカルシウムセンサー（レシオメトリックpericam -...

遺伝的にコードされたカルシウムのセンサを用いたアポトーシス時のミトコンドリア内カルシウム濃度の動的変更の監視

単離ミトコンドリアマウス心臓におけるミトコンドリア透過性遷移孔の開口部を測定するための分光蛍光プロトコルがここに提示されます。アッセイは、ミトコンドリアCaの同時測定を含む...

単離ミトコンドリアマウス心臓における透水性遷移孔の開口部のマルチパラメータ測定

このビデオでは、単離されたミトコンドリアにおけるミトコンドリアカルシウムの取り込みを測定するためのプレートリーダーベースのアッセイについて説明しています。このアッセイは、カルシウム感受性蛍光色素の蛍光シグナルを解析し、ミトコンドリアのカルシウム取り込みとカルシウム過剰の動態を研究します。...

ミトコンドリアカルシウム取り込みアッセイ:単離されたミトコンドリアにおけるカルシウム取り込みを測定するためのプレートリーダーベースの方法

このビデオでは、培養細胞におけるミトコンドリアカルシウムの取り込みを測定するための共焦点顕微鏡イメージングベースのアッセイについて説明しています。このアッセイでは、カルシウム感受性蛍光色素Rhod-2/AMを使用して、透過処理された培養細胞のミトコンドリアカルシウムを測定します。...

培養細胞におけるミトコンドリアカルシウム取り込みを測定するためのカルシウム注入アッセイ

このビデオは、ミトコンドリアがカルシウムを吸収する際の蛍光のリアルタイムな変化を監視することにより、ミトコンドリアのカルシウム保持能力を評価する手順を示しています。このアッセイは、ミトコンドリアの機能や、アポトーシスや神経変性疾患などのカルシウム関連プロセスの研究に役立ちます。...

単離されたミトコンドリアのカルシウム保持能力の決定

ミトコンドリアは、それらが細胞内の細胞質ゾルのCa 2+シグナル伝達を形成することができ、カルシウム（Ca 2+）隔離する彼らの内膜（ΔΨm）を横切って電気化学ポテンシャルを利用することができます。我々は、同時に、蛍光色素、共焦点顕微鏡を使用して、生細胞中のミトコンドリアの Ca 2+取り込みおよびΔΨmを測定するための方法を記載します。...

蛍光顕微鏡による生細胞内のミトコンドリアのカルシウムとミトコンドリア膜電位の同時測定

ここでは、ミトコンドリアの分離および培養細胞のミトコンドリアの Ca2 +流入の測定のための 2 つのプロトコルを提案する.我々 のプレート リーダー ベース Ca2 +インポート詳細分離ミトコンドリアの試金を使用して、Ca2 +敏感なカルシウム グリーン-5N を染めます。培養細胞の Ca2 +染料ロード-2/AM...

ミトコンドリアの分離と培養細胞におけるミトコンドリアのカルシウム流入の解析

本研究では、マイクロプレートベースの呼吸法と組み合わせて組み換えパーフリンゴライシンOを用いてミトコンドリア呼吸基質フラックスを試験する改変プロトコルについて説明する。このプロトコルを用いて、メトホルミンが2つの異なる腫瘍細胞株のミトコンドリア呼吸にどのように影響するかを示す。...

組換えペルフリンゴライシンO-透過細胞におけるミトコンドリア基質フラックスの測定

このプロクトーコルは、アストロサイトおよびニューロン におけるインビトロ および インビボ ミトコンドリアCa2+...

遺伝子組み換えCa2+ 指標(GEC)を用いたアストロサイトとニューロンのイメージングミトコンドリアCa2+ 取り込み

このプロトコールは、部分的にセグメント化された機能的CoQプールの存在を研究するために、Na+の存在または非存在下でのミトコンドリア複合体活性CI+ CIIIおよびCII +...

Na+ に対するミトコンドリア内膜感受性が部分的にセグメント化された機能的CoQプールを明らかにする

ここでは、分子状酸素を消費する能力とは無関係に、哺乳類細胞のミトコンドリア機能を直接測定するためのアッセイをまとめたものです。...

哺乳類のミトコンドリア機能を測定するための酸素非依存性アッセイ(英語)

学ぶミトコンドリアのCa²⁺保持容量測定法とCa²⁺誘導膨潤アッセイ。SH-SY5Y細胞由来ミトコンドリアを用い、蛍光分光法でミトコンドリア機能障害とエネルギー代謝異常を評価する。

ミトコンドリアの Ca^{2 +}保持容量測定と Ca^{2 +}-ミトコンドリアの膨潤アッセイをトリガー

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