Name: 可視化とアデノ随伴ウイルスと共焦点顕微鏡を用いた脊髄脳スライスにおけるオリゴデンドロ サイト オルガネラのライブ イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 学ぶ 共焦点顕微鏡とアデノ随伴ウイルスを用いた脊髄脳スライスにおけるオリゴデンドロサイトミトコンドリアのライブイメージング手法。この方法により、オリゴデンドロサイトの構造とオルガネラ動態を詳細に観察できます。

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リンダ ヒルデガルト Bergersen とアクセス用 Magnar Bjørås 細胞研究室と装置、プラスミドのウイルス産生 Janelia 分子生物学共有リソース スタッフ、レーザー パワー測定について公園 Vervaeke に感謝しますノルウェーの健康協会、ノルウェーの研究評議会によって資金が供給されたこの作品、顕微鏡装置 Norbrain によって資金を供給されました。

<ol><li>Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+organization+of+oligodendrocyte+processes+during+development+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neursosci%22%5BJournal%5D)">Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo.</a> Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).</li>
<li>Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+density+distribution+of+endoplasmic+reticulum+proteins+and+mitochondria+at+specialized+Ca2%2B+release+sites+in+oligodendrocyte+processes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">High density distribution of endoplasmic reticulum proteins and mitochondria at specialized Ca2+ release sites in oligodendrocyte processes.</a> J. Biol. Chem. 272, 22654-22661 (1997).</li>
<li>Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+mitochondrial+transport+and+Parkin-independent+degeneration+of+respiratory+chain-deficient+dopamine+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1080, 12937-12942 (2011).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>De Simoni, A., Yu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures%3A+interface+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method.</a> Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).</li>
<li>Lim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+Schwann+cell+myelination+by+third+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).</li>
<li>Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+myelin+in+the+vertebrate+central+nervous+system+using+third+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy.</a> Biophys. J. 100, 1362-1371 (2011).</li>
<li>Fu, Y., Wang, H., Huff, T. B., Shi, R., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+imaging+of+myelin+degradation+reveals+a+calcium-dependent+pathway+in+lyso-PtdCho-induced+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of myelin degradation reveals a calcium-dependent pathway in lyso-PtdCho-induced demyelination.</a> J. Neurosci. Res. 85, 2870-2881 (2007).</li>
<li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nat. Med. 20, 443-449 (2014).</li>
<li>Shin, J. H., Yue, Y., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+adeno-associated+viral+vector+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recombinant adeno-associated viral vector production and purification.</a> Methods Mol. Biol. 798, 267-284 (2012).</li>
<li>Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide-directed+mutagenesis+without+phenotypic+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Prot.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide-directed mutagenesis without phenotypic selection.</a> Curr. Prot. Neurosci. , 4.10.1-4.10.6 (2001).</li>
<li>Gow, A., Friedrich, V. L. Jr, Lazzarini, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+basic+protein+gene+contains+separate+enhancers+for+oligodendrocyte+and+Schwann+cell+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Myelin basic protein gene contains separate enhancers for oligodendrocyte and Schwann cell expression.</a> J. Cell Biol. 119, 605-616 (1992).</li>
<li>Rinholm, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+and+structure+of+mitochondria+in+oligodendrocytes+and+their+myelin+sheaths%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Movement and structure of mitochondria in oligodendrocytes and their myelin sheaths.</a> Glia. 64, 810-825 (2016).</li>
<li>Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+decreases+mitochondrial+size+and+movement+in+primary+forebrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons.</a> J. Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).</li>
<li>Jackson, J. G., O'Donnell, J. C., Takano, H., Coulter, D. A., Robinson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+and+glutamate+uptake+decrease+mitochondrial+mobility+in+astrocytes+and+position+mitochondria+near+glutamate+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters.</a> J. Neurosci. 34, 1613-1624 (2014).</li>
<li>Macaskill, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miro1+is+a+calcium+sensor+for+glutamate+receptor-dependent+localization+of+mitochondria+at+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses.</a> Neuron. 61, 541-555 (2009).</li>
<li>Karadottir, R., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+patch-clamping+of+cells+in+brain+slices+with+immunocytochemical+labeling+to+define+cell+type+and+developmental+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage.</a> Nat. Protoc. 1, 1977-1986 (2006).</li>
<li>Rinholm, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+oligodendrocyte+development+and+myelination+by+glucose+and+lactate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of oligodendrocyte development and myelination by glucose and lactate.</a> J. Neurosci. 31, 538-548 (2011).</li>
<li>Davison, A. N., Dobbing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+as+a+vulnerable+period+in+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+Med.+Bull%22%5BJournal%5D)">Myelination as a vulnerable period in brain development.</a> Br. Med. Bull. 22, 40-44 (1966).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Noraberg, J., Kristensen, B. W., Zimmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+for+neuronal+degeneration+in+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures.</a> Brain Res. Protoc. 3, 278-290 (1999).</li>
<li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+for+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).</li>
<li>Pignataro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-Associated+Viral+Vectors+Serotype+8+for+Cell-Specific+Delivery+of+Therapeutic+Genes+in+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Adeno-Associated Viral Vectors Serotype 8 for Cell-Specific Delivery of Therapeutic Genes in the Central Nervous System.</a> Front. Neuroanat. 11 (2), (2017).</li>
<li>Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yanez-Munoz, R. J., Moon, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticospinal+tract+transduction%3A+a+comparison+of+seven+adeno-associated+viral+vector+serotypes+and+a+non-integrating+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Corticospinal tract transduction: a comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector.</a> Gene Ther. 19, 49-60 (2012).</li>
<li>Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+composition+of+molecular+motors+on+moving+axonal+cargo+using+cargo+mapping+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using cargo mapping analysis.</a> J. Vis. Exp. (92), e52029(2014).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

ここで説明した切片の文化を作るためのプロトコルは・ デ ・ シモーニと優 (2006 年)5で記述されたプロトコルの修正版18です。最も重要な変更は、以下に概説されています。Tris バッファーは、ウイルス伝達の間にインキュベーター外スライスの生存率と細胞培地の変更を向上させる文化メディアに追加されます。紙吹雪の殺菌のプロシージャも変更されます。他のプロトコルは、オートクレーブに入れることによって紙吹雪を殺菌しながらお勧めしませんこのカールに紙吹雪のいくつかを引き起こすので。これらの成長のスライスは健康ではないがちとカールの紙吹雪を使用しないでください。私たちプロトコル マウスを使用して、ないラット、および海馬ではなく野の文化へ変更我々 を見つけるは薄くスライス (230 μ m 対 300 μ m) で十分に働きます。生後から作られたマウスおよびラット19文化 10-20 周辺髄鞘形成のピークとしてマウス p7 9 (と、11-14 日の培養)、ミエリンオリゴデンドロ サイトを勉強して最適です...

脳の白質は神経細胞の軸索が髄鞘、オリゴデンドロ サイトによって形成された特殊な拡張プラズマ膜に包まれたので構成されます。髄鞘が高速かつ信頼性の高い活動電位伝搬と有髄軸索の長期的な生存のため必要と髄鞘の損失は、神経機能障害を引き起こす可能性が。その重要性にもかかわらずオリゴデンドロ サイトのプロパティは、あまり知られてに比べニューロンとアストロ サイト。その結果、オリゴデンドロ サイトを勉強の少ないツールを開発されています。
生きるイメージング細胞小器官のミトコンドリア、endoplasmatic 小胞体 (ER) や小胞構造の異なる時間の経過とともに細胞小器官のダイナミックな変化を研究することができます。伝統的に、リビングのオリゴデンドロ サイトのイメージングをモノカルチャー1,2で行った。単作のオリゴデンドロ サイトはコンパクトなミエリンを表示しないし、切片または急性脳スライスが、局在と細胞内小器官の動きを勉強するときにしたがってより良いオプションをことがあります。細胞小器官と髄鞘蛋白の局在は有髄の軸索と周囲の髄鞘の間の短い距離のために挑戦することができます。したがって、光顕微鏡による免疫染色の手順だけでは、有髄軸索のミエリン鞘の細胞小器官とを区別するため空間分解能を持っていません。これは、細胞型-特異的発現プロモーターによって駆動される細胞小器官をターゲットとした蛍光タンパク質の遺伝子をウイルスの伝達によって解決できます。利点は、オルガネラ局在とダイナミクスの正確な評価を可能にする細胞特異とスパース表現です。トランスジェニック動物は、このような細胞小器官をターゲットとしたセル固有の式3を達成するためにも使用できます。しかし、生産やトランスジェニック動物のメンテナンスは高価です、通常ウイルスの方法によって達成することができますスパース表現を提供していません。
記載されているメソッドはここ (MBP 水戸下流か MBP 水戸 GFP) を視覚化するミエリン塩基性タンパク質プロモーターによって駆動されるミトコンドリアをターゲットとした蛍光蛋白質 (下流または緑色蛍光タンパク質 GFP) とオリゴデンドロ サイトのウイルスの伝達を使用します。脊髄脳スライスにおけるオリゴデンドロ サイト ミトコンドリア。さらに、別の蛍光蛋白質 (GFP 水戸した dsred と併用または水戸 GFP を使用 tdtomato) 細胞質内の式は、髄鞘の細胞コンパートメントを含む細胞形態の可視化を有効にするためです。プロトコルには、脊髄の脳のスライス (・ デ ・ シモーニとゆう、2006年4,5で記述されたプロトコルの修正されたバージョン) を行うための手順が含まれています。我々 はミトコンドリアの動きを研究するためタイムラプス イメージング手順を説明します。この手順は、イメージング メディア、イメージング中に薬やその他の媒体の変更の簡単なアプリケーションを可能にするセットアップの継続的な交流と直立した共焦点顕微鏡を使用します。タイムラプス イメージング手順は、以下のように生活のスライスを維持するためのいくつかの余分な機器と、共焦点顕微鏡で実行できます。プロトコルには、画像を最適化し、毒性を削減するいくつかのヒントも含まれています。
最後に、共焦点反射顕微鏡 (コア) 無染色ミエリンを視覚化するための迅速かつ簡単な方法を説明します。これは、ライブ イメージング中に髄鞘を識別することができます。近年、いくつかのテクニックは、必要な任意の染色することがなくイメージ ミエリンに開発されているが、これらのほとんどは、特定機器と専門知識6,7,8を必要とします。ここで説明する手順ミエリン鞘の反射のプロパティを使用して、分光共焦点の顕微鏡検査の簡略化された単一励起波長バージョン (スコアは、いくつかのレーザーの波長はミエリンを視覚化する結合されます)9. コアは、488 nm レーザーと 470 500 nm バンドパス排出フィルターまたは可変発光フィルター、共焦点顕微鏡で行うことができます。

<table><tbody><tr><td>アガロース&nbsp;</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>BD Microlance 19G</td><td>BD</td><td>301500</td> 二酸化ガスAGAの<td>浴室および出口に使用される針</td></tr><tr><td></td><td>AGA</td><td>105701</td><td></td></tr><tr><td>ブランドのピペット電球</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z615927</td><td>ピペット電球</td></tr><tr><td>ブンゼンバーナー(液体プロパンバーナー)</td><td>VWR</td><td>89038-530</td><td></td></tr><tr><td>ヒーターコントローラー用ケーブルアセンブリ</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>〒64-0106&nbsp;</td><td>温度調節器 - 温度計部品</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fluka</td><td>21100</td><td></td></tr><tr><td>CO2&nbsp;</td><td>AGA</td><td>100309</td><td>CO2 インキュベーター用</td></tr><tr><td>カバーガラス、正方形 コーニング</td><td>サーモ&nbsp;Fischer Scientific</td><td>13206778</td><td>ライブイメージング用の浴槽下に取り付けます。接着剤またはワセリンゼリーで密封します。</td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース</td><td>シグマ</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>デリケートな鉗子</td><td>ファインサイエンス</td><td>11063-07</td><td>解剖用</td></tr><tr><td>ダイヤモンドスクライバーペン</td><td>テッド・ペラ社</td><td>54463</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てガラス パスツールピペット 230 mm</td><td>VWR</td><td>612-1702</td><td>ガラスピペット</td></tr><tr><td>両刃ステンレス鋼 カミソリ刃</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>#7200</td><td>ビブラトーム用カミソリ刃</td></tr><tr><td>アールズバランス塩溶液 (EBSS)</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>24010-043</td><td></td></tr><tr><td>濾紙サークル</td><td>シュライヒャー &Schuell</td><td>300,220</td><td>PFAのろ過に使用される濾紙</td></tr><tr><td>ファンタック</td><td>ロックタイト</td><td>1270884</td><td>バスのインとアウトレットの位置を接続/調整するために使用</td></tr><tr><td>ハンドタオル Cフォールド 2</td><td>カトリン</td><td>344388</td><td></td></tr><tr><td>ハープ、RC-41チャンバー用フラット</td>、<td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>&nbsp;64-1418</td><td>お風呂で紙吹雪を押さえるハープ。オルガノタイプスライスで使用する前に、ひもを切り取ります。1.5 mm、13mm、SHD-41/15</td></tr><tr><td>HEPES、FW:260.3</td><td>Sigma</td><td>H-7006</td><td></td></tr><tr><td>Holten LaminAir、モデル1.2</td><td>Heto-Holten</td><td>96004000M</td><td>層流フード</td></tr>馬<tr><td>血清、熱不活性化</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>LCRメンブレン、PTFE、&nbsp;</td><td>ミリポア</td><td>FHLC0130</td><td>コンフェッティ&nbsp;</td></tr><tr><td>ライカ VT1200</td><td>ライカ</td><td>14048142065</td><td>ビブラトーム</td></tr><tr><td>MEM-グルタマックス with HEPES</td><td>サーモ&nbsp;Fischer Scientific</td><td>42360024</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>R.P. Normapur</td><td>25 108.295</td><td></td></tr><tr><td>マイクロスプーン Heyman Type B</td><td>電子顕微鏡 Sciences</td><td>62411-B</td><td>解剖用の先端が鋭利な小型の丸みを帯びたスパチュラ</td></tr><tr><td>Millex-GPフィルターユニット</td><td>Millipore</td><td>SLGPM33RA</td><td>シリンジフィルターユニット</td></tr><tr><td>ミリセル細胞培養インサート、30 mm</td><td>ミリポア</td><td>PICM03050</td><td>細胞培養インサート</td></tr><tr><td>Minipuls 3 速度制御モジュール</td><td>GILSON</td><td>F155001</td><td>ライブイメージング用蠕動ポンプ - 制御モジュール部 (2 カネルヘッドに接続)</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fluka</td><td>71628</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta Surface</td><td>Thermo&nbsp;フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>140675</td><td>培養プレート</td></tr><tr><td>ナイスタチン懸濁液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1638</td><td></td></tr><tr><td>Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC&nbsp;</td><td>ツァイス</td><td>441452-9900-000&nbsp;</td><td>ライブイメージングに使用される水浸対物レンズ。(WD=2.5mm)、VIS-IR</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>291-1211</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド、粒状</td><td>電子顕微鏡 Sciences</td><td>#19208</td><td></td></tr><tr><td>PC-R 灌流チャンバー</td><td>SiSkiYou</td><td>&nbsp;15280000E</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン、液体</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ 140 mm&nbsp;</td><td>ヘー</td><td>ガー1075</td><td>大型シャーレ&nbsp;</td></tr><tr><td>シャーレ 92x16 mm&nbsp;</td><td>ザルシュテット&nbsp;</td><td>82.1473</td><td>ミディアムシャーレ&nbsp;</td></tr><tr><td>ペトリディッシュ 55x14,2 mm</td><td>VWR</td><td>391-0868</td><td>小型ペトリ皿</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>シグマ</td><td>P4417</td><td>PBS 錠剤</td></tr><tr><td>R2 2 チャネル ヘッド&nbsp;</td><td>ギルソン</td><td>F117800</td><td>ライブイメージング用蠕動ポンプ - 2チャンネルヘッド部(制御モジュールが必要)</td></tr> <tr><td>ラウンド/フラットスパチュラス、ステンレススチール</td><td>VWR</td><td>82027-528</td><td>解剖用大型スパチュラ</td></tr><tr><td>サンドペーパー</td><td>VWR</td><td>MMMA63119</td><td>オプションで、割れたガラスのピペットを滑らかにするための</td></tr> は<tr><td>さみ,&nbsp; 17,5 cm</td><td>ファインサイエンス</td><td>14130-17</td><td>解剖用大型はさみ</td></tr><tr><td>はさみ、8,5&nbsp;</td><td>ファインサイエンス</td><td>14084-08</td><td>小さくて鋭いはさみ for&nbsp; 解剖</td></tr><tr><td>シングルエッジ、宝石ブレード</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>#71972</td><td>シングルエッジカミソリブレード</td></tr><tr><td>シングルインライン溶液ヒーター SH-27B</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>64-0102</td><td>温度コントローラー - ヒーター部</td></tr><tr><td>Steritop-GP フィルターユニット、500 ml、45mm</td><td>ミリポア</td><td>SCGPT05RE</td><td>滅菌するフィルターソリューション</td></tr><tr><td>:瞬間接着剤、精密</td><td>、ロックタイト</td><td>、1577386</td><td></td></tr><tr><td>外科用メスブレード、No.22</td>、<td>Swann Morton Ltd.</td><td>209</td><td>丸みを帯びたメスの刃</td></tr><tr><td>温度調節器 TC324B</td><td>ワーナー・インスツルメンツ</td><td>64-0100</td><td>ライブイメージング用温度調節器(溶液ヒーターとケーブルアセンブリが必要)</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Trizma HCl</td><td>シグマ</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>ウォータージャケットインキュベーターシリーズII</td><td>フォーマサイエンティフィック</td><td>78653-2882</td><td>インキュベーター</td></tr></tbody></table>

可視化とアデノ随伴ウイルスと共焦点顕微鏡を用いた脊髄脳スライスにおけるオリゴデンドロ サイト オルガネラのライブ イメージング

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

神経細胞は、電気絶縁性およびミエリンオリゴデンドロ サイトの栄養サポートに依存します。オリゴデンドロ サイトの重要性にもかかわらず現在ニューロンを研究に使用する高度なツール部分的にしか撮影されているオリゴデンドロ サイトの研究者。セル型固有のウイルスの伝達による染色は、ライブ オルガネラ動態を研究するための有用なアプローチです。本稿での転写の制御の下で対象となるミトコンドリアの蛍光蛋白質遺伝子を運んでいるアデノ随伴ウイルス (AAV) の伝達によって脊髄脳スライスにおけるオリゴデンドロ サイト ミトコンドリアを可視化するためのプロトコルミエリン塩基性タンパク質のプロモーター。コロナ マウス脳切片切片を作るためのプロトコルが含まれています。[ミトコンドリアのタイムラプス イメージングのための手順に従います。これらのメソッドは、他の細胞器官に転送することができ、特に髄鞘の細胞小器官を調べる場合に役立ちますがあります。最後に、共焦点反射顕微鏡 (コア) による生活のスライスで無染色のミエリンの可視化を容易に利用できる手法について述べる。コアは、余分な機器を必要としないとライブ イメージング中に髄鞘を識別することができます。

脊髄脳スライス培養され、上記のように導入は、mito_dsred と GFP を表現する皮質のオリゴデンドロ サイトの疎な分布を示した。Olig2 および MBP 抗体で免疫染色式がオリゴデンドロ サイト (図 1) に固有であることを確認しました。
ライブ イメージングのため導入されたオリゴデンドロ サイトは並行 (図 1および図 2 a) を実行しているいくつかのミエリン鞘の彼らの特徴的な形態によって認識されました。導入されたオリゴデンドロ サイトのタイムラプス イメージングを実行すると、プライマリ プロセスとミエリン鞘 (図 2 b-D) 内のミトコンドリアの動きを監視すること...

ミエリンオリゴデンドロ サイトは、迅速な活動電位伝搬と神経細胞の生存を促進します。ここで説明した、切片蛍光タンパク質のオリゴデンドロ サイト固有表現のプロトコルです以降のタイムラプス イメージングと脳スライス。さらに、無染色のミエリンを可視化するための簡単な手順が表示されます。

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

このウイルス導入およびタイムラプス記録の全体的な目的は、臓器培養脳スライスにおけるオリゴデンドロサイトのミトコンドリアの動きを可視化することです。この手法は、オリゴデンドロサイトおよびその細胞小器官が局所的な環境変化にどのように反応するかなど、オリゴデンドロサイト分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。本手法の主な利点は、あらゆる種類の脳細胞が存在し、オリゴデンドロサイトが緻密なミエリンを形成している条件下で、オリゴデンドロサイトの構造と細胞小器官のダイナミクスに関する詳細な情報を得られることです。in vitro 7日目のスライス培養において、オリゴデンドロサイトにウイルスを導入します。まず、スライス1枚あたり1.3 µLの希釈済みAAVを吸引します。ピペットチップの外側が乾いていることを確認し、チップがスライスに触れない限り限り近づけて皮質の上に保持し、ゆっくりと溶液を押し出します。溶液がスライスに触れたら、ピペットチップを皮質上で動かし、溶液を皮質領域全体に広げます。1つのディッシュ内のすべてのスライスへの導入が完了したら、ディッシュをインキュベーターに戻し、他のディッシュでも同様の操作を繰り返します。蛍光マーカーの発現を確認し、発現レベルが十分で、スライスが健全な状態であるときにイメージングを行います。45度に曲げた注射針を模型用粘土で固定し、イメージングバスのセットアップを開始します。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

ここでは、視覚野の神経細胞とグリア細胞の蛍光標識用AAVベクターの頭蓋内注射を提示する。...

アデノ随伴ウイルスベクターの頭蓋内注射

このプロトコルは、吻側渡り鳥ストリームにおける出生後の脳および神経芽細胞の遊走の高解像度のタイムラプスイメージングに最適化された器官スライスのアッセイを説明します。...

出生後の脳における神経細胞の移動の高分解能タイムラプスイメージングのための器官型スライスアッセイ

出典:Kennedy, L. H., et.al. アデノ随伴ウイルスと共焦点顕微鏡を用いた器官型脳スライスにおけるオリゴデンドロサイトオルガネラの可視化とライブイメージング。J. Vis. Exp.

器官型脳スライス培養におけるオリゴデンドロサイト内のミトコンドリア運動の共焦点イメージング

出典:Moye, S. L., et.al.Lucifer Yellow Iontophoresis. J. Vis. Exp. (2019).

固定マウス脳スライスにおける蛍光色素イオントフォレーシスを用いたアストロサイト形態の可視化

前脳と小脳のスライス培養システムを使用してNG2細胞とオリゴデンドロサイトを研究する技術が説明されています。...

オリゴデンドロサイトダイナミクスと髄鞘形成を研究するための器官型スライス培養

炎症性脱髄障害の皮質病変における脱髄とニューロンのアポトーシスのメカニズムに対処するために、異なる動物モデルが使用されます。ここでは、オリゴデンドロサイト特異的なCD8+ T細胞を脳切片に使用して、オリゴデンドログリアとニューロンの死をもたらすex...

アンエクスビボモデル

提示し、培養するため変更されたロール チューブ法をここでは、フォトエッチング coverslips...

密閉システムで脳スライスの長期培養中に正確にローカライズされた、反復的な断続的なイメージングのため変更されたロール チューブ法

マウス前脳の組織図スライス培養における遺伝的にコードされたFRETベースのセンサATeam1.03YEMKの細胞型特異的発現に関するプロトコルについて説明する。さらに、ニューロンおよびアストロサイトにおける細胞ATPレベルの動的イメージングにこのセンサを使用する方法を示す。...

FRETベースのセンサATeam1.03YEMKを用いたマウス脳の組織組織スライスにおける細胞内ATPのイメージング

ここでは、出生後のマウス網膜外植体における神経突起形態形成をタイムラプス共焦点顕微鏡により調べる方法を提示する。我々は、膜標的蛍光タンパク質を Cre依存的に発現する組換えアデノ随伴ウイルスベクターを用いた網膜細胞型の疎標識および取得およびそれらの微細プロセスのためのアプローチを説明する。...

遺伝子標的網膜細胞集団のスパースアデノ随伴ウイルス標識を用いた神経樹木化のタイムラプスイメージング

ここでは、覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動を同時にイメージングするためのアデノ随伴ウイルス注入と頭蓋窓移植を組み合わせたプロトコルについて説明します。...

覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動の同時イメージング

学ぶ 共焦点顕微鏡とアデノ随伴ウイルスを用いた脊髄脳スライスにおけるオリゴデンドロサイトミトコンドリアのライブイメージング手法。この方法により、オリゴデンドロサイトの構造とオルガネラ動態を詳細に観察できます。

可視化とアデノ随伴ウイルスと共焦点顕微鏡を用いた脊髄脳スライスにおけるオリゴデンドロサイトオルガネラのライブイメージング

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可視化とアデノ随伴ウイルスと共焦点顕微鏡を用いた脊髄脳スライスにおけるオリゴデンドロ サイト オルガネラのライブ イメージング

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可視化とアデノ随伴ウイルスと共焦点顕微鏡を用いた脊髄脳スライスにおけるオリゴデンドロサイトオルガネラのライブイメージング