調査cruzi トリパノソーマの原因運動In Vivo動物モデルとしてのゼブラフィッシュ稚魚の確立

この手順の全体的な目標は、ゼブラフィッシュをトリパノソーマ・クルージの運動性を研究するためのin vivoモデルとして確立することです。Trypanosoma cruziは、シャーガス病を引き起こす寄生虫です。これは、主にラテンアメリカおよび米国の一部の地域で媒介生物を介して伝染する顧みられない熱帯病です。

寄生虫は、感染部分を含むベクター糞便によってヒトに感染し、宿主細胞内で複製されます。べん毛の動きにより、寄生虫は体内を移動することができます。しかし、細胞浸潤における付着にも不可欠です。

Trypanosoma cruziのin vivo感染モデルは、主にげっ歯類にあります。仕事は不透明さを教え、動物内部の寄生虫を追うことを複雑にします。寄生虫の運動性は、これまでin vitroでしか研究されていなかったため、in vivoモデルにより、流動条件下での寄生虫の移動の重要な側面を理解することができます。

別のモデルを探していたところ、ゼブラフィッシュの幼生を見つけました。ゼブラフィッシュの幼生は、in vivoで宿主病原体の相互作用を研究するための強力なモデルです。彼らは小さくて安く、マウスに比べて育てるのが非常に簡単です。

研究にとって非常に重要なことは、彼らの免疫システムが人間と非常に似ているということです。彼らの適応免疫システムは、受精後4日でなければ発達し始めず、その後4週間で成熟するため、免疫の干渉を受けずに働くための非常に大きな時間が得られます。しかし、私たちの研究におけるゼブラフィッシュの最大の利点は、その光学的透明性です。

これにより、顕微鏡によるスクリーニングやイメージングに理想的なモデルとなっています。これは、魚を遺伝的に操作するすべての技術、および利用可能なすべてのトランスジェニックおよび突然変異株と組み合わせることで、研究するための多くの可能性を本当に提供します。このビデオでは、色素沈着がないため完全に透明なCasper系統の突然変異幼虫を使用して、in vivoでT.cruzi寄生虫を視覚化する方法を示します。

このゼブラフィッシュの内部を可視化するために、ライトシート蛍光顕微鏡を用いています。ライトシート蛍光顕微鏡は、検出対物レンズの焦点面のみを照らす一連の技術です。その結果、前景や背景に光が入らなくなり、胚の奥深くまで鮮明な画像が得られます。

気になるサンプルの部分だけが照らされているため、サンプルの写真による損傷が大幅に減少し、長時間のビデオを撮影できます。ここでは、ゼブラフィッシュの幼生の中にいる生きたT.cruzi寄生虫を可視化します。ライトシートの性質により、共焦点顕微鏡と比較して、優れた空間的および時間的解像度で高速ビデオを撮影できます。

私たちが知る限り、生きたトリパノソーマは生きた生物の内部で視覚化されたことはありません。注射の3日前に、健康なオスとメスの魚のペア、または1匹のオスと2匹のメスを繁殖水槽に交配させて、総産卵量を増やします。テキストプロトコルに従って、小さなストレーナーを使用してスポーンした卵を収集します。

ストレーナーをひっくり返し、ストレーナーを通して卵の水をペトリ皿に注いで卵を洗い流します。胚を健康に保つには、転写プラスチックピペットで破片や未受精卵を取り除き、水をきれいにします。次に、胚を摂氏28度のインキュベーターに入れ、3時間ごとに洗浄手順を繰り返して、生存不能な卵子を廃棄し、クラッチを健康に保ちます。

受精後48時間または2日後に、ほとんどの胚が孵化したことを確認します。ただし、必要に応じて、2つの鋭い鉗子で絨毛膜の反対側の端をつかみ、一方の端からそっと引っ張って引き裂くことにより、ステレオスコープの下で胚を脱毛します。トランスファーピペットを使用して、絨毛膜を水から取り除きます。

注射には、まず薄肉ガラスキャピラリーとマイクロピペット極性デバイスを使用して1ミリメートルの針を準備します。密封された針をシャーレに入れ、モデリング粘土のストリップに保管します。マイクロインジェクションモールドを作成するには、蒸留水に1.5%アガロース溶液を準備し、それをペトリ皿に注ぎます。

次に、アガロースの上にプレハブの幼虫マイクロインジェクションモールドを置き、平らな表面上で室温で完全に固化させます。マイクロインジェクションモールドを持ち上げて取り出し、摂氏4度で保存するための水を追加します。これにより、アガロースの乾燥を防ぎます。

適切な量のトリカインストックに卵水を加えて麻酔液を調製し、最終濃度が1リットルあたり150ミリグラムになるようにします。溶液を摂氏4度で保存します。最後に、低融点アガロース粉末を卵水に最終濃度1%まで溶解することにより、イメージング用の低融点アガロースのストックを準備し、アガロース溶液が均一になるまで混合物を加熱し、1.5ミリリットルの反応チューブに4度でアリコートを保存します。

寄生虫は、Trypanosoma cruzi 01/DA分離株から得られ、ヒト星状細胞腫細胞株で培養され、T25フラスコを使用して完全な培地が補充されます。培養の3〜4日後、寄生虫は細胞から飛び出し、上清からトリポマスティゴートを収集することができます。この上清を5分間遠心分離し、子牛胎児血清と共にペレットを1X PBSに穏やかに再懸濁します。

次に、5分間遠心分離し、上清を捨てて、1ミリリットルのPBSに再懸濁します。ノイバウアーチャンバー内の自由遊泳寄生虫を数えるために10マイクロリットルを取ります。残りの再懸濁寄生虫を採取し、1マイクロリットルのCFSEを加え、室温で10分間インキュベートします。

次に、PBSを追加して10ミリリットルを完成させます。5分間遠心分離し、上清を捨て、標識された寄生虫を含むペレットを100マイクロリットルのPBSに再懸濁します。この標識手順の後、逆蛍光顕微鏡で寄生虫を直接視覚化することにより、寄生虫が生きており、適切に標識されていることを確認することが重要です。

透過光モードで、寄生虫が動くことを確認します。蛍光モードでは、feet-seeフィルターを使用して寄生虫の標識を評価します。まず、マイクロローダーピペットチップを使用して、密封されたガラス針に寄生虫を含む溶液10マイクロリットルをロードします。

次に、ガラス針をマイクロマニピュレーターのニードルホルダーに挿入します。ステレオスコープの下で、細い鉗子を使用して針の先端から約5ミリメートルを切り取ります。次に、受精後48時間の幼虫をトリカイン溶液で麻酔し、触れても反応しなくなるまで

幼虫をアガロースプレートのステレオスコープの下の横位置に置きます。針の先端が幼虫の卵黄の中心にくるようにマイクロマニピュレーターを調整します。マイクロインジェクターのパラメータを設定します。

卵黄の血液循環谷に魚を注入します。心臓が鼓動していることを確認し、幼虫をすぐに新鮮な卵水に移して回復させます。注入した胚を空のシャーレに移し、プラスチックピペットと吸収紙で周囲の水分を慎重に取り除きます。

すぐに約100マイクロリットルの予熱された1%低融点アガロースを胚を覆うために加えます。アガロースが摂氏40度を超えていないことを確認してください。ガラスキャピラリーの内側に直線ワイヤーを挿入し、それをプランジャーとして使用して胚を垂直位置に取ります。

これは、アガロースが固まる前に迅速に行う必要があります。アガロースを吸収している間は、胚の上にアガロースを残し、固まるまで待ってください。必要に応じて、胚の下の余分なアガロースを押し出し、切り取ります。

試料チャンバーにトリカイン溶液を充填し、試料チャンバーの温度を摂氏28度に設定します。次に、胚の入ったキャピラリーを顕微鏡サンプルホルダーに挿入し、マイクロマニピュレーターステージに置きます。胚がぶら下がるまで、胚を含む端を押し出します。

透過光モードでは、XYZマイクロマニピュレータシステムと回転ステージを使用して、サンプルを検出対物レンズの瞳孔の前に配置して、垂直軸を中心に回転させます。最初に毛細血管の境界に焦点を合わせ、次に胚と心臓や血管系などの関心のある構造を見つけるために移動することが有用です。488ナノメートルまたは同様の波長のレーザーを使用して、蛍光モードに変更し、照明強度と露光時間を調整して、光の退色を減らし、時間分解能を最適化します。

このためには、開口数が良好な対物レンズを選択する必要があります。対象領域のビデオ取得を開始します。私たちの場合、寄生虫は弁に付着し、心臓の周りを自由に動き回っているのが観察されます。

1つの平面を経時的にビデオに撮るか、マイクロマニピュレータまたはピエゾおよびガルボシステムを使用して、さまざまな平面に焦点を合わせ、寄生虫の動きを追跡することをお勧めします。取得が完了したら、細い鉗子とヘアループツールを使用して、胚をアガロースから慎重に取り出します。魚を新鮮な卵の水に戻し、15分間回復を確認します。

その後、所属機関の標準プロトコルに従って廃棄します。ここで紹介するすべての手順について、受精後48時間の胚を使用しました。寄生虫の接種にはさまざまな解剖学的部位を使用できますが、キュビエの卵黄嚢または管の血液循環谷は、心血管系に注射してアクセスするのに最も速く、最も簡単な領域です。

Trypanosoma cruziをCuvierの管に注射してから8〜10分以内に、寄生虫は発達中の心血管系で観察されます。.一部の寄生虫は、胚性卵黄嚢の壁または房室弁などの心臓構造に付着したままです。寄生虫は心臓の収縮を伴って振動しているのが見られ、これはその効果的な付着メカニズムを示しています。

また、寄生虫は血流とともに赤血球と同じ方向に心膜腔内や血管内を漂っているのが見られます。今回開発した手法は、透明なゼブラフィッシュの幼生に潜むT.cruzi寄生虫の生体内観察を可能にしました。これは、生きた脊椎動物の血液や心臓の構造を通じた運動性など、病原体のダイナミクスを視覚化し、分析するのに非常に役立ちます。

自由遊泳寄生虫を見るためには、注射から可視化までの時間を短くすることが重要です。また、ライトシート顕微鏡を使用しながら取得パラメータを最適化し、写真の損傷を減らしながら高品質の画像を取得することも重要です。ゼブラフィッシュの幼生におけるT.cruziマイクロインジェクションは、血流中の寄生虫に接種するための効果的な技術です。

この方法では、寄生虫のCFC標識を、魚の内部の寄生虫を明確に視覚化できる実用的な手順として見ました。キュビエの管への注射は、寄生虫が循環するのを確実にするための穏やかな方法です。T.cruziは、心臓の弁や魚の大きな血管に付着する傾向があります。

しかし、私たちの実験によれば、細胞感染はありません。そのトロペジーを解明するためには、さらなる研究が必要である。