Name: 哺乳類細胞における地上州枯渇超解像イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-05T08:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 学ぶ地上州枯渇超解像イメージングを用いた哺乳類細胞の膜タンパク質可視化と定量法。従来の蛍光顕微鏡と比較して約10倍の解像度向上を実現し、細胞生物学および膜生物物理学研究におけるタンパク質分布の精密解析に貢献します。

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この作品は、R.E.D. (15SDG25560035) に、AHA からの助成金によって支えられました。著者は、彼のライカ SR GSD 3 D 顕微鏡の使用のための博士フェルナンド ・ サンタナと FP1 抗体を提供する親切博士ヨハネス ・地獄を認めたいと思います。

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</ol>

著者は開示する競合する興味を持ってないです。

回折限界を超えたイメージングを可能にする技術の最近の爆発は、哺乳類細胞の空間と時間におけるシグナル伝達の複雑さに新しいウィンドウを提供しています。これらのテクノロジには、嵐、STED、パーム、GSD、SIM、亜種 (例えばdSTORM、FPALM) が含まれます。これらの技術の背後にある科学者たちの創意工夫は、光の回折現象を支配する物理学の法則によって課された制限を回避するために私たちができました。にもかかわらずこの巨大な成果は、各技術の超解像を達成するために妥協のいくつかの並べ替えになりますそしてなどの制限があります。細胞生物学者ととらわれるが追求する理想的な状況はないの退色で、高速の捕捉、高解像度、最適感度。さらに、動物からセルを削除する我々 は本質的にそれらを変更して、分子動力学を変更する可能性があることを常時 1 つ必要があります。したがって、動的、可能にする超解像技術を開発するクエスト ライブ セル、生きて動物における単一分子イメージングに行きます。今のところ、我々 は回折限界解像度で 10 倍改善で画像を生成することができます私達の処分でツールを持っています。この記事で曲げ・軸方向寸法の 20 と 50 n...

細胞内シグナル伝達反応は、細胞応答を開始する内部および外部環境の変化を変換します。彼らは、ホルモン、伝達物質の放出、ハートビート、ビジョン、受精、そして認知機能のための基礎として、人間の生理機能のすべての側面を調節します。これらのシグナル伝達カスケードの混乱は、がん、パーキンソン病、アルツハイマー病などの病態生理学的条件の形で深刻な影響を持つことができます。何十年も、生物的および医学研究者使用している正常に蛍光蛋白質、プローブ、およびプライマリ ツールとして蛍光顕微鏡と相まってバイオ センサー細胞のこれらの精密な時空構造を理解するには通知します。
落射蛍光、共焦点、または内部全反射 (TIRF) 蛍光顕微鏡などの光学技術の強みは、その感度、速度、および生細胞イメージング、主要な制限は、互換性の回折限界解像度、意味構造または 200-250 nm より小さい蛋白質の複合体を解決できません。確定的な超解像の理論と実践の開発 (例えば、誘導放出の枯渇顕微鏡 (STED1) 構造化照明顕微鏡を用いて (SIM2) または確率超解像 (など、センサー局在基底状態や顕微鏡 (パーム3) 枯渇 (GSD4,5))、蛍光顕微鏡で曲げ・軸方向の解像度は、のために回折の障壁を超えて拡張されています。数十ナノメートル。したがって、調査官は今、視覚化し、タンパク質のダイナミクスと組織に近く分子レベルで関数に変換する方法を理解する比類のない能力を持っています。
知られているでは基底状態の枯渇顕微鏡戻り個々 の分子が続く (GSDIM) または単に GSD、fluorophores が付いて4,5を同時に発光の数を減らすことによって回折限界を回避します。高エネルギー レーザー光を使用して、励起蛍光ラベル サンプル、光子と電子の砲撃と確率 'スピン反転' を受ける、4励起状態から三重項または '暗状態' を入力します。これは効果的に基底状態を使い果たす、それ故に名前「地上州枯渇'。三重項状態のフルオロは光子を放出しないし、サンプルが暗く表示されます。ただし、これら fluorophores が付いては確率的基底状態に戻り、三重項状態に戻る前に地上へ励起状態の遷移を発光いくつかの光子を行くことができます。以下の同時発光任意の時点で、フォトン バースト個々 fluorophores が付いて fluorophores の近隣から時空間明確化から作成されます。光子のバーストは、ガウス関数の場合、定位精度に使用される光の波長、レンズの開口 (数 NA) に依存するいると蛍光体の位置に対応する計算された重心と合うことが励起と重大、fluorophore あたりのフォトンの数です。GSD の制限の 1 つは、fluorophores のサブセットのみをいつでも積極的に出力するので画像の数千人は、完全なローカリゼーション マップを作成するのに数分以上収集する必要があります。高レーザー電源要件と組み合わせて長い集録時間は、GSD ライブ サンプルではなく固定に適して ことを意味します。
この資料では、超解像顕微鏡イメージング膜と小胞体 (ER) のため固定サンプルの準備を記述する-(必要な消耗品や試薬を参照テーブルの材料のリスト) の居住者のタンパク質。このプロトコルことができます簡単に適応サイズと L 型電位依存性 Ca2 +チャネル (Cav1.2) 心臓 myocytes のモルモットでのクラスタ リングの程度を定量化するまたは、小胞体の細胞の分布を視覚化するために使用する方法の例示されています。分布とこれらの細胞成分の組織を理解することが開始、翻訳、および最終的に多く Ca2 +の機能を理解する上で非常に重要な-依存シグナル伝達カスケード。たとえば、Cav1.2 チャネル、興奮収縮連関、受容体を介した小胞体から Ca2 +放出はおそらく哺乳類細胞で最もユビキタス シグナル伝達カスケードの根本的に重要です。

<table><tbody><tr><td>KOH</td><td>Thermo Scientific</td><td>P250-500</td><td>To clean coverglass</td></tr><tr><td>#1.5 coverglass 18 x 18 mm</td><td>Marienfeld Superior</td><td>0107032)</td><td>細胞の増殖/処理/画像化</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>BP3994</td><td>脱イオン水で1倍に希釈</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P4832</td> ガラスラミニン<td></td></tr><tr><td></td><td>を覆う細胞接着を補助しますSigma</td><td>114956-81-9</td><td>ガラスを覆う細胞接着補助</td></tr><tr><td>剤 培地 199</td><td>Thermo Scientific</td><td>11150-059</td><td>心室筋細胞培養培地</td></tr><tr><td>DMEM 11995</td><td>Gibco</td><td>11995</td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>10437028</td><td>培地サプリメント</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>培地サプリメント</td></tr><tr><td>0.05% トリプシン-EDTA</td><td>Corning</td><td>25-052-CL</td><td>細胞培養液</td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>一過性トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>Ca2+-free PBS</td><td>Gibco</td><td>1419-144</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>100% メタノール</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A414-4</td><td>細胞固定</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15710</td><td>細胞固定</td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SLBR6504V</td><td>細胞固定</td></tr><tr><td>SEAblock</td><td>Thermo Scientific</td><td>37527</td><td>BSAまたはその他のブロッキング溶液の代替品が存在します</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>細胞を透過化する洗剤</td></tr><tr><td>ウサギ 抗CaV1.2 (FP1)</td><td>ギフト</td><td>N/A</td><td>市販の抗CaV1.2抗体は、Alomone Labs、Rb、抗CaV1.2(ACC-003)、</td></tr><tr><td>マウスモノクローナル抗RFP</td><td>、Rockland Inc.など存在します。</td><td>200-301-379</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 donket 抗ウサギ IgG (H+L)</td><td>Invitrogen (Thermo Scientific)</td><td>A31573</td><td>二次抗体</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 ヤギ抗マウス IgG (H+L)</td><td>Invitrogen (Thermo Scientific)</td><td>A11031</td><td>二次抗体</td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>サンプルの長期保存のための微生物の増殖を防止</td></tr>します <tr><td>カタラーゼ</td><td>シグマ</td><td>C40</td><td>光スイッチング緩衝成分</td></tr>グル<tr><td>コースオキシダーゼ</td><td>シグマ</td><td>G2133</td>光<td>スイッチング緩衝成分</td></tr><tr><td>トリス</td><td>シグマ</td><td>T6066</td><td>光スイッチング緩衝成分</td></tr><tr><td>ベータメルカプトエチルアミン塩酸塩</td><td>フィッシャー</td><td>BP2664100</td>光<td>スイッチング緩衝成分</td></tr><tr><td>&β;-メルカプトエタノール</td><td>シグマ</td><td>63689</td><td>フォトスイッチング緩衝液成分</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td>光スイッチング緩衝液成分</td></tr><tr><td>デキストロース</td><td>フィッシャー</td><td>D14-212</td><td>光スイッチング緩衝成分</td></tr><tr><td>Glass Depression スライド</td><td>Neolab</td><td>1 &ndash; 6293</td><td>サンプルをマウントするには</td></tr><tr><td>Twinsil</td><td>Picodent</td><td>13001000</td><td>カバーガラスをシールするには</td></tr><tr><td>sec61&beta;-mCherryプラスミド</td><td>Addgene</td><td>49155</td><td></td></tr><tr><td>Leica SR GSD 3D顕微鏡</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>洗浄ブロック溶液</td><td></td><td></td><td>20 % SEAblock in PBS</td></tr><tr><td>一次抗体インキュベーション溶液</td><td></td><td></td><td>0.5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, in PBS</td></tr><tr><td>二次抗体インキュベーション溶液</td><td></td><td></td><td>PBSの1:1000</td></tr></tbody></table>

哺乳類細胞における地上州枯渇超解像イメージング

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

強化に、蛍光顕微鏡、細胞生物学の進歩が密接に関連付けられる方法の私達の理解の劇的な飛躍につながる携帯電話のイベントを視覚化する機能細胞機能。超解像顕微鏡法の普及や開発がかなり ~ 250 20 から光学分解能の限界を拡張 nm。生物学者は、もはや回折限界領域内の共存の観点から分子間相互作用を記述する限られた、むしろそれは個々 の分子の動的な相互作用を視覚化することが可能です今。ここでは、我々 は固定細胞イメージングのための地上州枯渇顕微鏡による可視化と細胞蛋白質の定量化のプロトコルを概説します。我々 は 2 つの異なる膜タンパク質は、小胞体トランスロコン、sec61β、および細胞膜局在電位依存性 L 型 Ca2 +チャネル (CaV1.2) 要素からの例を提供します。議論は、特定の顕微鏡のパラメーター、固定方法、光スイッチング バッファーの定式化と落とし穴と画像処理の課題。

導入に記載され、多く異なる超解像顕微鏡画像診断法があります。このプロトコルは、GSD 超解像イメージングに焦点を当てください。代表的な画像とローカリゼーション マップの図 2と図 3のとおりです。
図 2は、小胞体タンパク質、mCherry-Sec61β、上記の方法を使用して処理されますをトランスフェクトした COS 7 細胞を示しています。図 2A-2B全反射モード (A) で超解像顕微鏡を使用し、GSD アクイジション ・ モード (B) を使用してを撮影した小胞体のイメージの比較を許可します。画像は、GSD モ...

この資料では、プラズマまたは哺乳類細胞における地上州枯渇 (GSD) 超解像顕微鏡法を用いた細胞膜タンパク質の検出のためのプロトコルについて説明します。ここでは、我々 は利点およびそのようなアプローチを使用して可視化と細胞蛋白質の定量化のための考慮事項について説明します。

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

この蛍光イメージング技術の全般的な目的は、基底状態枯渇顕微鏡法（ground state depletion microscopy）および個々の分子の回帰（individual molecule return）と呼ばれる超解像顕微鏡法を用いて、固定細胞内の細胞タンパク質を回折限界以下の解像度で可視化および定量化することです。この手法は回折限界による解像度の制約を回避できるため、研究者が細胞タンパク質の分布をより正確に定義、可視化、および定量化することを可能にし、細胞生物学および膜生物物理学の分野における重要な課題の解決に寄与します。本プロトコルの主な利点は、共焦点顕微鏡などの従来の蛍光顕微鏡イメージング手法と比較して、解像度を約10倍向上させた画像の取得が可能であることです。手順の実演は、私の研究室のポストドクターであるOscar Vivasと、Rose Dixonの研究室のポストドクターであるKaren Hanniganが行います。まず、付随するテキストプロトコルに従って、カバーガラスと細胞を準備してください。次に、サンプルを固定し、免疫細胞化学染色を行い、目的の細胞膜および／または細胞内膜タンパク質を標識します。次に、酸素除去用のGlock溶液を調製します。まず、1.5 mLマイクロチューブに49.5 µLのPBSを入れ、そこに12.5 µLのカタラーゼストック溶液、3.5 mgのグルコースオキシダーゼ、および0.5 µLの1 M Trisを加えます。チューブを閉め、短時間ボルテックスして成分を溶解させます。その後、溶液を3分間遠心分離します。次に、β-メルカプトエチルアミン溶液をPBSに溶解して100 millimolarの濃度にし、pHを8.0に調整して、光スイッチング誘導用thial溶液を調製します。thial溶液を分注し、フリーザーで最大1週間保存します。イメージングの直前に、thialと酸素除去成分を生理食塩緩衝液とともに混合し、溶液を氷上で保存します。調製したフォトスイッチングバッファーを100 µL使用し、染色した細胞を含むカバーガラスを凹型スライドグラスに取り付けます。次に、イメージングバッファーの急速な酸化を防ぐため、カバーガラスの縁をシリコーン接着剤で封止します。イメージングを行う前に、シリコーン接着剤が完全に硬化するまで数分間待ちます。そうしないと、カバーガラスが流れてしまいます。まず、選択した蛍光色素に基づいて、サンプルを照射する適切なレーザーを選択します。Alexa 647 蛍光色素を使用する場合は、642 nanometer のレーザーを使用してください。次に、適切なダイクロイックイメージングキューブと対物レンズを選択します。イメージングソフトウェアを起動してください。2D撮影モードを選択し、露光時間を11 milliseco

ground-state-depletion-super-resolution-imaging-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、細菌のFtsZ-リングの構造、組織、細胞分裂に不可欠な装置を検査する、超解像イメージング法を説明します。この方法は、光活​​性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）画像の定量分析に基づいており、他の細菌の細胞骨格タンパク質に適用することができます。...

細菌分裂機械の超解像イメージング

生細胞内の動的タンパク質に関する時空間的な情報は、生物学を理解するために非常に重要です。高速3D構造化照明顕微鏡(f3D-SIM)と呼ばれる超解像顕微鏡の一種は、細菌の細胞動態Zリングに関するユニークな情報、つまりそのビーズ状の外観とリング内のFtsZの急速なダイナミクスの両方を明らかにします。...

高速3D-構造化照明顕微鏡（F3D-SIM）を使用したライブ細菌における細胞質分裂のZリングの超解像イメージング

ここでは、免疫学的シナプスを形成するガラス支持脂質二重膜技術と、誘導放出枯渇(STED)顕微鏡の超解像イメージング技術の組み合わせについて説明します。このプロトコルの目標は、これら 2...

グラスサポート平面脂質二重層上のナチュラルキラー細胞免疫シナプスの超解像イメージング

PI（4,5）P 2は、様々な細胞機能を調節するが、細胞の原形質膜でのナノスケール組織はあまり理解されています。標識PI（4,5）プレクストリン相同ドメインに融合された二重色蛍光プローブとP 2によって、我々はナノメートルスケールでの原形質膜中のP 2空間分布（4,5）PIを研究するための新規な方法を記載します。...

新規蛍光プローブと形質膜におけるホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸の単分子超解像イメージング

従来のBODIPYコンジュゲートは、一過性形成、赤シフト地盤状態ダイマーの開発を通じて、生細胞単一分子局在化顕微鏡(SMLM)に使用することができます。我々は、生きている哺乳類および酵母細胞における細胞内中性脂質および脂肪酸をナノスコピック長さスケールで追跡し、解決するための最適化されたSMLMプロトコルを提示する。...

ライブセル超解像顕微鏡と単一分子トラッキングのための従来のBODIPYコンジュゲート

ここで提示される、インタクト組織における超解像ライブ細胞イメージングのためのプロトコルである。我々は、そのネイティブ組織環境で非常に敏感な成体幹細胞集団をイメージングするための条件を標準化しました。この技術は、生きた組織における生物学的現象の直接観察を可能にするために、時間的および空間的分解能のバランスを取ることを含む。...

細胞下構造の超分解能ライブ細胞イメージング

基底膜は、発生中の組織および器官の形態形成に不可欠である。この構造の適切な配置につながるメカニズムをよりよく理解するために、提示されたプロトコルは、共焦点および超解像顕微鏡法を用いて上皮細胞における基底膜タンパク質の細胞内輸送および分泌を視覚化および特徴付ける方法を記載している。...

ショウジョウバエの卵子形成期における分極細胞内輸送と基底膜タンパク質の分泌の共焦点および超解像イメージング

超解像顕微鏡は、減数分裂におけるシナプトン複合体内の成分の構成に関する詳細な洞察を提供することができます。ここでは、 カエノラブディティス・エレガンス ・シナプトン複合体の個々のタンパク質を分解するためのプロトコルを示します。...

カエノラブディティス・エレガンス生殖系列内のシナプトン複合体の超解像顕微鏡

このプロトコルは、光学光子再割り当てを備えた回転円盤共焦点顕微鏡を用いて深部全細胞単分子局在顕微鏡(SMLM)を行う手順を示しており、カスタム光学や複雑な照明を必要とせずにDNA-PAINTイメージングを可能にします。...

光学光子再割り当て を用いた回転円 板共焦点によるDNA-PAINTによる全セル超分解能イメージング

このプロトコルは、高解像度のセルラーおよびサブセルラー画像診断のための、多重アレイ検出器と統合されたレーザー走査共焦点顕微鏡システムの高度なイメージングアプリケーションおよび共有リソース管理について詳述しています。このワークフローにより、共焦点から超分解能(~120nm)までのマルチモーダルイメージングが単一のプラットフォーム内で可能となり、ナノスケールの可視化をより容易にします。...

超分解能イメージングと共有管理:多重検出を伴う共焦点顕微鏡のプロトコル

学ぶ地上州枯渇超解像イメージングを用いた哺乳類細胞の膜タンパク質可視化と定量法。従来の蛍光顕微鏡と比較して約10倍の解像度向上を実現し、細胞生物学および膜生物物理学研究におけるタンパク質分布の精密解析に貢献します。

哺乳類細胞における地上州枯渇超解像イメージング

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