警告齧歯動物で経頭蓋脳の電気的刺激

この手術手順の全体的な目的は、覚醒状態のげっ歯類において、信頼性の高い反復的な経頭蓋電気脳刺激を可能にすることです。この手法は、脳ネットワークを標的とした電気刺激によって運動機能の改善や欠損の回復を図ることで、ニューロモジュレーションおよび神経可塑性の分野における重要な疑問への回答に寄与します。本手法の主な利点は、覚醒状態のげっ歯類に対し、不快感を与えることなく、また行動測定への干渉を最小限に抑えながら、非侵襲的な電気脳刺激セッションを繰り返し実施できることです。

この手法に不慣れな方は、胸部から頭部へのトンネル作成における適切な経路の特定や、電極ソケット設置前の骨の準備に苦労することが多く、経験の浅い研究者にとってこれらの操作は困難な場合があります。電極ソケットの設置、および刺激のための電極の準備と配置に関する外科的手順は、実験の成功に不可欠であるため、本手法を視覚的に提示することが極めて重要です。博士課程候補者のStephanie Haschkaが、覚醒状態のラットにおけるNEBS手順の実施を補助します。

プレゼンター}まず、齧歯類を手術台の上に腹臥位で置きます。除菌剤に浸した綿棒で、除毛した頭皮を消毒します。そのまま自然乾燥させてください。

その後、麻酔深度を確認し、メスを用いて眼の前方レベルから耳の中央レベルまで直線的に皮膚を切開します。次に、胸部が露出するようにラットを仰臥位にし、胸部を消毒します。右胸の側面の皮膚を2本の指で伸ばし、頭側に向かって直線的に正中切開を行います。

小さなハサミを繰り返し開くことで、左大胸筋から皮膚を非外傷的に剥離し、皮下ポーチを作成します。次に、動物を右側に向けて寝かせ、開頭した皮膚の左後頭角から首に沿って大胸筋ポーチへ抜けるように、ケーブルの経路をトンネル状に作ります。この際、止血鉗子を用いて浅筋膜を貫通させます。

止血鉗子を慎重に開き、鋭利なワイヤーが飛び出さないように注意しながら、白金電極に接続された電極ケーブルの端を掴みます。電極の焼灼点がラットの左後肢に向くように向きを調整し、電極がポーチに入るまでケーブルをトンネルを通して引きます。その後、ラットを再び腹臥位に戻します。

次に、滅菌済みの合成編組非吸収性縫合糸を用い、白金プレートの対角にある2つの穴を通して胸筋筋膜に固定します。同様に、組織トンネルの入り口の手前でわずかにループを作るように緩い結び目でケーブルを筋膜に固定します。最後に、切開部位の大きさに応じて、3〜4本の皮膚縫合糸で皮膚を閉鎖します。

まず、メスを用いて頭蓋骨側面の結合組織である骨膜を掻き取り、綿棒で十分に拭き取ります。切開部の四隅の結合組織をブルドッグ鉗子で固定し、術野を確保するためにそれらを側方に広げます。次に、綿棒で0.9%生理食塩水を塗布し、骨表面と組織を洗浄します。

次に、3%Hydrogen Peroxideで骨表面を洗浄します。綿棒を使用して、露出した骨膜の残渣を除去してください。固定ネジを使用することでセメントの密着性が向上するため、ネジのサイズに適したドリルビットを選択してください。

ハンドドリルで下穴を開け、その後ボーンドリルでわずかに粒子圧をかけながら、2枚の異なる骨プレートに2つの穿孔を設けます。本ビデオに示すように電極を植え込む場合は、後にトンネルケーブルを固定するため、右後頭頂骨に3つ目の穴を開けます。穿孔部にプラスチックスクリューを配置し、最初の摩擦が感じられるまで締め付けます。

その後、ネジをさらに180度3回回します。ピンセットを使用してネジの安定性を確認し、十分に締まっていない場合はもう1回回します。電気焼灼器の電源を入れ、約5分間予熱します。

組織トンネルから出ているケーブルを後頭側から右頭頂部のスクリューに巻き付け、巻き付け部分から約1 cmの長さを残してカットします。メスを用いて、ケーブル端の絶縁被覆を慎重に取り除きます。その後、シアノアクリレート系接着剤を用いて、巻き付けたケーブルをスクリューと骨に固定します。

次に、少量の鉛フリー錫はんだをコネクタと対極ケーブルの裸線に塗布し、はんだが溶けるまで、あらかじめはんだを塗布した両方の箇所をはんだごての先端で軽く押し付けて接続します。ケーブルの過剰な金属加熱によるその後の組織損傷を避けるため、はんだごての先端はすぐに離してください。運動皮質の刺激には、直径4mmのソケットを使用します。

細い鋸歯状チップ付きピンセットで特製のtES電極ソケットを拾い上げ、ソケットの底部リムにシアノアクリレート系接着剤を薄く塗布します。ソケットの内側境界は正中縫合線で直接終わり、内側の境界はブレグマで終わるように配置してください。その後、接着剤が硬化するまでソケットを骨の上に短時間押し付けます。

ライトを使用して、ソケット領域内の骨に反射性の接着剤が付着していないことを確認します。ソケットが固定され、今後の刺激部位に接着剤がないことが確認できたら、この箇所での電流分流につながる液橋を避けるため、ソケットの外側縁を少量のシアノアクリレート接着剤で隣接組織に密閉します。その後、すべてのネジをシアノアクリレート接着剤で覆います。

次に、アクリルセメントの2つの成分を小さなシリコンチューブまたはガラス容器の中で混合します。粘性が現れたらすぐに、歯科用スパチュラを用いて、ソケットの残りの境界部分を骨に密着させて密封します。最後に、頭蓋骨全体、ネジ、対極ケーブル、およびソケットの1/3までを歯科用アクリルセメントで覆います。

すべての骨が覆われ、セメントが硬化した後、ブルドッグクランプを取り除き、皮膚を元の位置に戻します。tES電極ソケットの半分まで0.9% salineを満たし、気泡を取り除いてから開始してください。カソードtESセッションの前に、塩素化の状態を確認し、必要に応じて銀・塩化銀電極を再塩素化してください。

陽極tESセッションの前に、刺激中の良好な導電性を確保するため、以前の刺激によって蓄積した塩化銀の堆積物をサンドペーパーで除去します。その後、tES電極キャップをねじ込みます。ケーブルを頭部にある2つのコネクタに接続してください。

次に、ケージ上部のスイベルにケーブルを接続し、齧歯類を実験用ケージに入れます。これにより、動物が自由に動くことが可能になります。刺激装置の電源を入れ、刺激パラメータを調整します。最後に、刺激終了後、ケーブルを取り外し、頭部の電極キャップを緩めて外し、綿棒でソケットを清掃して乾燥させます。

形態学的変化によって評価したミクログリアの活性化は 31.8 amps per square meter で最初に認められた一方、神経変性の最初の兆候は 47.8 amps per square meter で検出された。サンプル1から4は陽性と判定された。覚醒下のラットでは、47.8 amps per square meter における fluoro-JC 陽性の変性ニューロンを含む脳切片の割合が高かったことから、麻酔が DCS に対する反応の大きさに影響を及ぼしたことが示された。

さらに、高強度における行動的または分子的な影響は、低強度の影響とはメカニズムが異なると予想されます。習得すれば、胸部電極の配置を含むこの手法は、適切に行えば40分から45分で完了できます。対極を外科的に配置しない場合は、通常10分から15分というより短い時間で済みます。

このビデオを視聴することで、さまざまなNEBSシミュレーション手法に向けた永久電極セットアップの配置方法と、覚醒状態のラットへのeTS適用方法について十分に理解できるはずです。電極が刺激前に十分に準備されていない場合、電流を用いた操作はラットに危害を及ぼす可能性があることに留意してください。本手順を実施する前には、カソード刺激前の電極の再塩素化や、アノード刺激前のデブリの除去といった予防策を必ず講じてください。