レーザーのドップラー イメージングおよび監視を使用したラット脊髄の微小循環の分析

この手順の全体的な目標は、脊髄局所血流と酸素飽和度を測定するためのレーザードップラーイメージングとモニタリングの組み合わせ、およびラットに脊髄外傷を導入するための標準化された手順を提示することです。この方法は、脊髄損傷後の血流が時間の経過とともにどのように再分配されるか、周囲領域への影響など、微小循環の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、レーザードップラーイメージングとモニタリングデバイスの両方を使用することで、血流の局所分布と一定期間の血流変動のデータを迅速に導き出すことができ、問題領域の血流をより高度に分析できることです。

まず、麻酔をかけたラットの手術面の麻酔をチェックすることから始め、つま先のつま先つまみに対する反応がないことを確認します。ラットの背側を腰から首にかけて剃ります。次に、ラットの背側を上にして摂氏40度の加熱パッドに置き、体温を一定に保ちます。

コットンボールで拭き、続いて75%アルコールで剃った部分を滅菌します。胸椎T7からT11を覆う椎弓切除部位を皮膚切開した後、T8からT10にかけて両側に付着した筋肉を切開し、棘突起、椎弓板、椎間関節を露出させます。メスを使用して、T10とT11の間の接合部を切断する切開を行います。

筋肉層を慎重に解剖して骨を露出させることにより、接合部をさらに露出させます。はさみを使用して、小さな切り傷で椎弓板から筋肉をさらに離し、椎弓根の周りで筋肉を取り除きます。これにより、T10 と T11 の椎骨の間に小さなスペースが広がります。

この隙間に止血鉗子をゆっくりと繊細に挿入し、茎を壊します。反対側で繰り返します。脊髄を露出させ、空いている骨片やギザギザの骨片を残さずに、椎弓板を慎重に持ち上げて切断します。

このプロセスを繰り返して、T9 と T8 の層をさらに除去します。インパクターは、実験グループで脳震盪損傷を誘発するために使用できるようになりました。露出した脊髄をスキャンするには、ネズミの背側を上にして黒い反射しない背景に置き、[測定]をクリックして測定グラフィカルユーザーインターフェイスに入り、[スキャナーセットアップ]ボタンをクリックしてスキャナーセットアップインターフェイスを開いて、ソフトウェアでスキャンパラメータを設定します。

この実験のように小さな領域をスキャンするには、[スキャン サイズ] と [表示] オプションをクリックし、[高解像度] を選択して、高解像度のファイン スキャン モードにします。「画像スキャン」オプションをクリックして、スキャンパラメータを確認します。をクリックしてライブビデオ画像を確認します ビデオと距離 オプション。

スキャナーを手術窓の10〜13センチメートル上に置き、動物と一緒に背景を動かして、露出した脊髄をスキャンウィンドウの中央に配置します。「Auto Distance」機能を選択してスキャン高さを微調整し、実験のすべての測定で一貫性を保つ必要があります。窓付きの無反射カバーを使用して手術部位のみを露出させ、背景をさらに最小限に抑え、動物の方向をマークします。

「リピートスキャン」をクリックしてスキャンの回数を設定し、「OK」をクリックしてリピートスキャンインターフェースを開きます。[開始]ボタンをクリックしてスキャンを開始します。全体のプロセスには約3〜4分かかります。

ここでは、VP3鈍針とデリバリープローブを備えたスキャナーモニターを使用して、血流と酸素飽和度を経時的に監視します。まず、プローブを定位固定装置に垂直に取り付けて、監視装置をセットアップします。ラットを背側を上にして定位固定装置に置き、発泡スチロールの小片で動物の下に敷き詰めて、露出した脊髄を水平にします。

切開部を検査し、綿パッドを使用して余分な液体や血液を取り除きます。装置のx軸とy軸を使用して、プローブを露出した脊髄または病変点の中心点から2ミリメートルの吻側に配置し、中心静脈を欠いています。Z軸を使用して、プローブを脊髄の表面にちょうど触れるレベルまでゆっくりと下げます。

プローブは脊髄の表面に触れるだけで、接触点の側面から明るい光が逃げるほど緩んではいけません。適切な配置は、監視プロトコルを適応および実装するために重要です。プローブは測定面に対して垂直である必要があり、過度の圧力は避ける必要があります。

データを記録するには、ソフトウェアの[新しい実験]ボタンをクリックして、セットアップインターフェイスを開きます。[General](一般)オプションで、システム構成を確認し、[Next](次へ)をクリックします。ディスプレイ設定で、血流と酸素飽和度のチャネルを選択し、[次へ]をクリックします。

入力 file 情報をクリックし、[次へ]をクリックしてデータ記録インターフェイスに入ります。緑色の三角形のボタンをクリックして、プローブからのデータの記録を開始します。信号が安定したら、8分間連続してデータを記録し、プローブを持ち上げて動物を定位固定装置から取り出します。

筋肉と皮膚を縫合した後、手術部位とケージの底部との接触を避けて、ラットを加熱パッド上の清潔なケージに横向きに置きます。麻酔から目覚めるまで動物を監視し、手術後の出血がなく、縫合糸が閉じたままであることを確認してください。これらの画像は、左側の偽グループと右側の脊髄損傷グループの脊髄のフラックスイメージングを表しています。

フラックスイメージングにより、脊髄損傷による血流の減少と震源地の血流が吻側索および尾側索よりも低いことが示されました。これらの画像は、左側の偽グループと右側のSCIグループの脊髄の吻側尾軸に沿った交互の血流を示しています。このように、脊髄損傷群の脊髄血流は、偽の群に比べて有意に減少しました。

同時に、脊髄脳震盪後の脊髄の酸素飽和度は著しく低下し、これは損傷後の血流の変化と一致していました。このビデオを見れば、レーザードップラー灌流イメージングとレーザードップラー灌流モニタリングの両方を使用して脊髄の血流を測定する方法を十分に理解できるはずです。習得すると、脊髄損傷を導入する手術は20分で行うことができ、両方のレーザードップラー器具の使用を含む測定は、適切に行われれば約20分かかります。

この手順を試みるときは、窓付きの反射しないカバーを使用して手術領域のみを露出させ、背景をさらに最小限に抑え、動物の方向をマークすることを覚えておくことが重要です。この技術は、微小循環の分野の研究者が、ファラマコダイナミクスと薬物動態の評価のために血流の変化を探求する道を開きました。